雷公藤内酯醇对狼疮性肾炎患者外周血单个核细胞TRAIL受体表达的影响

目的 检测雷公藤内酯醇对狼疮性肾炎(LN)患者外周血单个核细胞(PBMCs)凋亡及凋亡诱导配体TRAIL受体DR5、DcR1表达的影响.方法 培养LN患者PBMCs,20、20、60 μg/L的雷公藤内酯醇分别刺激细胞6、12、24 h,流式细胞仪FTTC-Annexin V联合PI染色检测细胞凋亡及TRAIL受体DR5、DcR1蛋白的表达.结果 雷公藤内酯醇以剂量依赖的形式诱导LN患者PBMCs凋亡,雷公藤内酯醇诱导PBMCs凋亡的同时伴随有TRAIL受体DR5、DcR1表达的上调.结论 雷公藤内酯醇可以通过上调TRAIL受体DR5和DcR1表达诱导PBMCs凋亡.     

肝细胞生长因子在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下对原代肝星状细胞增殖及凋亡的影响

背景:活化的肝星状细胞是肝纤维化的关键因素,研究表明肝细胞生长因子能促进星状细胞凋亡,其具体机制可能与增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导星状细胞凋亡有关。目的:观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下,肝细胞生长因子对原代肝星状细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其可能机制。方法:将SD大鼠原代肝星状细胞复苏、传代,细胞增殖明显时用于实验。实验分为4组:空白对照组为单纯肝星状细胞培养;肝细胞生长因子组:将100μg/L肝细胞生长因子作用于肝星状细胞;TRAIL组:将2mg/L的TRAIL作用于肝星状细胞;肝细胞生长因子+TRAIL组:将肝细胞生长因子预先刺激肝星状细胞24h,再加入2mg/LTRAIL。结果与结论:MTT检测显示肝细胞生长因子及TRAIL分别在50～200μg/L、0.5～1.5mg/L各浓度下对肝星状细胞增殖抑制率无影响,TRAIL在2mg/L作用下对肝星状细胞有抑制作用。流式细胞仪检测肝细胞生长因子+TRAIL组的中晚期凋亡率明显高于空白对照组及肝细胞生长因子组(P<0.05);肝细胞生长因子+TRAIL组DR5荧光强度明显高于其他3组(P<0.01)。提示在TRAIL作用下,肝细胞生长因子能促进肝星状细胞的凋亡、抑制其增殖。可能与肝细胞生长因子上调活化肝星状细胞表面DR5表达有关。     

重组变构人TRAIL联合柔红霉素对白血病细胞诱导凋亡作用及其机制的研究

为了研究重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（recombinanat mutant human TRAIL, rmhTRAIL）单用及与柔红霉素（DNR）联合应用对白血病细胞株U937、K562的诱导凋亡作用及其机制，以正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5作对照，采用MTT法检测体外培养的U937、K562白血病细胞株在rmhTRAIL单用和联合DNR作用下增殖的抑制效应；用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测DNR处理前后白血病细胞TRAIL死亡受体和诱杀受体的mRNA表达水平。结果表明：rmhTRAIL对白血病细胞株U937、K562有较明显的抑制增殖作用，DNR与TRAIL联合对抑制肿瘤细胞具有协同性，与各药单独使用比较均有显著差异（P〈0．05）；经DNR作用后，U937、K562细胞的死亡受体DR4、DR5水平上调，而两种诱杀受体DcR1、DcR2表达未受影响。结论：在体外rmhTRAIL单用或与DNR联用均能明显抑制白血病细胞增殖，rmhTRAIL与DNR对白血病细胞的杀伤有协同作用。其诱导机制可能与U937、K562细胞死亡受体DR4、DR5表达水平上调有关。     

慢性髓细胞白血病患者骨髓基质细胞与K562细胞共培养对伊马替尼耐药的影响

背景:伊马替尼耐药是慢性髓细胞白血病治疗的一个主要问题,研究证实白血病细胞可通过与骨髓基质细胞黏附而获得耐药表型,但对于黏附功能缺陷的慢性髓细胞白血病而言,骨髓基质细胞在伊马替尼耐药形成中的作用及其机制尚不清楚。目的:体外模拟慢性髓细胞白血病患者骨髓微环境,探讨其对伊马替尼敏感性的影响及可能机制。方法:分离、培养确诊但未经治疗的慢性髓细胞白血病患者骨髓基质细胞,与白血病细胞株K562细胞共培养构建慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞-K562细胞共培养模型。MTT法检测0.2-3.2μmol/L伊马替尼作用48 h对K562细胞的增殖抑制率;将K562细胞暴露于0.5μmol/L伊马替尼72 h,流式细胞术检测K562细胞凋亡率及CXCR4表达。将0.5μmol/L伊马替尼作用4 h并以Calcein-AM荧光标记的K562细胞接种于基质细胞层培养24 h,去除悬浮细胞,收集黏附的K452细胞通过检测荧光强度计算细胞黏附率。结果与结论:慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞与K562细胞共培养减弱了0.2-3.2μmol/L伊马替尼对K562细胞的增殖抑制作用;0.5μmol/L伊马替尼处理72 h,共培养组K562细胞凋亡率显著低于悬浮组(P=0.020)。悬浮组和共培养组伊马替尼作用后K562细胞CXCR4表达阳性率均显著高于作用前(P=0.001)。0.5μmol/L伊马替尼作用4 h使K562细胞与骨髓基质细胞的黏附率由(32.18±6.17)%提升至(68.97±11.08)%,差异有显著性意义(P=0.022)。结果表明慢性髓细胞白血病患者骨髓基质细胞与K562细胞共培养,能介导对伊马替尼耐药,可能与共培养及伊马替尼诱导K562细胞CXCR4的表达有关,但更多的机制还需深入研究。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL及其受体在急性髓系白血病细胞中的表达及意义

为了检测肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其受体在急性髓系白血病细胞中的表达，并探讨其在白血病治疗中的意义，采用RT-PCR方法及流式细胞术，对39例急性髓系白血病细胞(患者组)、18例完全缓解白血病细胞(缓解组)和21例正常人骨髓或外周血单个核细胞(对照组)表面TRAIL及其受体的表达进行检测。结果表明：①患者组和缓解组TRAIL、DR4和DR5表达高，而DcR1和DcR2表达低。②缓解组DR5的表达高于患者组。③患者组和缓解组DR5的表达均高于DR4。④患者组AML不同亚型表达TRAIL及其受体相似。结论：TRAIL及其受体在急性髓系白血病细胞中的表达具有明显的差异性：DR5在TRAIL介导的急性髓系白血病细胞凋亡中起重要的作用。     

多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞及KM3细胞TRAIL受体表达的研究

目的　了解多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)及骨髓瘤细胞系(KM3细胞)中4种TRAIL受体的表达情况,探讨TRAIL的选择性杀瘤机制及化疗药物对TRAIL受体的影响。方法　应用半定量RT PCR和流式细胞术检测23例MM患者、15名正常对照者BMMNC和KM3细胞中4种TRAIL受体的表达,并比较了12例MM患者化疗前后BMMNC及KM3细胞与阿霉素共孵育前后4种TRAIL受体表达的变化。结果　MM患者BMMNC死亡受体DR4、DR5的表达均高于正常对照组(P<0. 05),DR5的表达高于DR4(P<0. 05);诱捕受体DcR1、DcR2在MM组中的表达明显低于正常对照组(P<0. 05);KM3细胞死亡受体DR4、DR5强表达,未检测到诱捕受体DcR1、DcR2的表达; MM患者化疗后BMMNC及KM3细胞与阿霉素共孵育后DR5的表达均上调(P<0. 05)。结论　死亡受体DR4、DR5和诱捕受体DcR1、DcR2在MM患者BMMNC和正常人BMMNC中表达有差异,这可能是TRAIL可以选择性杀死MM细胞而对正常细胞无毒性作用的机制之一; MM患者化疗后BMMNC及KM3细胞与阿霉素共孵育后死亡受体DR5表达上调,提示化疗药物可能通过上调死亡受体DR5的表达而促使细胞凋亡。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导的细胞凋亡在再生障碍性贫血发病中的意义

目的通过检测肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导正常骨髓单个核细胞(BMMNC)凋亡率,及抑制TRAIL凋亡途径后再生障碍性贫血(AA)患者骨髓单个核细胞凋亡率,探讨TRAIL在AA患者骨髓造血细胞凋亡中的作用。方法采用流式细胞术检测43例骨髓象正常者(正常组)及TRAIL作用后(TRAIL组)其骨髓单个核细胞凋亡率;14例AA患者(AA组)及TRAIL抗体作用后(TRAIL-Ab组)其骨髓单个核细胞凋亡率。结果 (1)AA组凋亡率较正常组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)TRAIL组(浓度为30 ng/ml,作用24 h)凋亡率[(39.98±4.594)%]高于正常组[(19.90±6.656)%],差异有统计学意义(P<0.05)。(3)TRAIL-Ab组凋亡率[(30.28±4.594)%]较AA组[(51.29±7.355)%]减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论一定浓度的TRAIL可使正常骨髓单个核细胞凋亡增加,抑制TRAIL诱导的凋亡途径后,AA患者骨髓单个核细胞凋亡减少,提示TRAIL诱导的细胞凋亡,可能在AA发病中发挥一定作用。     

髓内脂肪细胞对骨髓基质细胞成骨能力及凋亡的影响

目的:观察骨髓内脂肪细胞对骨髓基质细胞成骨能力的影响,以及能否产生诱导骨髓基质细胞凋亡的作用。方法:实验于2001-07/2003-06在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成。将骨髓基质细胞以109L-1的浓度接种于培养板和培养瓶中,加入含体积分数为0.1的胎牛血清,100U/mL青霉素,100mg/L链霉素的DMEM培养基。上述细胞随机分为空白对照组、106,107,108,109L-1脂肪细胞组,分别加入0,106,107,108,109L-1不同浓度的脂肪细胞,37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,建立脂肪细胞和骨髓基质细胞共培养体系。培养时间为12d,每4d取各组细胞样本检测细胞内碱性磷酸酶活性,利用原位杂交方法检测I型胶原mRNA表达,3H-脯氨酸掺入实验检测骨髓基质细胞胶原合成能力,并以TUNEL法及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:①共培养体系建立后细胞形态学观察:细胞共培养体系建立48h后,细胞开始贴壁。72h后贴壁的骨髓基质细胞主要为短梭形,部分为多边形,并伸出突起,体积增大,具有典型的成纤维细胞特点。贴壁的脂肪细胞呈多角形或圆形,细胞透明度较好。②脂肪细胞对骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的影响:与空白对照组比较,培养第4,8,12天随着共培养体系中脂肪细胞的浓度不断上升,骨髓基质细胞内碱性磷酸酶活性均有不同程度的下降(P<0.05或P<0.01)。③脂肪细胞对骨髓基质细胞内I型胶原mRNA表达的影响:空白对照组染色最深,即表达最强,随着培养体系中脂肪细胞浓度增加,染色由深逐渐变浅,即I型胶原mRNA表达逐渐减弱。④3H-脯氨酸掺入实验结果:空白对照组第4天每分钟脉冲数值最高,随时间延长有所下降。随脂肪细胞浓度的上升,各组每分钟脉冲数值均有不同程度降低,并具有浓度及时间依赖的特征。⑤细胞凋亡TUNEL检测结果:在含有脂肪细胞的共培养体系中,被标记呈棕色的凋亡细胞,细胞核染色质浓聚成致密的斑点状,核固缩甚至碎裂。同一时间点106,107,108,109L-1脂肪细胞组凋亡细胞明显多于空白对照组(P<0.01),空白对照组中几乎没有凋亡细胞。⑥细胞凋亡流式细胞仪检测结果:各组悬浮细胞经流式细胞仪检测后,空白对照组细胞均集中于左下象限,共培养体系中均可在右下象限发现有凋亡细胞存在。结论:髓内脂肪细胞干扰了骨髓基质细胞的成骨能力,并能够诱导骨髓基质细胞的凋亡,可能与原发性骨质疏松症的发病有关。     

反义阻断α-Synuclein表达对PC12细胞凋亡的作用

目的:观察α-Synuclein表达对6-羟基多巴诱导的多巴胺能细胞凋亡的影响及分析其在帕金森病发病机制中所起的作用。方法:实验于2001-12/2004-10于中山大学第一附属医院神经科实验室完成。用100μmol/L的6-羟基多巴诱导PC12细胞凋亡。采用多组样本的完全随机设计方法,将1×105个细胞接种于4块四孔培养板中,共16个孔,随机分为4组:反义、正义、无义寡核苷酸治疗组和空白对照组。前3组分别加入相应的寡核苷酸5μmol/L治疗24h,空白对照组不加。反义寡核苷酸阻断PC12细胞α-Synuclein表达,用原位杂交和定量Westernplot检测其基因和蛋白表达;凋亡原位末端标记检测试剂盒检测6-羟基多巴诱导的PC12细胞凋亡。全自动图象分析系统测量有关平均积分吸光度。用SPSS10.0软件进行统计学分析。结果:①反义阻断后α-SynucleinmRNA表达:反义寡核苷酸治疗组较空白对照组明显减少(P<0.01),正义寡核苷酸治疗组和无义寡核苷酸治疗组与空白对照组比较无差异(P>0.05)。②α-Synuclein蛋白表达:反义寡核苷酸治疗组明显减少,较空白对照组减少约53.93%(P<0.05)。正义寡核苷酸治疗组、无义寡核苷酸治疗组和空白对照组之间差异不显著(P>0.05)。③6-羟基多巴治疗后的反义寡核苷酸治疗组、正义寡核苷酸治疗组、无义寡核苷酸治疗组和空白对照组随机计数的200个细胞中,凋亡细胞数量间相互比较无显著统计学意义(P>0.05)。结论:α-Synuclein表达减少对6-羟基多巴诱导的PC12细胞凋亡无影响。推测在帕金森病的多巴胺神经元凋亡的发生机制中,α-Synuclein在神经元内的异常聚集较其表达量的多少更重要。     

白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合对骨髓源性神经干细胞体外诱导分化的影响

目的:比较白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合条件下骨髓基质细胞分化情况,探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞及多巴胺能神经元的分化条件。方法:2005-03/09在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所进行。①实验分组:实验分为空白对照组;胶质细胞源神经营养因子 白细胞介素1α组,后者又分为10μg/L 100ng/L,10μg/L 200ng/L,20μg/L 100ng/L,20μg/L 200ng/L,1000μg/L 100ng/L组。②细胞模型制作:用全骨髓法培养骨髓基质细胞。③骨髓基质细胞以5×108L-1接种,悬浮于本实验室配制的神经干细胞培养基中。空白对照组:血清终浓度为体积分数为0.1的胎牛血清。细胞接种48h后,胶质细胞源神经营养因子 白细胞介素1α各组分别加入相应质量浓度的胶质细胞源神经营养因子 白细胞介素1α。④应用Olympus光学显微镜观察细胞抗-神经巢蛋白和D2受体阳性染色阳性细胞数目计数。结果:①加入胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α增殖培养48h可见细胞分裂相。②诱导6d,部分细胞有神经巢蛋白成分表达。③3周测出DA受体D2检测阳性,胶质细胞源神经营养因子 白细胞介素1α10μg/L 100ng/L组细胞诱导分化率显著高于10μg/L 200ng/L,20μg/L 100ng/L,20μg/L 200ng/L,1000μg/L 100ng/L组及空白对照组犤依次为:(11.70±0.55)%,(3.62±0.78)%,(4.14±0.41)%,(3.3±0.63)%,(4.92±0.34)%,(1.61±0.68)%,P<0.05或0.01犦。结论:骨髓基质细胞在体外培养条件下,经过胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α诱导分化作用,配合使用高浓度(体积分数为0.1)血清可获得巢蛋白阳性的神经前体细胞及表达D2受体阳性的多巴胺能神经元;10μg/L 100ng/L为最佳诱导分化质量浓度。