人血小板源性生长因子A基因发夹结构小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：血小板源性生长因子对诱发视网膜色素上皮细胞移行、最终导致增生性玻璃体视网膜病变起到了重要作用。构建人血小板源性生长因子A具有发夹结构小干扰RNA（shRNA）表达质粒，以观察其对人血小板源性生长因子A基因表达的沉默效果。 方法：实验于2007—04／2007—07在吉林大学第一临床医院传染科研究室完成。根据血小板源性生长因子A基因mRNA序列，设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列，克隆到空载体pGPU6／GFP／Neo中，构建重组质粒，同时设计构建分别针对人GAPDH干扰质粒作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒作为阴性对照。通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆。 结果：经重组质粒筛选，重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相同，均证实重组质粒构建成功。 结论：利用RNA干扰技术路线可成功构建靶向人血小板源性生长因子A的发夹结构小干扰RNA表达载体。     

增强型绿色荧光蛋白RNAi表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。     

人IGF-I基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选

目的 设计并筛选人IGF-I有效RNA干扰片段,构建IGF-I-siRNA慢病毒表达载体.方法 对人IGF-I基因编码区分析、筛选序列4条,阴性对照序列1条.与pGCL-GFP质粒重组后,转染大肠杆菌感受态细胞.阳性克隆经过鉴定后得到正确重组子,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T 细胞,体外直接感染表达IGF-I的人血管平滑肌细胞.通过用Realtime-PCR检验干扰效果.结果 ①成功地合成四条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pGCSIL-GFP载体中,构建重组质粒PscSI-1、2、3、4,及无关基因的重组质粒PscNC,酶切鉴定和测序证实载体构建成功;②Realtime-PCR检测IGF-I的mRNA表达,发现重组质粒PscSI-1转染人血管平滑肌细胞后IGF-I mRNA表达最低,重组质粒PscNC转染组细胞内IGF-I mRNA的表达量与空白对照的水平接近(P>0.05).结论 成功构建了小的发夹式IGF-I慢病毒表达载体.在人IGF-I序列位点1010～1028 bp、序列为ACCTTGTCTAAGTGGTTTA可以在人血管平滑肌细胞中实现对人IGF-I基因表达的有效沉默.     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景:分化型胚胎软骨基因1 可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系.目的:构建针对人分化型胚胎软骨基因1 的小干扰RNA 表达载体.方法:从NCBI 中查找人分化型胚胎软骨基因1 基因全长mRNA 序列,利用Katahdin 提供的在线小干扰 RNA 模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1 的2 条shRNA 的 DNA 模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1 基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuro.shRNA Cloning and Expression Lentivector 质粒连接,在JM-109 菌株中扩增,并进行质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR 以及测序鉴定.结果与结论:将含有分化型胚胎软骨基因1 目标序列25 bp 的双链 DNA 插入片段,连接到pGreenPuro.shRNA Cloning and Expression Lentivector 质粒形成重组质粒.质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验.菌落PCR 结果表明产物大小约为170 bp,与预期相符.测序结果表明pGreenPuro.shRNA Cloning and Expression Lentivector 质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1 的干扰合成片段,无碱基突变.成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA 表达载体.     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显.     

MMP-26基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建基质金属蛋白酶-26（MMP-26）小干扰RNA（siRNA）表达质粒,以研究其对人肿瘤细胞MMP-26基因表达的沉默效果,探索肿瘤基因治疗的新途径.方法 根据MMP-26基因mRNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pSUPERIOR.puro中,构建重组质粒,同时设计构建分别针对GFP和β-actin的干扰质粒作为阴性对照和阳性对照,并进行酶切鉴定和测序分析.结果 酶切及测序证实重组质粒构建成功.结论 利用RNA干扰（RNAi）技术可成功构建siRNA表达载体.     

靶向survivin的siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建靶向survivin的siRNA表达载体。方法 设计合成靶向Survivin的siRNA相应DNA模板单链,将其克隆入空质粒pRNAT-U6．1／Neo,模板链两端分别设计两个不同的酶切位点,退火形成siRNA载体插入片段。用限制性酶切将空载体线性化,T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中,对该重组表达载体进行鉴定,获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-sur-vivin。脂质体法将pRNAT-U6．1／Neo-survivin导入膀胱癌T24细胞株,实时定量PCR法检测对T24细胞survivin基因表达的抑制情况。结果 PCR、酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。重组载体能干扰T24细胞survivin基因的表达,并具有新霉素抗性。能够用G-418筛选稳定转化的细胞株。结论 成功构建了靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体pR-NAT-U6．1／Neo-survivin。并转染膀胱癌细胞株,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系。目的：构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。方法：从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列,利用Katahdin提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA的DNA模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接,在JM-109菌株中扩增,并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。结果与结论：将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25bp的双链DNA插入片段,连接到pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170bp,与预期相符。测序结果表明pGreenPuroTM shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段,无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰RNA表达载体。     

血管内皮生长因子C靶向RNA干扰重组载体的构建和效应检测

目的:构建针对人血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,并观察其在胃癌细胞中的干扰效果。方法:实验于2006-02/2007-02在河南省分子医学重点学科开放实验室完成。①实验材料:小干扰RNA表达载体pSilencer3.1为美国Ambion公司产品;胃癌细胞SGC7901为河南省分子医学重点学科开放实验室保存;血管内皮生长因子C基因的干扰片断和聚合酶链反应引物(152bp)由上海生工生物公司合成。②实验过程:根据pSilencer3.1-H1载体要求设计靶向血管内皮生长因子C基因的两对小干扰RNA,退火后连接入载体相应位点,构建重组表达质粒。经酶切和测序鉴定后分别转染胃癌细胞株SGC-7901,经G418筛选,获得稳定表达的细胞株。③实验评估:采用反转录-聚合酶链反应和Westernblot法检测血管内皮生长因子CmRNA和蛋白水平的表达。结果:①重组质粒的酶切、核苷酸序列分析结果:经酶切和测序鉴定证实成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,建立了稳定转染细胞株。②稳定转染的细胞株中血管内皮生长因子CmRNA和蛋白表达:反转录-聚合酶链反应和Western blot显示转染后血管内皮生长因子C表达与对照组相比有不同程度的降低,以pSilencer3.1-neo-VEGF-C1尤为明显,抑制血管内皮生长因子C表达,不影响细胞的生长。结论:成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体及稳定转染的胃癌细胞株。     

血管内皮细胞生长因子受体KDR基因靶向RNA干扰质粒的构建

目的:应用RNA干扰技术设计构建针对血管内皮细胞生长因子受体KDR的小干扰RNA,并观察脂质体转染肺癌细胞A549后的干扰效果。方法:实验于2005-03/2006-01在沈阳医学院生物化学及分子生物学教研室完成。①设计针对KDR编码区有短发夹结构的3条mRNA序列,经退火成互补双链,克隆到pGCsi.H1/neo/GFP载体中构建3个重组质粒,分别命名为KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3。②设立5组:小干扰RNA组,分别转染KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3;阳性对照组,转染pGCsi.H1/neo/siGFP,该质粒载体中的插入序列为针对绿色荧光蛋白的小干扰RNA,不干扰待研究的内源性基因;阴性对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP/NON,该载体为不干扰任何内源性基因的小干扰RNA;空白对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP空载体;正常对照组,不进行任何转染。③对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析;脂质体法转染质粒至肺癌A549细胞株后,实时定量PCR检测KDRmRNA的水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线。结果:①小干扰RNA表达载体的鉴定:KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3表达载体用限制性内切酶NdeⅠ和SmaⅠ进行单酶切后,均产生约713bp、5480bp和2403bp、3790bp两个片段,与预期结果相同。测序结果与设计的编码相应短发夹状KDR-小干扰RNA的寡核苷酸序列一致,证明KDR-小干扰RNA真核表达载体构建成功。②KDR-小干扰RNA对A549细胞中KDRmRNA水平的影响:与阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和正常对照组的A549细胞相比,KDR-siRNA1,2,3表达载体转染后的A549细胞KDR基因表达水平均明显受到抑制,抑制率分别为64%、81%和72%,其中以KDR-siRNA2抑制作用最为明显。③KDR-小干扰RNA对A549细胞生长的影响:阳性对照组、阴性对照组、空白对照组、正常对照组的A549细胞生长趋势较为一致,且生长速度均明显高于转染3种KDR-小干扰RNA表达载体的A549细胞,从接种第2天开始差异有显著性意义(t=15.29～17.65,P均<0.01)。结论:血管内皮细胞生长因子受体KDR靶向RNA干扰重组质粒构建成功,该载体能有效抑制肺癌A549细胞KDR基因表达与细胞增殖。     

抑制骨髓基质干细胞雌激素受体β基因表达的有效序列

背景:雌激素受体β是否参与介导骨髓间充质干细胞的增殖与分化需进一步实验论证。目的:以RNAi技术寻找和验证对大鼠骨髓基质干细胞雌激素受体β基因表达抑制的有效序列。方法:根据GeneBank数据库提供的SD大鼠雌激素受体β基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列。再在两条互补碱基序列的5’端分别加上BamHⅠ(GATCC)和HindⅢ(AGCTT)酶的酶切位点,最后形成两条互补的克隆入pSilencer3.1-H1载体的发夹状siRNA模板序列,进行重组载体的碱基序列测定。结果与结论:重组质粒碱基序列鉴定后,证实真核表达载构建正确。雌激素受体β特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

小鼠Qa-1基因有效shRNA干扰质粒的构建与筛选

本研究构建3个针对小鼠Qa-1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒，观察其对Qa-1基因的沉默作用，筛选出有效靶位。通过美国Ambion公司提供的siRNA web设计工具，选择3段针对Qa-1的siRNA，交由晶赛公司合成3个小发夹表达质粒，采用脂质体转染法转染NIH3T3细胞，第1、2、3组细胞分别转染3个小发夹表达质粒，第4组细胞单纯加入脂质体作为阴性对照，收集转染后24、48、72小时的细胞，用RT-PCR技术及流式细胞术对Qa—1在RNA水平的变化和细胞表面表达进行分析，筛选最有效的干扰片段。结果表明：成功构建了3个针对小鼠Qa—1的小发夹表达质粒。RT—PCR及流式细胞术检测证实，转染后3个组shRNA载体均可抑制Qa-1基因的表达，但抑制程度不一：24、48、72小时3个组细胞表面Qa-1表达减低率分别为H2-T231：60．9％，81．9％，43．6％；H2-T232为：64．5％。73．9％。61．1％；H2-T233为：61．9％，71．2％，47．5％．其中H2-T232组在3个时间点抑制作用均最明显。结论：构建的3个针对Qa-1的小发夹表达质粒均能抑制Qa-1的表达，其中H2-T232具有最有效抑制作用。     

siRNA对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制

为了探索CML的治疗新思路研究了siRNA(small interfering RNA)对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制作用。制备特异性对应bcr-abl融合基因的siRNA，转染K562细胞株，采用RT-PCR法测定bcr-abl融合基因mRNA的表达。结果表明：siRNA对bcr-abl基因表达的抑制作用随浓度的增加而增强，0.2ug siRNA能使bcr-abl融合基因mRNA的表达在24和48小时分别降低至对照组的19.9％和26.6％，但72小时时恢复到原水平，同时转染siRNA后细胞生长受到抑制。结论：siRNA可以有效的抑制K562细胞株中bcr-abl融合基因的表达。     

Adenovirus vector-mediated doxycycline-inducible RNA interference

RNA interference (RNAi) is a powerful tool for the knockdown of gene expression. Here, we report on the development of an adenovirus (Ad) vector-mediated doxycycline (Dox)-inducible small interfering RNA (siRNA) expression system. We used this siRNA system to control the expression of p53 and c-Myc in human cancer cells. Coinfection of Ad vectors containing the siRNA expression system under the control of the Dox-inducible H1 promoter and Ad vectors expressing a tetracycline repressor inhibited the expression levels of p53 and c-Myc in a dose-dependent manner with both Dox and viral dose. Regulated silencing of p53 and c-Myc expression was obtained. Because an Ad vector-mediated inducible RNAi system can efficiently transduce a variety of cell types in vitro and in vivo, and the degree of loss of gene expression can be modulated according to the dose of Dox, this expression system should be a useful tool for both basic research on the analysis of gene function and therapeutic applications of RNAi.     

Delivery of MDR1 small interfering RNA by self-complementary recombinant adeno-associated virus vector.

Small interfering RNAs (siRNAs) are potentially powerful tools for therapeutic gene regulation. DNA cassettes encoding RNA polymerase III promoter-driven hairpin siRNAs allow long-term expression of siRNA in targeted cells. A variety of viral vectors have been used to deliver such cassettes to cells. Here we report on the development and use of a self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vector for siRNA delivery into mammalian cells. We demonstrate that this modified vector efficiently delivers siRNA into multidrug-resistant human breast and oral cancer cells and suppresses MDR1 gene expression. This results in rapid, profound, and durable reduction in the expression of the P-glycoprotein multidrug transporter and a substantial reversion of the drug-resistant phenotype. This research suggests that scAAV-based vectors can be very effective agents for efficient delivery of therapeutic siRNA.     

Vectors for RNA interference

Introduction of double-stranded RNA into cells causes gene silencing in a sequence-specific manner, involving the coordinated activity of enzymes such as Dicer and RNA-induced silencing complex. Several groups have recently demonstrated that this phenomenon of RNA interference (RNAi) occurs in mammalian cells when small interfering (si)RNAs are used, and have developed vector-based siRNA expression systems that can induce RNAi in living cells. These vector systems use polymerase III promoters, such as U6 or H1, and are classified into two groups based on the form of expressed RNA, tandem or hairpin. This review describes the basis for, and methodology of siRNA expression vectors for mammalian cells.     

SOCS1-siRNA沉默SOCS1基因表达对脐血树突状细胞生物学活性的影响

目的采用RNA干扰技术抑制脐血树突状细胞(DC)SOCS1基因表达,并检测其对树突状细胞生物学活性的影响,为树突状细胞的临床应用奠定基础。方法针对SOCS1基因,采用化学合成法合成SOCS1siRNA,并转染脐血DC。RT-PCR和Western blot检测转染前后DC的SOCS1基因表达;流式细胞术检测细胞表面CD80、CD86及HLA-DR分子表达情况;ELISA法检测细胞培养上清中IL-12水平。结果与对照组相比,siRNA组SOCS1蛋白质表达水平降低,差异有统计学意义;DC表面CD80、CD86及HLA-DR分子表达上调,DC培养上清中IL-12的浓度显著提高。结论 RNA干扰技术能显著下调脐血树突状细胞SOCS1的表达,为以DC SOCS1为靶向的抗肿瘤治疗提供了新思路和新手段。     

短发夹RNA对肝癌细胞细胞间粘附分子-1基因表达的影响

目的利用小片段干扰RNA（siRNA）在肝癌细胞内诱导RNA干扰（RNAi），抑制细胞间粘附分子-1（ICAM-1）基因表达，在体外进行RNAi对肝癌治疗的实验研究。方法根据ICAM-1基因设计shRNA片断，构建pGenesil-1／ICAM-1表达载体，转入E．coli菌，并用Lipofectamine tm2000转染HepG2细胞，通过MTT方法检测细胞活性状态，应用免疫组织化学的方法检测肝癌细胞中ICAM-1基因蛋白质表达抑制情况。结果本实验已成功构建了针对ICAM-1基因的pGenesil-1／ICAM-1质粒，免疫组织化学结果显示：RNA干扰（RNAi）能特异而有效地抑制HepG2细胞中ICAM-1基因的表达。结论构建的pchlesd-1／ICAM-1重组质粒能有效抑制ICAM-1基因在肝癌细胞株HepG2中的表达和瘤细胞增殖。     

Exploring RNA interference as a therapeutic strategy for renal disease

The short synthetic interfering RNA duplexes (siRNAs) can selectively suppress gene expression in somatic mammalian cells without nonselective toxic effects of double-stranded RNA (dsRNA). However, a selective in vivo delivery of siRNA transfer has not been reported in kidney. Here, we investigated whether injection of synthetic siRNAs via renal artery followed by electroporation could be effective and therapeutic in silencing specific gene in glomerulus. We investigated the effect of siRNA in rat cultured mesangial cells (MCs) and showed that siRNA sequence-specific suppression of transgene expression was over a 1000-fold more potent than that by antisense oligodeoxynucleotide (ASODN). Transfection of siRNA targeting luciferase into rat kidneys significantly inhibited expression of a cotransfected luciferase expression vector in vivo. The delivery of siRNA targeting enhanced green fluorescent protein (EGFP) in the transgenic 'green' rat reduced endogenous EGFP expression, mainly in glomerular MCs. Furthermore, RNAi targeting against TGF-beta1 significantly suppressed TGF-beta1 mRNA and protein expression, thereby ameliorated the progression of matrix expansion in experimental glomerulonephritis. In addition, vector-based RNAi also inhibited TGF-beta1 expression in vitro and in vivo. In conclusion, siRNA-directed TGF-beta1 silencing may be of therapeutic value in the prevention and treatment of fibrotic diseases.