雪旺细胞胞浆神经营养蛋白促进周围神经再生的实验

目的 研究雪旺细胞胞头神经营养蛋白（ＳＤＮＦ）对周围神经再生的影响。方法 选用９０只成年ＳＤ大鼠,在右侧坐骨神经造成长１０ｍｍ缺损,用植入血管的变性骨骼肌桥接神经缺损。分成三组,每组３０只。分别将分子量为２６、５８ｋｕ的ＳＤＮＦ和生理盐水（对照组）于术中、术后７及１４天注入肌桥的近段、中段和远段。术后均观察６个月。术后１５天开始,每隔１５天走足印一次,测定坐骨神经功能指数。术后１、３、６个月,每组     

三步法纯化雪旺细胞源神经营养蛋白

目的探索三步法纯化及获得雪旺细胞源神经营养蛋白的方法，为获得纯化蛋白进行单克隆抗体研究奠定基础。方法收集预损伤大鼠坐骨神经２００条，用酶消化结合差速粘附法纯化并收集其中雪旺细胞，将细胞超声粉碎、离心，收集上清液超滤，再经ｓｅｐｈａｄｅｘＧ１００层析，得到两个主峰，分段收集，将其中活性部分过高效液相色谱柱。结果得到三个主峰，相对分子质量分别为６８×１０３、５４×１０３和３０×１０３，用ＭＴＴ法测定生物活性，５４×１０３蛋白生物活性最大，经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳证实基本为单一蛋白带。结论应用三步法同时各步采用合适方案是纯化雪旺细胞源神经营养蛋白的较好方法。     

雪旺细胞移植与周围神经再生

广泛阅读近年来有关人工神经方面的文献，重点了解桥接神经的移植体和雪旺细胞移植方面的研究进展。自体材料，异体材料和合成材料均可作为桥接神经缺损的神经导管，以化学萃取的同种异体神经较为理想，雪旺细胞体外纯化和培养后仍具有生物活性，用微注入法把雪旺细胞植入移植物内可促进神经轴突的再生。理想的人工神经应由有特定的三维结构的生物材料和有生物活性的雪旺细胞构成，雪旺细胞在支架内有序的分布，类似于Bungner带。     

雪旺细胞源神经营养蛋白的纯化及其体外生物活性的研究

目的：纯化和研究源于雪旺细胞质的运动神经营养因子。方法：２００条预损伤２周后的ＳＤ大白鼠坐骨神经，用酶消化结合差速粘附法纯化并收集其中的雪旺细胞；超声粉碎雪旺氏细胞，离心，收集上清液再经起滤，过高效液相分子柱，雪旺细胞上清液蛋白分为分子量分别为小于１０ＫＤ，２６ＫＤ，５０ＫＤ，７５ＫＤ，及大于２００ＫＤ五个组分，分别和胎鼠脊髓运动神经元联合培养２４小时，用ＭＴＴ法测定神经元活性。结果：２６ＫＤ，５０ＫＤ，和７５ＫＤ蛋白组分对脊髓运动神经元有维持成活的营养作用，结论：雪旺细胞可合成和分泌三种运动神经营养蛋白，分子量分别为２６ＫＤ，５０ＫＤ和７５ＫＤ。     

周围神经创伤中S-100蛋白与雪旺细胞活化关系

目的探讨周围神经创伤变性中雪旺细胞S-100蛋白的生理作用.方法将74只SD大鼠随机分为12组.1个正常空白组(8只),11个实验组(66只).每只实验组大鼠双后肢再随机分为试验肢(构成试验组)和对照肢(构成对照组).分别于术后1小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、8天、14天、21天、30天共11个时相点,切取坐骨神经中下段标本.检测各组神经纤维形态学改变,雪旺细胞S-100表达水平变化.结果试验组显示华勒氏变性,雪旺细胞数在24小时后下降,3～4天后罕见,8天开始增加,14天形成Bungner带.各组S-100普遍低水平表达.与正常空白组相比,对照组变化无统计学显著性意义(P＞0.05),试验组术后1小时、21天变化有统计学显著性意义(P＜0.05).结论在周围神经创伤变性中,S-100与雪旺细胞的应急反应、增殖重建有关,反映雪旺细胞的功能活化状态.     

感觉和运动神经源性雪旺细胞与神经元共培养神经生长因子mRNA的表达

临床上修复神经缺损使用自体神经移植体时 ,神经感觉功能恢复较运动功能好 ,这可能与移植神经取自感觉神经有关 ,这种神经特异性再生的机制目前认为有多种机制参与[1] ,而神经损伤后最初雪旺细胞是远段神经的唯一成分 ,而且雪旺细胞被证实可以分泌包括神经生长因子 (ＮＧＦ)在内的多种神经营养因子[2 ] ,因此我们以感觉和运动神经来源的雪旺细胞为研究对象 ,以ＮＧＦ为指标 ,研究两种雪旺细胞与神经元共培养后ＮＧＦｍＲＮＡ的表达是否有差异 ,探讨这种差异对神经特异性再生的作用。一、材料和方法1.雪旺细胞和神经元的体外培养 :感觉性和运…     

雪旺细胞胞浆神经营养蛋白的分离纯化和理化性质测定

目的：分离纯化雪旺细胞胞浆神经营养蛋白并测定其等电点。方法：培养收集新生１－３天ＳＤ乳鼠四肢神经雪旺细胞，超声粉碎，超速离心，取上清胞浆成份超滤浓缩，收集分子量＞１０ＫＤａ浓缩蛋白液，通过ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ离子交换层析，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤层析和Ｄｉｏｌ－１５０高压液相分子筛层析进行分离纯化，等电聚焦电泳测定纯化的活性蛋白质等电点和ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其亚基分子量。结果：成功地分离纯化出一种活性蛋白质，分子量约５８ＫＤａ，等电点４．５５，结论：联合应用超滤浓缩、离子交换层析、凝胶过滤层析和高压液相能较理想地分离纯化雪旺细胞胞浆蛋白     

神经生长因子对周围神经运动纤维再生的影响

我们通过形态学、化学发光、电生理检测、图象分析等手段观察神经生长因子对大鼠坐骨神经再生室运动纤维再生的影响，结果显示，实验组脊髓前角运动神经元的形态、坐骨神经运动纤维的量、运动神经传导速度、腓肠肌诱发动作电位峰值，轴突数、直径、髓鞘厚度均优于对照组，从而首次证实了神经生长因子能维持轴突损伤后运动神经元的存活，对运动神经再生具有促进作用。     

雪旺细胞浆神经营养蛋白高效液相分离纯化及其生物活性研究

目的　分离纯化雪旺细胞浆神经营养蛋白并研究其生物活性。方法　取 30 0只出生后 1～ 3天SD大鼠双侧坐骨神经 ,纯化培养 ,收集雪旺细胞 ,超声粉碎 ,超速离心 ,不同孔径分子筛滤膜 (PM10、30、5 0 )超滤浓缩 ,收集分子量 10～ 30 ku,30～ 5 0 ku和 >5 0 ku三种组份胞浆蛋白浓缩液 ,分别加入体外无血清培养的 E14SD胎鼠脊髓运动神经元培养液中 ,用 MTT酶标法检测证实 10～ 30 ku和 >5 0 ku两组份蛋白有神经营养活性。再通过Diol- 15 0高效液相分子层析进一步从雪旺细胞胞浆中纯化分离出分子量为 2 6 ku和 5 8ku两种胞浆蛋白 ,并对其神经生物活性进行研究。结果　 2 6 ku和 5 8ku雪旺细胞胞浆蛋白能维持体外无血清培养的脊髓运动神经元存活 ,其最佳生物活性浓度为 2 0 ng/孔。结论　雪旺细胞胞浆内含有分子量为 2 6 ku和 5 8ku的运动神经营养蛋白     

几丁质室内植入雪旺氏细胞对神经再生影响实验研究

采用生物材料几丁质制成的管道作为神经再生室，对大鼠坐骨神经缺损１２ｍｍ进行桥接。在几丁质室内植入粗品雪旺氏细胞（ｒｓｃ）和不植入ｒｓｃ，并与骨骼肌桥接进行了比较。术后４、８、１２周进行大体观察、显微解剖、神经电生理测试、辣根过氧酶（ＨＲＰ）逆行示踪、组织学检查和电镜观察。结果：植入和不植入ｒｓｃ在术后８周近端再生神经纤维均与远端纤维连接，但不植入ｒｓｃ再生神经的形态、方式和大鼠肢体功能的恢复明显优     

免疫抑制状态下的周围神经再生

目的　讨论免疫抑制下的周围神经再生。方法　较全面综述了周围神经损伤与免疫反应的关系、不同免疫抑制剂作用下的实验性神经再生结果及人类异体手移植后的临床发现。结果　免疫抑制状态下周围神经再生加快。结论　周围神经损伤后将发生免疫反应 ,从而影响神经的再生和功能恢复     

翻转静脉桥接修复周围神经缺损的实验研究

目的：探寻静脉翻转后对引导神经再生的影响，为周围神经缺损的修复提供一种新方法。方法：静脉段取出后，先将其内外翻转成一外膜在内，内膜在外的翻转静脉。然后再用此翻转静脉段桥接修复大鼠自体坐骨神经１０ｍｍ缺损（ＩＯＶＧ）并与常规静脉桥接修复方法（ＣＶＧ）进行对比研究。术后５个月，进行神经电生理及组织形态学检测。结果：与ＣＶＧ相比，ＩＯＶＧ组再生神经纤维的数目、髓鞘厚度、纤维直径以及运动神经传导速度均有提高。结论：翻转静脉桥接修复周围神经缺损是一简单而有效的新方法。     

不同时段异体神经片段皮下包埋对周围神经再生影响的实验研究

目的 探讨异体神经片段经皮下包埋不同时段后对周围神经再生的影响。方法 Wistar大鼠55只，雌雄不限，随机分为5组，A、B、C组（实验组）和D组（对照组）每组各10只，E组（供体组）15只。E组动物在出骨盆口以远5mm处切断双侧坐骨神经，向远端游离约15mm，切断作为移植物。A、B、C组动物均行左侧大腿切口，皮下钝性分离，埋入供体神经片段。术后1周（A组）、2周（B组）、3周（C组）显露右侧坐骨神经，距骨盆出口约5mm处切断，向远端游离约10mm再切断，取出对侧包埋的神经片段，修剪远近端保留长度约10mm，移植于右侧神经缺损处。D组显露右侧坐骨神经后，在距骨盆出口约5mm处切断，向远端游离约10mm后再切断，原位缝合。术后2、4、6、8、10及12周监测坐骨神经功能指数（sciatic functional index，SFI），术后12周行电生理检查测试运动神经诱发电位的传导速度及潜伏期，组织学检测移植神经再生轴突数目和面积，以及移植神经的超微结构变化。结果术后各组SFI逐渐下降，12周时A组和D组的SFI最小，两组间差异无统计学意义，但分别与B组和C组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。术后12周A组和D组再生大量有髓神经纤维及少量无髓神经纤维，再生神经的数量和结构与正常神经相似，图像分析显示两组间无明显差别，与B组和C组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。A组和D组的运动神经传导速度及潜伏期结果无差异，优于B组和C组，且差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 异体神经片断皮下包埋后有促进周围神经再生的作用，皮下包埋1周组促神经再生作用优于皮下包埋2、3周组。     

碱性成纤维细胞生长因子促神经再生的实验研究

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）对神经再生的影响。方法：用硅胶管桥接大鼠坐骨神经６ｍｍ长的缺损，管内注入生理盐水稀释的ｂＦＧＦ，对照组注入等量的生理盐水，分别于术后１、３、５周作神经电生理检查及组织形态学检查。结果：ｂＦＧＦ组运动神经传导速度、复合肌肉动作电位振幅、神经纤维密度、轴突直径、髓鞘厚度均优于对照组。结论：ｂＦＧＦ能促进神经再生。     

两步冷冻法对周围神经雪旺细胞生物活性的影响

目的探讨两步冷冻法不同冷冻温度对周围神经雪旺细胞(Schwanncell,SC)生物活性的影响。方法雌性SD大鼠80只,切取双侧坐骨神经2cm,随机分为8组,每组10只20条坐骨神经。1组为新鲜对照组,不作任何处理;另7组为实验组,采用两步冷冻法分别降温至-20、-30、-40、-50、-60、-70和-80℃,保存2h后转入液氮中(-196℃)保存48h,取出后在37℃水浴箱中快速复温1min,消化收集各组SC,经Calceim-AM荧光染色,作流式细胞仪分析,求出各组细胞平均荧光强度,再经共聚焦显微镜直接观察SC荧光强度,进一步判断SC的生物活性。结果经流式细胞仪检测各组SC荧光强度为新鲜对照组242.5220±9.5684,-20℃组168.6770±10.2070,-30℃组214.9920±8.3291,-40℃组235.5260±9.2805,-50℃组222.4340±8.5155,-60℃组217.4090±9.5157,-70℃组132.3760±13.4597,-80℃组108.1320±16.0331;-40℃组荧光强度较其它实验组强,差异有统计学意义(P<0.01)。共聚焦显微镜观察各组SC生物活性,并作荧光强度分析:新鲜对照组143.7000±5.5678,-20℃组119.7000±5.1651,-30℃组121.3000±4.3474,-40℃组139.7000±5.0122,-50℃组121.0000±4.5461,-60℃组118.4000±4.9261,-70℃组81.2000±5.1164,-80℃组79.0000±5.7164;新鲜对照组SC生物活性较各实验组强,-40℃组SC生物活性较其它实验组强,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论两步冷冻法均能较好保存SC生物活性,以-40℃组SC生物活性最好。     

雪旺细胞和生物蛋白胶构建组织工程神经的初步研究

目的研究雪旺细胞-生物蛋白胶复合物构建组织工程神经,修复周围神经缺损的效果。方法取4周龄新西兰兔瓦勒变性坐骨神经,采用组织块反复种植培养法培养雪旺细胞,分离纯化,并用S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定。收集已纯化的雪旺细胞,配制成1×10^6/ml的细胞悬液,加入生物蛋白胶制成雪旺细胞-生物蛋白胶复合物,倒置相差显微镜观察雪旺细胞生长情况。将雪旺细胞-生物蛋白胶复合物填充于硅胶管（A组）和生物膜（B组）内,构建组织工程神经,分别移植桥接修复2月龄新西兰大白兔左侧10mm胫神经缺损（n=8）;C组（n=8）作自体神经移植。术后10周,行实验动物大体观察、神经电生理检测、移植体大体解剖和组织学观察。结果所有动物均存活至实验完成。术后3～4周A组所有动物左侧足底均出现溃疡,B、C组小部分动物出现足底溃疡。10周,神经电生理检测发现A组所有神经移植体未能传导电刺激;B、C组所有移植体均能传导电刺激引起腓肠肌的动作电位,两组动作电位振幅和神经传导速度分别为4.21±0.82mV、33.40±5.40m/s和4.80±1.15mV、36.55±6.43m/s,差异均无统计学意义（P〉0.05）。A组所有神经移植体内未见神经纤维长入,两端均有神经瘤形成;B、C组无明显神经瘤形成,B组整段神经移植体内有神经纤维长入。组织学观察示B、C组再生神经的新生轴突形态无明显区别,均接近正常神经组织。结论用生物膜包裹雪旺细胞-生物蛋白胶复合物,构建组织工程神经,能够促进神经再生,其修复效果接近于自体神经移植,具有临床应用前景。     

雪旺细胞分泌神经营养蛋白的提纯

目的：寻找出提纯神经营养蛋白的实用而有效的方法。方法：收集ＳＤ乳鼠周围神经的雪旺细胞无血清条件培养液，离心，将上清液超滤浓缩（ＰＭ１０）收集分子量大于１０ＫＤａ浓缩蛋白液，经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤获得三个蛋白峰，经生物活性检测，证明洗脱Ⅱ峰液生物活性最大。将冼脱Ⅱ峰液再经ＰＭ１０超滤膜浓缩收集浓缩蛋白液，分别用ＴＨＫ２４、ＴＴＫ２４微型过滤器去除大于１００ＫＤａ和小于３０ＫＤａ蛋白，过分子筛高效液相色谱柱。结果：得到４个主要蛋白峰，前三峰蛋白分子量均超过１５０ＫＤａ，第四峰分子量为６７ＫＤａ，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和银染色法进一步证实该蛋白分子量为６７ＫＤａ，基本为单一蛋白带。结论：Ｓｅｐｈａｄｅｘ凝胶过滤、多次超滤和分子筛高效液相色谱技术综合应用是纯化雪旺细胞源神经营养蛋白较好的方法。