人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901／V …

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体，经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，并检测ｂａｘ基因在转导株的表达。方法 采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ｃｍｖ的多克隆位点之间，以脂质体倡导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，Ｇ４１８筛选克隆细胞，Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达。结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ，将之转入细胞后，经Ｇ４１８筛选３０ｄ     

庚型肝炎病毒NS5非结构蛋白在昆虫细胞中的表达

目的;研制特异的抗ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ抗体诊断试剂。方法：ＰＣＲ扩增ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ ＮＳ５基因片段并定向克隆至转座载体ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ,转化ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细胞,３７℃振荡培养４ｈ使发生转座,于三抗选择平皿筛选重组ｂａｃｍｉｄ。脂质体介导转染ｓｆ９细胞,将转染上清再次感染ｓｆ细胞,以批量表达ＮＳ５重组蛋白。利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法分析,检测重组蛋白。结果：序     

丙肝病毒非结构蛋白基因3的克隆及其体外诱导表达

目的：研究丙型病毒非结构蛋白基因３（ｎｓ３基因）在体外真核细胞中的诱导表达。方法：以ＰＣＲ方法从含ＨＣＶｎｓ３基因的重组载体ｐＢｎｓ３中扩增出ｎｓ３基因，并将其插入到克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ中，再与表达载体ｐＭＳＧ重组，以利到重组表达载体ｐＭＳＧ－ｎｓ３。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物ＣＨＯ细胞，经地塞米松（ＤＭ）诱导，采用ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技术检测ＮＳ３蛋白的表达水平。结果：     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨ＨＳＶ－ＴＫ基因介导的ＧＣＶ系统对人视网膜母细胞瘤（ＲＢ）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,筛选出逆转录病毒产生细胞ＰＡ３１７／ＴＫ,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染ＲＢ细胞,筛选出含ＴＫ基因的ＲＢ细胞（ＲＢ／ＴＫ）,用ＧＣＶ分别处理ＲＢ,ＲＢ／ＴＫ及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人ＲＢ裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因－ｎｅｏ基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５－Ｓ细胞，斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５－Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５－Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５－Ｓ细胞要作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠Ｈ     

bax加强表达对Raji细胞程序性死亡效应

目的：研究ｂａｘ过量表达对Ｂｕｒｋｉｔ淋巴瘤细胞株细胞程序性死亡的效应及其机理。方法：亚克隆构建可过量表达ｂａｘα的真核表达载体，通过脂质体转染法导入Ｒａｊｉ细胞株中。ＰＣＲ及免疫荧光定量鉴定ｂａｘα在Ｒａｊｉ细胞株中的表达；流式细胞仪检测凋亡率。结果：成功构建ｐＳＦＦＶｂａｘαＳ和ｐＳＦＦＶｂａｘαＡＳ两种质粒，转染Ｒａｊｉ细胞后，测得转染ｐＳＦＦＶｂａｘαＳ的Ｒａｊｉ细胞的ｂａｘα表达量明显高于转染空载ｐＳＦＦＶｎｅｏ质粒的Ｒａｊｉ细胞株。φ（胎牛血清）＝０．０１诱导两种Ｒａｊｉ细胞４８ｈ，Ｒａｊｉｂａｘα的凋亡率为４８．６％，Ｒａｊｉ０的凋亡率为６．４％。结论：ｂａｘα在Ｒａｊｉ细胞中的加强表达可明显促进细胞的凋亡。     

胃癌高表达基因gcys-18的部分cDNA克隆

目的：分离克隆测序胃癌高表达基因ｇｃｙｓ－１８的部分ｃＤＮＡ．方法：采用ｍＲＮＡ差异展示技术从胃癌ＧＣ７９０１与胃粘膜ＧＥＳ－１细胞株中分离出一差异表达基因片段,对其命名,并进行克隆、测序及ＧｅｎＢａｎｋ检索;以此片段作探针与细胞株总ＲＮＡ进行打点杂交．结果：从差示ＰＣＲ电泳凝胶中分离出大小为４１６ｂｐ的差异表达片段,命名为ｇｃｙｓ－１８;ＲＮＡ打点杂交证实ｇｃｙｓ－１８在ＧＣ７９０１中呈高表达,     

供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒,为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中,将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中,经Ｇ４１８筛选并扩增,以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,测病毒滴度,选择出抗性克隆,进行免疫组织化学检测,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ;免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达;抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备,该基因获得有效表达,表达产物具有明显的致丝裂活性。     

Upregulation of drug sensitivity of multidrug-resistant SGC79 01/VCR human gastric cancer cells by bax gene transduction

Objective To investigate the role of bax in a vincristine （VCR）-induced multidrug-resi stant （MDR） human gastric cancer cell line, SGC7901/VCR, in which the Bax prot ein expression level was significantly lower compared with that in parent cells .Methods A bax eukaryotic expression vector was constructed and transfected into SGC7901/ VCR cells by lipofectamine, and resistant clones were selected by G418. Western blotting detected Bax expression in transfectants. Tetrazolium blue (MTT) assa y evaluated the differences in drug sensitivity and cell cycle changes of transf ectants were analyzed using flowcytometry (FCM). Results The bax eukaryotic expression vector was constructed and transfected into SGC790 1/VCR cells. Through G418 selection, resistant clones were obtained. Western b lotting demonstrated that the expression of Bax protein was markedly increased i n bax transduced cells. These cells were more sensitive to adriamycin (ADR) and VCR than mock vector transducted cells. Moreover, bax transfection enhanced AD R-induced apoptosis and VCR-induced G(2)/M phase arrest of SGC7901/VCR cells. Conclusion Bax was involved in the MDR of SGC7901/VCR cells.     

人层粘连蛋白受体调节胃癌细胞多药耐药性的实验研究

目的：探讨相对分子质量为67000的人层粘连蛋白受体（LR）对胃癌细胞多药耐药性（MDR）的调节作用及其机制。方法：应用DNA重组技术构建LR前体蛋白（LRP）的反义RNA表达载体,并借助脂质体将其导入胃癌MDR细胞SGC7901／VCR中。用Western印迹法检测ＬＲ在胃癌细胞中的表达,ＭＴＴ法测定细胞对化疗药物的敏感性,流式细胞仪测定细胞周期以及阿霉素在细胞内的蓄积和潴留。结果：转染LRP反义RNA表达载体显著降低了LR在SGC7901／VCR细胞中的表达。转染细胞（SGC7901／VCR－anLRP)对长春新碱、阿霉素、5－氟尿嘧啶和顺铂的敏感性明显升高,细胞内蓄积和潴留的阿霉素也明显增多。细胞周期分析表明,SGC7901／VCR－anLRP细胞发生了G1期阻滞,并出现了自发性凋亡。结论：LR可能通过影响药物蓄积和细胞凋亡参与对胃癌细胞MDR的调节。     

鼠血管抑素Angiostating真核表达载体的构建及在人胃癌细胞中的表达

目的：构建鼠源性血管抑素agniostatin cDNA真核表达载体,转梁人胃癌细胞株SCG7901,检测蛋白表达,方法：采用定向克隆构建鼠源性血管抑素angiostatin cDNA真核表达载体pcDNA3.1( )-angiostatin,酶切鉴定和测序,彩用脂质体基因转染人胃癌细胞株SCG7901,G418抗性筛选,Western blot检测血管抑素的表达,结果：酶切鉴定和测序证明成功构建了基因序列正确的血管抑素直核表达载体,经G418筛选和Western blot检测得到表达血管抑素的细胞株,结论：真核表达载体pcDNA3.1( )-angilstatin转导的人胃癌细胞肥够表达血管抑素蛋白,在胃癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值。     

TRF2 siRNA抑制多药耐药胃癌细胞Rapl表达

目的应用RNA干扰技术抑制多药耐药衍生胃癌细胞系TRF2表达,观察其对Rapl表达的影响。方法根据pSilencer3．1-H1载体要求构建TRF2siRNA真核表达载体,分别转染SGC7901／ADR和SGC7901／VCR细胞,免疫荧光技术和Westernblot方法检测Rapl表达。结果成功构建TRF2 siRNA真核表达载体能显著抑制耐药细胞TRF2表达,siRNA转染细胞中Rapl表达明显降低。结论TRF2调控Rapl表达。     

朊蛋白在耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR中的过表达及其意义

目的 探讨朊蛋白(PrP)在耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR中过表达及其与胃癌多药耐药性的相关性。方法(1)利用Northern印迹和Western印迹分别从RNA 水平和蛋白质水平检测朊蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR及其亲本细胞SGC7901中的表达;(2)借助DNA重组技术构建朊蛋白基因的正反义真核表达载体;(3)通过电穿孔方法将正反义真核表达载体分别转入SGC7901和SGC7901/ADR细胞;(4)以流式细胞仪检测瞬时转染细胞中的阿霉素蓄积和潴留。结果(1)Northern印迹和Western印迹结果提示朊蛋白在SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达显著高于其在SGC7901中的表达;(2)将正反义真核表达载体转入SGC7901(命名为PS)和SGC7901/ADR(命名为PA)中,PCDNA3.1空载体转入SGC7901(命名为BS)和SGC7901/ADR(命名为BA);转染48h后检测转染细胞的平均阿霉素荧光强度,阿霉素蓄积BS为8.9±0.7,PS为6.6±0.3,BA为5.5±0.7,PA7.5±0.6,阿霉素潴留BS为8.0±0.7,PS为5.9±0.5,BA5.1±0.7,PA为7.1±0.5,PS与BS相比两组均为P<0.01,BA与BA相比均为P<0.01表达,并对胃癌细胞,具有统计学意义。结论 朊蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中高表达并对胃癌细胞的药物蓄积有影响。     

TSG101 siRNA表达载体的构建及其作用研究

目的构建TSG101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）小于扰RNA（TSG101 siRNA）的真核表达载体并鉴定，初步研究其与胃癌多药耐药的相关性。方法根据小于扰RNA的设计原则由计算机软件辅助设计TSG101的靶序列，应用DNA重组技术将目的序列克隆入小干扰RNA的表达载体；将TSG101 siRNA的真核表达载体转染胃癌长春新碱（VCR）耐药细胞SGC7901／VCR，通过Western blot鉴定TSG101 siRNA的抑制效率；以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素（ADM）的药物敏感性。结果所构建的载体经酶切后释放出预期大小的片断并经测序证实；TSG101 siRNA真核表达载体瞬时转染胃癌耐药细胞SGC7901／VCR后，发现TSG101的表达被显著抑制；细胞生长减慢，且对VCR、ADR的敏感性增加。结论成功构建了TSG101 siRNA的真核表达载体，并初步提示其参与了胃癌的多药耐药，为下一步工作奠定了基础。     

HO-1siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

目的:构建携带绿色荧光蛋白的HO-1基因siRNA表达载体,通过将载体转染入胃癌细胞株SGC7901筛选稳定转染细胞株.方法:参照前期工作,构建可用于筛选阳性克隆并带有绿色荧光的HO-1基因siRNA表达载体,采用脂质体转染法将载体转入SGC7901细胞中,并用G418进行阳性克隆筛选,获得稳定转染细胞系.结果:经酶切和测序验证,证实表达载体构建成功,将HO-1 siRNA表达载体转入SGC7901后,通过G418筛选获得稳定转染细胞系,经检测HO-1的表达水平明显低于为未转染的细胞.结论:本实验成功地构建了HO-1基因siRNA表达载体,筛选出HO-1基因沉默的稳定转染胃癌细胞系,为今后研究HO-1基因的作用机制提供了实验基础.     

Pokemon基因表达与胃癌耐药性的关系

目的 探讨okemon基因表达与胃癌细胞药敏性及耐药基因的关系.方法 取60例胃癌组织和癌旁组织石蜡标本,采用免疫组化技术检测组织中pokemon蛋白及耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、肺耐药蛋白(LRP)、生存素(survivin)的表达,并分析pokemon蛋白与其他4种蛋白的关系.采用磺酰罗丹明B(SRB)蛋白染色法检测5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)、奥沙利铂(L-OHP)对胃癌细胞株SGC7901、胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR、胃上皮细胞株GES-1的抑制作用;qPCR及蛋白质印迹法检测上述3种细胞株中pokemon和耐药基因的表达.合成针对pokemon的siRNA并转染SGC7901/ADR细胞,检测转染前后SGC7901/ADR细胞的化疗药敏性及耐药基因的变化.结果 胃癌组织中pokemon、P-gp、MRP1、LRP、survivin蛋白的阳性表达率均高于癌旁组织(P＜0.05);pokemon蛋白表达与P-gp、survivin蛋白表达间存在正相关关系(r=0.385 2,P=0.002;r=0.342 4,P=0.007).Pokemon、P-gp、MRP1、survivin蛋白在SGC7901/ADR细胞株中的表达高于细胞株SGC7901及GES-1;SGC7901/ADR细胞株的耐药性最强,SGC7901次之,GES-1最弱(P＜0.01).Pokemon-siRNA转染SGC7901/ADR细胞后细胞中pokemon mRNA的表达明显受到抑制;转染后化疗药物对细胞的抑制能力增强,P-gp、survivin表达减弱(P＜0.05).结论 Pokemon与P-gp、survivin通过相互调控而促进胃癌耐药性的形成.Pokemon可能成为胃癌靶向治疗的候选基因.     

人白细胞介素24重组蛋白对胃癌抗肿瘤机制的实验研究

目的纯化人白细胞介素24（IL-24）的原核重组表达质粒pET-21a（＋）-IL-24在大肠杆菌BL（DE3）中的表达产物rhIL-24,并初步探讨其对胃癌细胞株SGC-7901抗肿瘤的可能机制。方法采用RT-PCR法和Western blot法检测rhIL-24对胃癌细胞株SGC-7901中促凋亡因子bax表达的影响,鸡胚绒毛尿囊膜技术观察其对血管形成的影响。结果rhIL-24处理组胃癌细胞中促凋亡因子bax表达增高,rhIL-24处理组二、三级血管数目明显减少,三级血管的数目与生理盐水组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论初步表明rhIL-24能上调促凋亡因子bax表达,从而抑制血管生成,发挥对胃癌的抗肿瘤作用。