人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。     

小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.     

人神经生长因子β基因克隆及其真核表达载体的构建

神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经营养因子家族中最早被发现,也是迄今为止研究得最为清楚的细胞生长因子.研究表明,NGF能够维持神经元的生长、发育、分化、存活.此外,NGF还参与神经损伤的再生与修复,促进受损神经元的修复和再生[1].然而,NGF属生物大分子,不能通过血脑屏障,限制了其应用.基因治疗是目前解决NGF给药途径问题最有希望的方案.本研究将克隆人NGF-β基因编码序列并构建其真核表达载体,为进一步应用其开展帕金森病(Parkinson's dis-ease,PD)的基因治疗研究奠定基础.     

FHIT基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的构建人FHIT基因真核细胞表达载体.方法采用RT-PCR方法,从人新鲜甲状腺组织的总cDNA中扩增出456 bp的人FHITcDNA片段,然后用KpnⅠ和 BstX Ⅰ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用免疫细胞化学法检测FHIT基因的表达情况.结果人FHIT基因cDNA已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;体外转染MM96L细胞后,可见转染细胞胞浆中有较高量的Fhit蛋白表达.结论本实验所构建的重组质粒为FHIT基因在肿瘤发病机制与防治的研究中提供了有利的分子工具.     

HBV全基因真核细胞表达载体的构建及表达

目的：构建全基因HBV真核细胞表达载体,并对其在细胞内的复制、转录、翻译进行研究。方法：采用分子亚克隆技术,将长约3.2Kb的HBV全基因克隆到真核细胞表达载体pBK-CMV折EcoPI位点,构建的pKB-HBV经FUGENE^TM6导入人肝癌细胞系SMMC－7721细胞中。结果：经PCR、RT－PCR验证pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制和转录。固相放免法显示HBV转染细胞内的HBsAg、HBeAg的合成和分泌。免疫组化法证明,胸内浆型分布为主的HBcAg的表达。结论：HBV全基因真核细胞表达载体pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制、转录及表达。     

重组人神经生长因子β基因腺病毒的构建与鉴定

目的 构建表达人神经生长因子β基因片段的重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β。方法 以健康人白细胞中DNA为模板,扩增h NGF-β基因片段,导入p GEM-T-Easy质粒,获得重组质粒p GEM-T/h NGF-β。经酶切鉴定后与复制缺陷型腺病毒穿梭质粒p ACCMV-p Lp A构建重组腺病毒穿梭质粒p ACCMV-h NGF-β。酶切鉴定后再与辅助包装质粒PJM17共转染293细胞,经同源重组后,构建复制缺陷型重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β。对Ad CMV-h NGF-β进行基因鉴定,并测定滴度及在He La细胞中的表达。结果 顺利克隆出h NGF-β基因片段,构建的重组质粒p GEM-T/h NGF-β和重组腺病毒穿梭质粒p ACCMVh NGF-β,经酶切鉴定实际结果与理论推导符合。构建的复制缺陷型重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β滴度为1.2×1012pfu/ml,并能在He La细胞中表达。结论 以h NGF-β基因片段为基础成功构建了重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β,测试表明该重组病毒具有高滴度活性和良好的感染人类细胞、表达目的蛋白的能力。     

大鼠神经生长因子腺病毒表达载体的构建及其在星形胶质细胞中的表达

目的构建含有大鼠β-NGF基因的重组腺病毒载体并观察其在星形胶质细胞的表达,为下一步在动物体内进行中枢损伤的基因治疗提供基础.方法设计一对含有HindⅢ及Sal Ⅰ酶切位点的β-NGF基因上下游引物,PCR法扩增含有大鼠β-NGF cDNA的质粒pUC19-β-NGF,产物经HindⅢ及Sal Ⅰ双酶切,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-β-NGF,经Pme Ⅰ酶线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转入BJ5183中进行同源重组,重组子经卡那霉素抗性筛选及酶切分析,阳性克隆经293细胞包装,扩增,空斑法测定病毒滴度,转化体外培养的星形胶质细胞.通过RT-PCR、ELISA、Western blot法检测其在星形胶质细胞中的表达. 结果 PCR及酶切鉴定确认获得重组腺病毒载体pAd-β-NGF,重组腺病毒在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011 PFU/ml.病毒上清液经ELISA 检测,β-NGF表达的量为(94.50±4.58) ng/L.结论该重组腺病毒载体的构建为下一步在动物体内的表达及中枢神经系统损伤的转基因治疗提供了一定的基础.     

人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白,功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程,多水平、多通路地调节靶因子,其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系,文中构建表达人SET基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体。方法根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。该穿梭质粒经Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后与pAdTrack-CMV连接,构建含有绿色荧光蛋白（green fluorescense protein,GFP）报告基因的穿梭质粒PATC—H1-siRNA。分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒PATC—H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。Pac Ⅰ酶切线性化重组质粒pAd—H1-siRNA后,转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。根据GFP报告基因的表达观察重组病毒的产生和感染效率,用Western blot检测人SET蛋白的表达水平。结果穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功;重组腺病毒载体经AD293细胞包装后可观察到GFP表达;获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞。经Western blot检测,SET基因腺病毒载体（AdH1-SiRNA／SET）感染组与未感染腺病毒载体组（空白对照）和感染对照腺病毒载体组（AdH1-SiRNA／NS）相比,SET蛋白表达水平显著降低（P〈0．05）,抑制效率为50％～70％。结论成功构建了表达人SET基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA／SET,并在AD293细胞中验证其抑制SET蛋白表达的作用,为进一步研究SET基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。     

大鼠β神经生长因子前体基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-NGF的构建

目的克隆大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列,构建其真核表达载体pEGFP-NGF。方法采用RT-PCR方法扩增NGFβ亚基前体的全长序列,克隆入载体pMD18-T,转化大肠杆菌JM109,挑选白色菌落行酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析;利用高保真Taq酶自重组质粒pMD 18-T／NGF中扩增目的基因NGF,将目的基因与真核表达载体pEGFP-N1行双酶切,T4连接酶连接,转化大肠杆菌DH-5α,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pMD 18-T／NGF测序结果与GenBank的序列完全一致,pEGFP-NGF、行限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ酶切,可见酶切片断与插入基因长度相符。结论成功从大鼠脑组织中克隆神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列,并构建其真核表达载体pEGFP-NGF,为从分子水平开展NGF转基因相关研究奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体构建

目的获得人血管内皮生长因子（hVEGF165）cDNA,构建其真核表达载体。方法采用PCR技术,从HL60细胞中扩增出hVEGF165 cDNA,将其克隆至pcDNA3真核表达载体上,构建成为pCD-hVGEF165重组质粒。结果经酶切鉴定,克隆的基因片段为人hVGEF165 cDNA;建立了pCD-hVGEF165重组质粒。结论成功地克隆和表达出了人VEGF165基因,为大量制备重组质粒的研究奠定了基础。     

Survivin基因真核表达载体的构建及鉴定

  目地 构建pcDNA3.1-Survivin基因的真核表达载体并鉴定。方法 提取大鼠肝细胞总RNA,RT-PCR 法扩增Survivin cDNA 片段, 双酶切构建pcDNA3.1-Survivin, 重组载体。结果 重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-Survivin。     

表达反义N-myc逆转录病毒载体对神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响

目的研究反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染后人神经母细胞瘤细胞在神经生长因子处理后的诱导分化情况,探讨Ｎ－ｍｙｃ在神经生长因子诱导分化中的意义。方法用基因重组技术构建表达反义Ｎ－ｍｙｃ的逆转录病毒载体。用ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＲｅａｇｅｎｔ等多种基因转染方法,转染已经基因转染恢复了神经生长因子受体表达的人神经母细胞瘤系,建成表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系。用神经生长因子处理转化细胞系,观察ＮＧＦ是否能诱导分化。同时用ＴＵＮＥＬ原位凋亡检测技术及超微结构技术研究表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系凋亡的情况。结果表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系经单链ＲＮＡ探针杂交,证实其Ｎ－ｍｙｃ的表达明显降低。用神经生长因子处理这些转化细胞系,细胞出现明显的形态学分化。ＴＵＮＥＬ技术及超微结构研究表明,经反义Ｎ－ｍｙｃ转染的细胞系细胞凋亡增多。结论反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能有效抑制Ｎ－ｍｙｃ的表达,进而促进神经生长因子诱导人神经母细胞瘤细胞的分化。反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能使神经母细胞瘤细胞凋亡增多。     

KiSS-1基因重组真核质粒的构建、鉴定及其表达

目的构建KiSS-1基因重组真核质粒,将其导入人高转移肝癌MHCC97-H细胞中,获得瞬时表达的细胞株,为进一步研究KISS-1基因对人肝癌细胞侵袭转移的影响奠定基础。方法Trizol试剂法提取新鲜胎盘组织总RNA,经RT—PCR扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接．并转化人大肠杆菌Ecoli．Dh5α扩增以获得重组载体,采用脂质体介导转染技术将高纯度的KiSS-1质粒转染到人高转移肝癌细胞株中,用RT—PCR和Westernblot技术加以鉴定。结果RT—PCR获得预期大小的特异性DNA片段,经PCR、双酶切鉴定及测序,证实已将KISS-1基因eDNA片段正确插入真核表达载体中;RT-PCR、免疫细胞化学和Westernblot证实KiSS-1基因已转染入MHCC97-H细胞中。结论成功获得pcDNA3．1／HisC／KiSS-1重组质粒和瞬时表达KiSS-1基因的肝癌细胞,为后续建立稳定转染的KiSS-1高表达阳性细胞克隆奠定基础,为体内外实验研究KiSS-1对人肝癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响提供前提条件。     

VEGF165-tPA双基因真核表达载体的构建和体外表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到真核表达载体pIRES质粒中,体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达。结果成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,测序结果与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞的转染效率约为(15.6±3.1)%;实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-VEGF165-tPA质粒组细胞在mRNA和蛋白水平的表达均高于各对照组(均P<0.01)。结论成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,并且实现其在人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞中的表达,为进一步探索其在机械瓣膜抗凝方面的作用奠定了基础。     

绿色荧光蛋白基因gfp真核表达载体pcT K GFP的构建

目的：构建携带绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ） 的真核表达载体ｐｃＴＫＧＦＰ,为利用绿色荧光蛋白标记在实验动物体内进行自杀性基因治疗的研究和转基因动物打靶载体的构建提供基因材料。方法：采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＥＧＰＣ１ 中扩增出ｇｆｐ（７９９ ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＸｂａⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＴＫ,重组质粒ｐｃＴＫＧＦＰ用限制性内切酶和ＤＮＡ序列分析进行鉴定。结果：部分ＤＮＡ 序列分析证明ＰＣＲ产物为ｇｆｐ,成功筛选到携带ｇｆｐ 的真核表达载体ｐｃＴＫＧＦＰ。结论：ｐｃＴＫＧＦＰ真核表达载体的构建,为利用绿色荧光蛋白标记在实验动物体内进行自杀性基因治疗的研究和转基因动物打靶载体的构建奠定了基础。     

肺组织特异性基因HIMF的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆小鼠肺组织特异性表达基因缺氧诱导丝裂原因子(hypoxia-induced itogenic factor,HIMF),并构建其真核表达载体.方法 采用 Western blot 法检测 HIMF 基因在小鼠不同脏器中的表达;从小鼠肺组织中提取总RNA,采用 RT-PCR 法扩增全长 HIMF cDNA ,克隆至 T 载体后进行核酸序列分析,并将其正向插入到真核表达载体pcDNA3.1/Zeo( )的限制性内切酶位点 EcoR Ⅰ ;重组子在阳离子脂质体 Lipofectamine 2000 的介导下瞬时转染胚胎纤维母细胞 NIH/3T3、肺Ⅱ型上皮细胞 MLE-12、血管内皮细胞 SVEC4-10,用 Western blot 及 RT-PCR 法检测细胞HIMF表达水平.结果 HIMF特异性表达于小鼠肺组织,而其他脏器未见表达.成功克隆了小鼠 HIMF 全长 cDNA(336 bp),与 GenBank 报道的序列一致.真核表达载体 pcDNA3.1-HIMF 转染细胞后,细胞内 HIMF mRNA 和蛋白水平均显著增高(P<0.01).结论 从小鼠肺组织中克隆出 HIMF 这一组织特异性基因,为深入研究 HIMF 的生物学功能及其在肺部疾病靶向性生物治疗中的作用奠定了基础.     

牛pcDNA3-bFGF真核表达重组体的构建与鉴定

【目的】构建并鉴定牛碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)基因真核表达质粒。【方法】设计含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的bFGFcDNA引物 ,采用PCR法从原核pET3c bFGF中扩增bFGFcDNA片段 ,纯化PCR产物 ,EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并连接至 pcDNA3 ,转化感受态大肠杆菌DH5α ,酶切鉴定阳性重组子 ,并进行序列测定。【结果】经PCR能扩增出 4 83bp的片段 ,与预期片段大小相符 ,构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段 ,测序结果与预期序列完全一致。【结论】成功构建了牛bFGF真核表达重组体bFGF pcDNA3 。