叶酰聚谷氨酸合成酶基因在甲氨蝶呤对映体获得性耐药A549细胞株中的表达差异

目的 研究不同甲氨蝶呤(MTX)对映体耐药与叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)基因水平表达的关系.方法 用大剂量冲击递增结合低剂量持续诱导法诱导获得两组含不同构型15～55μmol/L浓度的MTX对映体[L-(+)-MTX和D-(-)-MTX]耐药的细胞系,细胞为人源非小细胞性肺癌A549细胞,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各细胞系的耐药指数;用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)方法检测这两组各细胞系中胞质型FPGS(cFPGS)和线粒体型FPGS(mFPGS)基因的相对含量.结果 D-(-)-MTX耐药细胞组耐药指数高于L-(+)-MTX耐药细胞组(32.7±9.3比11.5±2.9,P＜0.05),L-(+)-MTX/A549细胞系耐药指数均在5～15之间,为中度耐药,而D-(-)-MTX/A549细胞系耐药指数均＞15,为高度耐药.在D-(-)-MTX和L-(+)-MTX两组耐药细胞系中,mFPGS表达水平仪在MTX为15 μmol/L时差异无统计学意义,在MTX其他各浓度点两组间差异均有统计学意义(25 μmol/L:2.3±0.9比1.3±0.7,35 μnol/L:2.6±0.3比1.1±0.9,45 μmol/L:1.4±0.8比1.0±1.0,55 μmol/L;1.0±0.2比0.2±0.1均P＜0.05);cFPGS表达水平在MTX为15μmol/L时两组间差异也同样无统计学意义,在25～55 μmol/L浓度区间内D-(-)-MTX/A549细胞系的cFPGS表达与耐药指数呈现高度负相关(r=-0.95,P＜0.05).结论 在A549细胞中MTX对映体初次剂量15 μmol/L冲击法诱导获得的对映体耐药与再次接受更大剂量(≥25 μmol/L)MTX诱导获得耐药的机制不同,D-(-)-MTX/A549耐药细胞系表现为更高的耐药性,提示临床使用MTX时应考虑该药物存在手性对映体问题.

Abstract：

Objective To investigate the relationship between the resistance of methotrexate (MTX) enantiomer and the gene expression levels of folylpolyglutamate synthetase (FPGS).Methods The cell lines of MTX enantiomer resistance from 15 -55 μmol/L were obtained when the A549 cell lines were exposed intermittently and progressively to an incremental dose of each MTX enantiomer.The resistant index of MTX resistance cell lines were detected by MTT.The gene expressions of FPGS in cytoplasm and mitochondria were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR).Results The resistance indice of D-( - )-MTX resistant cell lines were higher than those of L-( + )-MTX resistant cells (32.7±9.3 vs 11.5 ±2.9,P ＜0.05).The resistant indice of L-( + )-MTX /A549 were from 5 to 15,which mean the middle resistance.The resistant indice of D-( - )-MTX/A549 were more than 15,which mean the severe resistance.The expression of mFPGS had difference between resistant cell lines of L-( + )and D-( - )-MTX except at 15 μmol/L MTX (at 25 μmol/L,1.3 ±0.7 vs.2.3 ±0.9;at 35 μmol/L,1.1 ±0.9 vs.2.6±0.3;at 45 μmol/L,1.0±1.0 vs.1.4±0.8;at 55 μmol/L,0.2±0.1 vs.1.0±0.2;all P＜0.05).The expressions of cFPGS had no difference between resistant cell lines of L-( + ) and D-( - )-MTX at 15 μmol/L MTX,while at 25 -55 μmol/L,the cFPGS levels and resistance indice of D-( - )-MTX/A549 resistant cell lines showed a highly negative correlation ( r = - 0.95,P＜0.05 ).Conclusion There may be a different mechanism between the first time treatment with 15 μmol/L dosage and the continual treatment with more than 25 μmol/L dosage in A549 cell lines.There had higher resistant index in D-( - )-MTX/A549 cell line than in L-( + )-MTX/A549 cell line.The results indicated that the difference in chirality should be considered in clinical treatment with MTX.     

人绒毛膜癌甲氨蝶呤耐药细胞株的建立及其特性的研究

目的:建立耐甲氨蝶呤(MTX)的人绒毛膜癌细胞株,并检测其生物学特性.方法:采用剂量递增间歇诱导的方法,对人绒毛膜癌细胞株JAR进行长期诱导培养,建立耐药细胞株JAR/MTX.比较两种细胞倍增时间、绒毛膜促性腺激素(HCG)分泌量、对MTX和一些常用化疗药的敏感性,P-糖蛋白、谷胱甘肽S转移酶、核增殖抗原的表达,以及细胞自发和MTX诱导调亡率.结果:历时1年建成JAR/MTX细胞株,耐药性稳定,耐药指数7.3,对紫杉醇、长春新碱有交叉耐药.JAR/MTX细胞增殖缓慢,核增殖抗原表达低于JAR细胞(3.09±0.42 vs 3.72 ± 0.35, P<0.05).谷胱甘肽S转移酶表达高于JAR, P-糖蛋白的表达两者无差异.HCG分泌高于JAR细胞,培养48 h后每105个细胞分泌HCG分别为(95.7±5.4 vs 41.3±2.8)mIU(P＜0.01).JAR/MTX细胞的自发凋亡及MTX诱导的凋亡均明显少于其母系JAR细胞(P<0.05).结论:JAR/MTX细胞对MTX耐药性稳定,具有独特的细胞形态、染色体核型、增殖与凋亡等特征,为进一步研究绒癌的耐药机制提供了理想的细胞模型.     

体外诱导成人外周血干细胞向血管内皮细胞分化

目的研究人外周血干细胞(PBSC)向血管内皮细胞分化。方法以血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对经重组人粒细胞集落刺激因子刺激后采集的PBSC进行诱导培养,观察细胞形态的变化,运用流式细胞术检测诱导后的细胞表达CD31和vWF情况,并用透射电镜观察细胞的超微结构。结果经VEGF和bF-GF诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,透射电镜细胞胞浆内可见特征性Weible-Palade小体。结论外周血干细胞在VEGF和bFGF诱导下,可分化为内皮细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的研究

骨髓间充质干细胞(MSCs)主要存在于骨髓中,在脐血、外周血、脂肪、皮肤等多种组织中也相继分离出MSCs。MSCs具有多向分化的能力,在一定条件下可分化为各种不同来源的细胞。目前,MSCs的分离培养、诱导分化及鉴定体系已趋成熟,其在临床应用的前景广阔。血管内皮细胞(VECs)来源于中胚层,因此MSCs具有分化为VECs的可能性。     

对映体的毛细管电泳分离

介绍了对映体药物的毛细管电泳分离方法的研究近况。对于光学异构体的分离,有直接拆分和间接拆分,色谱技术已早被人们所采用,而毛细管电泳法问世不久。本文对直接拆分的四种模式：主客体络合、配体交换络合、手性胶束包合及蛋白质亲合等研究原理和进展进行了讨论;毛细管电泳间接拆分实为柱前衍生化,其关键在于衍生化试剂的选择,而在ＭＥＣＣ中应用的试剂早已被ＨＰＬＣ法中广为采用,故可被参考。毛细管电泳手性拆分尚有许多未     

普萘洛尔对映体的研究进展

本文讨论了普萘洛尔的合成,以及普萘洛尔对映体的拆分和临床应用,并对普萘洛尔的进一步研究进行探讨,以便对普萘洛尔的学习提供进一步参考。     

手性药物对映体的药动学与药效学立体选择性差异研究进展

手性药物对映体的立体选择性差异研究，标志着药物的开发与临床评价已进入分子异构体水平。药物分子空间排列上的微小改变，可导致与生物大分子 亲和力的明显差异，因而药物的对映体间有着不同的药铲，以及吸收、分布、代谢和排泄的明显差异。这种立体选择性差异对于药物的开发及临床评价具有重要意义。     

普萘洛尔对映体对点燃的作用及机制

目的 研究普萘洛尔对映体对点燃的作用及机制.方法 建立大鼠杏仁核电刺激点燃和戊四唑（PTZ）化学性点燃模型,并建立耗竭GABA诱发的小鼠氨基脲惊厥模型,观察普萘洛尔对映体对点燃和惊厥的影响.结果 左旋体普萘洛尔腹腔注射有抗PTZ点燃作用,降低Ono＇s分级和6级发作百分率（P〈0.01）,在杏仁核点燃模型能降低Racine分级和发作百分率（P〈0.01）,在氨基脲诱发的惊厥模型,左旋体可抑制惊厥（P〈0.01）;右旋体普萘洛尔无抗点燃和惊厥作用.结论 左旋体普萘洛尔有抗点燃作用,其可能通过阻断β-受体抑制点燃发作.     

诱导分化药物对肺癌细胞肿瘤相关基因的影响

目的 通过观察诱导分化浓度的全反式维甲酸、亚硒酸钠、三氧化二砷对肺腺癌细胞A549的肿瘤相关基因的影响,探讨诱导分化药物对肺癌细胞的作用机制.方法 体外培养肺癌A549细胞,设全反式维甲酸、亚硒酸钠和三氧化二砷处理组及对照组,药物处理24 h后以Westem Blot和Rt-PCR检测基因caspase3、p21、RARα、bcl-2、cyclinD3和nm23的表达.结果 caspase3、RARα和nm23在亚硒酸钠、三氧化二砷组中表达上调;p21在全反式维甲酸、三氧化二砷组中表达上调.bcl-2和cyclinD3在3个处理组中表达下调.结论 全反式维甲酸、亚硒酸钠和三氧化二砷能引起A549肿瘤相关基因表达的改变,诱导分化药物对肺癌的作用机制表现为增殖抑制、促进凋亡、周期阻滞、转移抑制、诱导分化敏感度增加等多方面的改变.     

细胞间粘附在肺腺癌细胞株A549群集耐药中作用探讨

目的检测肺腺癌细胞株A549单层培养与三维培养时对阿霉素(adriamycin, ADM)药物敏感性的差异,并探讨细胞间粘附在肺腺癌群集耐药(multicellular drug resistance)中可能的作用机制.方法以多细胞球(multicellular spheroids,MCSs)为模型,比较MCSs与单层细胞(monolayer cells, MCs)对ADM药物敏感性的差异.透射电镜观察细胞超微结构.间接免疫荧光法流式细胞术检测Bcl-2,Bcl-xL,Bax的表达.结果 MCSs由多层细胞组成,细胞间粘附广泛而紧密;可见镶嵌连接.与MCs相比,MCSs的药物敏感性显著减弱.MCSs的Bcl-2,Bcl-xL表达量显著高于MCs,ADM处理后表达显著升高.结论 MCSs能够较好地模拟体内实体瘤的细胞间粘附,具有群集耐药性;其机制可能与Bcl-xL,Bcl-2高表达相关.     

核糖体蛋白L39-L在肺癌1549细胞耐药机制中的作用

目的探讨核糖体蛋白L39-L在肺癌A549细胞对阿霉素类药物耐药机制中的作用。方法以体外培养的阿霉素耐药和敏感人肺癌A549细胞株，啊z01法提取总RNA，LightCyclerRNA扩增法进行荧光定量RT-PCR，检测阿霉素耐药A549细胞株、敏感细胞株之间的RPL39--L基因表达差异。经对人肺癌A549敏感细胞株体外培养、稳定转染RPL39-L基因后，3H—TdR掺人法进行生存率检测分析核糖体蛋白L39-L转染A549细胞、载体转染A549细胞和空细胞株对阿霉素的耐药性差异。结果荧光定量RT-PCR结果显示，耐药性人肺癌A549细胞株比敏感的A549细胞核糖体蛋白L39-L转录水平高7．3倍。1H1TdR掺入测定生存率显示，与质粒载体转染细胞或空细胞相比，转染核糖体蛋白L39-L的细胞表现出增强的阿霉素耐药性。结论核糖体蛋白L39-L基因可育旨在肺癌A549细胞的耐药机制形成机制中有作用。     

阿奇霉素对人肺腺癌多药耐药细胞株A549/ADM的耐药逆转研究

目的研究阿奇霉素（AZM）对人肺腺癌多药耐药细胞株A549／阿霉素（ADM）的耐药逆转作用。方法使用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同浓度AZM对细胞株A549／ADM的抑制率，确定其非细胞毒性浓度。用MTT法分别检测ADM、顺铂（DDP）、长春新碱（VCR）、氨甲蝶呤（MTX）对细胞株A549、A549／ADM以及使用AZM处理后的A549／ADM的半数抑制浓度（IC50）。使用流式细胞仪检测A549以及加入AZM前后的A549／ADM内ADM的荧光强度。结果≤10mg／L的AZM对A549／ADM无明显细胞毒作用。A549／ADM对ADM、VCR、DDP、MTX均有不同程度的耐药。使用5mg／LAZM处理后，A549／ADM对上述4种药物的敏感度均有不同程度的提高。AZM的浓度提高至10mg／L时，A549／ADM对上述药物的敏感程度提高更明显。A549／ADM经AZM处理后细胞内ADM荧光强度明显提高。结论AZM可以部分逆转A549／ADM的耐药，其逆转效果与剂量相关。     

肉桂酸对A549细胞分化及端粒酶活性的影响

目的：探讨肉桂酸对人肺腺癌A549细胞诱导分化及对端粒酶活性的影响。方法：应用1mmol／L，3mmol／L肉桂酸(CINN)分别处理A549细胞，并设空白对照，观察体外细胞增殖情况，细胞分裂指数，流式细胞仪测定细胞周期，以TRAP-银染技术的非放射性方法检测端粒酶活性。结果：CINN作用后的A549细胞，细胞增殖明显受到抑制；细胞分裂指数减少；细胞周期出现向G1／G0期移行的特征性动力学改变；相应的端粒酶活性下降，甚至活性丧失。结论：肉桂酸能诱导A549细胞的分化和降低端粒酶活性。     

ATRA诱导肺癌细胞株A549分化与凋亡

目的:体外研究维甲类化合物的衍生物ATRA对A549肺癌细胞株作用,探讨ATRA对肿瘤防治作用的可能机制。方法:取对数生长期的常规培养的肺癌A549细胞用于试验,试验分1×10-5mol/L,1×10-6mol/L,1×10-7mol/L三组药物浓度和对照及空白对照5组,加药48h进行MTT测定,第6 d对1×10-5mol/L,1×10-6mol/L及对照组细胞进行流式细胞检测,并对1×10-5mol/L,1×10-6mol/L浓度进行电镜观察。结果:不同浓度ATRA对细胞增殖有明显地抑制作用,与阴性对照组比较,有统计学意义(P<0.01)。增殖抑制有良好剂量效应关系,(r=0.968),细胞阻滞于G0/G1期,高浓度组电镜下见凋亡细胞。结论:ATRA可诱导A549细胞分化及凋亡,为临床应用ATRA化学预防肺癌提供理论依据。     

Curcumin co-treatment ameliorates resistance to gefitinib in drug-resistant NCI-H1975 lung cancer cells

Objective

To examine whether a combinative treatment with curcumin enhances the effects of the epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) gefitinib on cell proliferation, clonogenic capacity and apoptosis in the drug-resistant lung cancer cell line NCI-H1975, and further investigate the molecular mechanisms involved.

优化的MTT比色法在肝癌天然耐药预测中的应用

目的探讨优化的噻唑蓝（MTT）比色分析法在预测肝癌天然耐药中的作用。方法改良的MTT比色分析法检测30例未经化疗肝癌标本的药物敏感性,相应癌组织石蜡标本构建组织芯片。免疫组化检测P-gp、MRP3、LRP、GST-π、p16^INK4a和p21^WAF1的表达。结果30例肝癌中耐药者16例（53．3％）,敏感者14例（46．7％）。P—gp在耐药组癌组织中的强阳性表达率（56．3％）明显高于敏感组（14．3％,P〈0．05）。结论优化的MTT方法更为科学。肝癌普遍存在天然耐药性,P—gp可以作为肝癌天然耐药的预测指标。     

SIRT3/FOXO3通路在肺癌A549细胞放疗抵抗中的作用机制研究

目的 探讨沉默信息调节因子3(SIRT3)/叉头转录因子O3(FOXO3)通路在肺癌A549细胞放疗抵抗中的作用.方法 体外培养肺癌A549细胞,设置对照组(A549细胞)、放疗组(A549细胞+X射线照射)、SIRT3抑制剂(3-TYP)组(A549细胞+50μmol/L 3-TYP)、X射线+3-TYP组(A549...