人羊膜间充质干细胞分离培养及鉴定

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的多能干细胞,具有高度自我更新能力和多向分化潜能〔1-2〕。目前研究最多的是骨髓MSCs,但其必须通过有创伤性的途径获得,而且随着时间的延长,干细胞数量明显减少〔3〕。因此,寻找更易获得、含量丰富且易于培养的MSCs来源,对MSCs的实验研究具有重要意义。本研究从人羊膜组织中分离纯化MSCs,为人羊膜间充质干细胞(AMSCs)的进一步研究及临床应用提供基础。     

人羊膜间充质干细胞改善高龄小鼠睾丸功能的实验研究

目的: 探讨人羊膜间充质干细胞（hAMSC）改善高龄雄性小鼠睾丸功能的作用。方法: 以36周龄雄性小鼠为高龄模型组,10周龄小鼠为年轻对照组。31只高龄模型组小鼠随机分为5组,分别为生理盐水对照组、1%人血清白蛋白对照组和治疗组,其中生理盐水对照组3只,其余各组每组7只。治疗组小鼠尾静脉注射hAMSC,剂量分别为3.4×10⁶细胞/kg（低剂量组）、6.7×10⁶细胞/kg（中剂量组）、1.4×10⁷细胞/kg（高剂量组）。每周注射1次,治疗4次后小鼠继续饲养,5周后取血检测小鼠血清睾酮水平;行附睾内精子的分析;免疫荧光检测睾丸组织内STEM121和CD105的表达和定位,观察睾丸组织病理学改变,检测类固醇激素生成急性调节蛋白（StAR）、17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）的表达水平。结果: 与年轻雄鼠比较,治疗前高龄雄鼠体质量增加、睾丸体质比下降、睾周脂肪质量增加（均P<0.01）,血清睾酮水平下降（P<0.05）,精子活动率降低、正常形态精子率下降（均P<0.05）。治疗前高龄雄鼠的精子计数、睾丸组织StAR和17β-HSD蛋白表达水平与年轻雄鼠比较差异无统计学意义（均P>0.05）。hAMSC治疗后,睾丸间质区可见STEM121和CD105表达的细胞;高剂量组血清睾酮水平升高（P<0.05）;睾丸组织StAR蛋白表达无显著差异（P>0.05）,但高剂量组17β-HSD蛋白表达上调（P<0.05）。中剂量组和高剂量组睾丸组织的生精小管细胞层数较人血清白蛋白对照组增多（P<0.05）。结论: 初步实验结果表明,hAMSC对睾丸衰老具有保护作用,并促进雄激素合成。     

醋酸铅对体外培养未成年小鼠骨髓间充质干细胞生长的影响

目的:探讨醋酸铅对体外培养未成年小鼠骨髓间充质干细胞生长的影响,为进一步阐明铅骨髓毒性作用机制,采取相应防治措施提高儿童健康水平提供依据。方法:不同浓度醋酸铅作用于体外培养的骨髓间充质干细胞,观察其对间充质干细胞成集落(CFU-F)数的影响及变化规律。结果:醋酸铅可明显抑制CFU-F的生长,各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),且随浓度增加抑制作用增强,呈明显的剂量-效应关系(r=-0.960,P=0.000),其中CFU-F集落的IC50=80.00μmol/L。结论:醋酸铅可明显抑制体外培养的骨髓间充质干细胞生长。     

人脐血间充质干细胞的临床应用

数据库和中国期刊全文数据库文献,就目前脐血间充质干细胞的临床应用进行综述。脐血间充质干细胞目前已可稳定地在体外分离,且扩增迅速,由于其具有低免疫原性、支持造血及多向分化潜能的特点,在多项临床治疗以及临床前医学研究中发挥重要作用,其中包括:脑梗死、肝硬化、心肌梗死等等。随着细胞工程、再生医学的发展,相信脐血间充质干细胞将会有更为广阔的应用空间。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性的研究

目的 建立体外分离培养人骨髓间充质干细胞(Human Bone-marrow Mesenchymal Stem Cells,hBMSCs)方法,并就hBMSCs表型鉴定、细胞周期、生长曲线等生物学特性进行初步研究. 方法采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs,流式细胞仪检测hBMSCs表型鉴定、细胞周期、绘制hBMSCs生长曲线. 结果密度梯度离心法能分离出纯度较高的hBMSCs;流式细胞仪检测hBMSCs CD105、CD13阳性,CD34、CD45、HLA-DR表达阴性;hBMSCs的生长曲线呈S型;hBMSCs细胞生长周期提示大部分细胞处于相对不活跃的静止期. 结论采用密度梯度离心法体外分离培养骨髓可获得纯度较高的hBMSCs,hBMSCs具有独特的生物学特征.     

人脐带源间充质干细胞移植对肝纤维化大鼠氧化应激的影响

目的 研究人脐带源间充质干细胞(hUC-MSCs)移植对大鼠肝纤维化的治疗作用及对氧化应激的影响.方法 Wistar大鼠60只,分为正常对照组和模型组,模型组采用CCl4制备肝纤维化模型,然后随机分为移植1、2、4周组和模型对照1、2、4周组,分别经尾静脉注射hUC-MSCs和同等剂量的生理盐水.取各组大鼠肝脏称重、制...     

骨髓间充质干细胞研究进展

干细胞是指那些具有高度增殖和多向分化的幼稚细胞。干细胞是近年来研究的热点，现在人们逐渐认识到骨髓中除造血干细胞以外，还含有另一类重要的干细胞一间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)。随着组织细胞工程学和基因工程学的发展，利用MSC的多项分化潜能，在组织工程、细胞因子替代治疗、基因治疗中以及再生医学等方面的应用研究已成为热点。现将骨髓间充质干细胞研究进展作一综述。     

间充质干细胞应用现状

<正>间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类多能干细胞,最初是从骨髓中发现的除造血干细胞以外的又一类干细胞。MSCs具有多向分化潜能,在体外不同诱导条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经细胞等;其来源方便,目前可从多种组织中分离提取,如骨髓、脐带血、脐带、胎盘、脂肪组     

氢醌对人骨髓间充质干细胞蛋白质表达谱的影响

[目的]了解氢醌（HQ）对人骨髓间充质干细胞蛋白表达谱的影响,筛选HQ骨髓毒性作用的靶蛋白。[方法]体外分离并培养人的骨髓间充质干细胞至第3代,随即将细胞分为实验组和对照组。实验组用5×10^-5mol/L的HQ染毒24h;对照组加入相同浓度的磷酸缓冲液处理24h。染毒完毕后即刻抽提两组细胞的总蛋白,然后利用双向凝胶电泳技术和LC-Qq-TOF质谱技术进行蛋白表达谱分析,找到可能的HQ骨髓毒性靶蛋白。[结果]在3次重复实验中,对照组与HQ处理组相比较,均有约20个差异蛋白点。其中3次中有11个重复的差异蛋白点,质谱分析鉴定出膜联蛋白-Ⅱ、甲酰-谷胱苷肽水解酶、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶和醛缩酶-A4个蛋白点。[结论]HQ可诱导膜联蛋白-Ⅱ、醛缩酶-A和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶表达下调及甲酰-谷胱苷肽水解酶表达的上调。     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

间充质干细胞分化为脂肪细胞蛋白组学分析

目的 利用蛋白组学技术,分析成脂分化过程中蛋白表达改变,探讨脂肪形成机制.方法 以体外诱导人体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化脂肪细胞作为模型,收集诱导0,1和3周细胞,制成蛋白裂解液;采用双向电泳结合质谱分析方法,以0周为对照组,比较诱导1周或3周蛋白质表达改变.结果 成脂分化引起44个蛋白表达上调或下调水平超过2倍.这些蛋白功能类型主要属于代谢(39%)、细胞骨架(11%)、氧化还原(6.8%)、蛋白合成与分解(15.9%)、信号传导(6.8%)和分子伴侣(4.5%)等蛋白.结论 生物学信息分析表明,被调节的蛋白在脂肪形成过程中起重要作用;MSCs是研究多能前体细胞向包括前脂肪细胞在内的个体细胞系定向分化的有利工具.     

骨髓间充质干细胞诱导抗砷细胞

目的利用低剂量NaAsO2诱导骨髓间充质干细胞MSCs,获得抗砷细胞,探讨抗砷机制。方法用1μmol/L NaAsO2对MSCs进行低剂量慢性诱导,利用四甲基偶氮噻唑蓝法(MTT)计算细胞生存率及半数致死量,观察细胞抗砷性的产生。结果NaAsO2诱导18周后,人骨髓MSCs产生稳定抗砷性,砷诱导组细胞LC50为25.8μmol/L,同步对照组细胞LC50为11.4μmol/L,砷诱导组细胞LC50是同步对照组细胞LC50的2.2倍。结论低剂量NaAsO2长期诱导人骨髓MSCs,可使细胞获得抗砷性。     

移植人脐带间充质干细胞治疗缺氧缺血性脑损伤的两种方法比较

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)经颈静脉及经腹腔两种途径移植后在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠脑内的分布、分化情况,寻找简单易行且有效的移植途径。方法 RICE法制备7日龄新生大鼠HIBD模型,随机分组:HIBD组(n=10)、腹腔移植组(n=15)、颈静脉移植组(n=15),另随机取未造模的10只为正常对照组。造模后72h后分别对颈静脉移植组和腹腔移植组移植等量的hUCMSCs(1×106个/只),而HIBD组及正常对照组不移植。于移植后36d免疫荧光染色比较Dil标记的hUCMSCs移植后在各组大鼠脑中的分布情况;神经元前体细胞标记DCX特异性染色观察hUCMSCs移植后分化成神经元前体细胞的情况。结果移植后hUCMSCs能迁徙到脑组织中,能分化成神经元前体细胞。经颈静脉移植途径优于经腹腔移植(P0.01)。结论 hUCMSCs移植后可以在HIBD新生大鼠脑内存活,并向神经元前体细胞分化,对HIBD新生大鼠脑功能有修复作用,尤以经颈静脉移植明显。     

人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在体外诱导培养分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性。方法采用成年人hMSCs传代培养2～3代,经条件培养液诱导培养后,进行形态学观察及MTT实验,RT-PCR分析,蛋白质印迹实验,茜素红染色方法分析细胞矿化作用,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,骨钙素(osteocalcin,OCN)、RUNX2和BMPR2的检测。结果 hMSCs细胞,在诱导培养条件下,细胞碱性磷酸酶ALP活性明显增高,并出现了矿化结节。经过体外成骨诱导的hMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征。在矿化期骨钙素mRNA OCN表达升高,RUNX2和BMPR2蛋白表达增高。结论 hMSCs易于体外分离培养及扩增,体外成骨定向诱导的hMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征,可以定向分化为成骨细胞。     

人脐血间充质干细胞预防博来霉素致大鼠肺纤维化效果

目的 探讨人脐血间充质干细胞(HUCBMSC)对博来霉素所致大鼠肺纤维化的预防性干预效果及可能机制.方法 取第2代HUCBMSC培养至第4代;取无特定病原体级5周龄雄性SD大鼠120只随机分为博来霉素组、干细胞干预组、地塞米松干预组和阴性对照组,每组30只.前3组分别经气管注入博来霉素建立肺纤维化模型,干细胞干预组造模后经鼠尾静脉注入5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记的HUCBMSC,地塞米松干预组造模后第1天开始连续腹腔注射地塞米松7d,阴性对照组经气管注入等体积生理氯化钠溶液,在第7、14、28天分别处死各组中的10只动物,肺组织行苏木精-伊红、马松三色染色,碱水解法测定肺羟脯氨酸的水平.结果 干细胞干预组第7、14、28天肺组织均可见Brdu标记的干细胞.3个时间点的博来霉素组肺羟脯氨酸水平呈逐渐升高的趋势,第28天达最高水平(P＜0.01).3个时间点干细胞干预组和地塞米松干预组的肺泡炎症及肺纤维化程度均分别较博来霉素组轻,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HUCBMSC可以定植于受损的肺组织中,并可能在肺纤维化早期有效减轻肺泡炎及肺纤维化.     

羟丙基甲基纤维素在脐血干细胞分离中应用

目的 探讨羟丙基甲基纤维素在人脐血间充质干细胞(MSCs)分离中应用的可行性及分离效果。方法 对脐血样本先用生理盐水稀释,然后分别加入3种不同沉降因子(羟丙基甲基纤维素,明胶和羟乙基淀粉),血液、生理盐水、沉降因子比例为2:1:3,混匀后静置至界面分层清晰时记录时间;用Percoll液对上清液进一步分离,计数回收MSCs量与存活数;将MSCs进行培养、传代,传到第3、20代及液氮冻存6个月后复苏再传至35代时用流式细胞仪检测CD44、CD90、CD105,CD34、CD45表达。结果 羟丙基甲基纤维素沉降红细胞速度最快,仅需15 min,明胶和羟乙基淀粉均需要30 min左右,差异具有统计学意义(P<0.05);0.1%~0.3%羟丙基甲基纤维素对脐血MSCs回收量在(6.24~6.72)×10⁶个/mL,高于4%~8%羟乙基淀粉对脐血MSCs回收量[(5.12~6.88)×10⁶个/mL)],明显高于0.3%~0.6%明胶对脐血MSCs回收量[(2.08~2.56)×10⁶/mL)],差异均具有统计学意义(P<0.05);羟丙基甲基纤维素回收MSCs的存活率最高,高于明胶和羟乙基淀粉,差异具有统计学意义(P<0.05);用羟丙基甲基纤维素分离、培养的MSCs传到第3、20代及液氮冻存6个月复苏后传到第35代,CD44、CD90、CD105表达均呈阳性,CD34、CD45表达呈阴性,符合干细胞表面标志特征。结论 羟丙基甲基纤维素可以用于脐带血MSCs分离(最适宜浓度为0.2%),效果优于常用的分离试剂明胶和羟乙基淀粉。     

大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞成骨分化比较的体外研究

目的对骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞（AMscs）成骨能力进行比较。方法采用钙钴法染色、四环素荧光标记、Ⅰ型胶原染色、茜素红染色、碱性磷酸酶测定，比较脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞成骨能力。结果两种细胞诱导3周后，茜素红染色出现淡红色钙结节；四环素荧光染色出现明亮黄色荧光钙结节。改良钙钴法染色，细胞胞浆中出现黑色颗粒。结论（1）AMSCs向成骨诱导后，可表达Ⅰ型胶原、ALP，并出现钙结节。（2）AMSCs经过诱导后，可向成骨细胞方向分化。