SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

SARS病毒M蛋白编码基因真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的:构建SARS冠状病毒M蛋白N端编码基因1~129bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况。方法:用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-M上扩增出M编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-M。重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组M蛋白片段表达。结果:酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组质粒的构建完全正确。对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为10000处有重组蛋白的表达。结论:SARS冠状病毒M蛋白N端1~43aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达。     

汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

目的：研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法：采用RT-PCR扩增G2基因，转化感受态大肠杆菌DH5α，DNA序列分析后，SnaBI、NotI两次酶切下G2，再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上，构建表达载体pPIC9K-G2，SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115，G418筛选转化子，1％甲醇诱导、摇瓶培养。结果：序列分析表明，克隆序列与设计相符，12％SDS-PAGE显示重组蛋白为50KD，Western-Blot证实其生物学活性。结论：成功地在巴斯德毕赤酵母GS115中表达了汉坦病毒G2膜蛋白基因。     

大鼠DAF蛋白真核表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建大鼠促衰变因子(DAF)的酵母真核表达载体,诱导其表达并对生物学特性进行鉴定.方法 采用RT-PCR技术从大鼠肝脏组织中扩增出DAF基因并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒中.经酶切鉴定后,将pPIC9K-DAF转化至毕赤酵母菌GS115,通过G418-YPD平板筛选高拷贝转化子.转化子经甲醇诱导表达后,对表达的DAF蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定并检测重组蛋白的生物活性.结果 成功克隆大鼠DAF基因,并筛选出pPIC9K载体中的DAF阳性克隆,证实所获得相对分子质量约为70×103大小的重组蛋白具有大鼠DAF蛋白的抗原性和生物学活性.结论 采用分子克隆的方法成功构建大鼠DAF蛋白的毕赤酵母真核表达载体,能为补体及免疫研究提供高效的大鼠DAF蛋白来源.     

人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的 实现人补体受体1型(complement receptor type 1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的分泌表达.方法 用PCR从原核表达质粒pET32a-sCR1-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基因,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒pPIC9-CR1-SCR15-18,鉴定后测序;重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,菌落PCR技术筛选阳性转化株;经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达;Ni2*-NTA agarose亲和层析纯化目的蛋白,并用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性.结果 成功构建重组表达质粒pPIC9-CR1-SCR15-18;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达;表达产物经镍柱快速纯化后,能够明显抑制补体的体外溶血.结论 在毕赤酵母中成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体溶血的生物活性.     

NDRG2蛋白的毕赤酵母可溶表达与纯化

目的：酵母表达并纯化可溶性NDRG2蛋白。方法：从pRSET-A-ndrg2重组质粒中扩增出6his-ndrg2融合基因，克隆入酵母表达载体pPIC3.5K；酵母重组表达载体pPIC3.5K-6his-ndrg2电转化入毕赤酵母GS115，并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选；对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达，可溶性表达产物经Ni-NTA亲合层析纯化。结果：构建得到酵母融合重组表达载体pPIC3.5K-6his-ndrg2；经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体以上的重组酵母表达菌株；诱导后表达得到6his-NDRG2融合蛋白，并成功纯化得到可溶性表达产物。结论：表达并纯化得到可溶性NDRG2蛋白，为进一步研究NDRG2的结构与功能打下了必要的基础。     

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

IL-18在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:探索人IL-18成熟蛋白(mhIL-18)在毕赤酵母中的高效表达. 方法:采用SOEing及不对称PCR方法扩增出mhIL-18基因并构建融合型表达载体pPIC9-IL-18-Intein,转化入毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,运用SDS-PAGE和Western Blot分析重组蛋白的表达,并经亲和层析后用MTT法检测表达的mhIL-18生物活性. 结果:成功构建载体并转化入毕赤酵母,经甲醇诱导,重组的GS115可分泌mhIL-18,其表达在96 h时达高峰,分泌量可达100 mg/L. 亲和层析后的mhIL-18纯度可达95%,并具有显著的IL-18的生物学活性. 结论:在毕赤酵母中成功表达具有显著生物学活性的mhIL-18.     

小鼠睾丸体外培养模型研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯对睾酮合成及机制的影响

【摘要】 目的构建大鼠促衰变因子(DAF)的酵母真核表达载体,诱导其表达并对生物学特性进行鉴定。方法采用RT-PCR技术从大鼠肝脏组织中扩增出DAF基因并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒中。经酶切鉴定后,将pPIC9K-DAF转化至毕赤酵母菌GS115,通过G418-YPD平板筛选高拷贝转化子。转化子经甲醇诱导表达后,对表达的DAF蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定并检测重组蛋白的生物活性。结果成功克隆大鼠DAF基因,并筛选出pPIC9K载体中的DAF阳性克隆,证实所获得相对分子质量约为70×103大小的重组蛋白具有大鼠DAF蛋白的抗原性和生物学活性。结论采用分子克隆的方法成功构建大鼠DAF蛋白的毕赤酵母真核表达载体,能为补体及免疫研究提供高效的大鼠DAF蛋白来源。     

人源抗菌肽LL-37表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建人源抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,将其转化毕赤酵母GS115,诱导LL-37表达.方法:根据抗菌肽LL-37氨基酸序列及毕赤酵母偏爱密码子,应用互补延伸PCR技术扩增抗菌肽LL-37基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化E.coli DH5α,构建重组分泌型酵母表达载体pPIC9-LL-37,PCR鉴定并测序;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定;甲醇诱导LL-37表达,筛选最高表达株,检测表达产物对大肠杆菌的抑菌活性,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析.结果: pPIC9-LL-37载体构建成功;转化毕赤酵母后PCR鉴定出LL-37基因;0.5%甲醇能诱导LL-37高表达,筛选出最高表达株,发酵上清约含LL-37 0.5 μg/ml,对E.coli具有较强的抑菌活性,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37.结论:成功构建pPIC9-LL-37载体,转化毕赤酵母后,经甲醇诱导能高表达分泌LL-37,表达的LL-37蛋白具有较强的抑菌活性.     

辣根过氧化物酶同功酶C3基因在毕赤酵母中的克隆与分析

目的克隆辣根过氧化物酶同功酶C3(HRPC3)基因,为此基因的表达做准备。方法用PCR方法从辣根的基因组DNA中扩增得到一种辣根过氧化物酶同功酶C3基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上。测序证明正确后,再以带有EcoRI和NotI酶切位点的引物进行PCR,然后将目的基因切下,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组pPIC9K质粒,用电转化转入毕赤酵母。提取转化子的基因组DNA,用PCR进行鉴定是否含有HRPC3基因。结果重组pPIC9K质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HRPC3。     

IL-18在毕赤酵母中表达载体的构建及高拷贝子筛选

目的 探索人白介素18(IL-18)成熟蛋白(mhIL-18)在毕赤酵母中高效表达载体的构建,以及多拷贝阳性转化子的筛选.方法 采用SOEing及不对称PCR方法扩增出mhIL-18基因并构建融合型表达载体pPIC9IL-18-Intein,再运用大片段套接的方法避开酶切位点,构建pPIC9KIL-18-Intein.利用G418的加压筛选寻找重组克隆高拷贝菌株.结果 成功构建pPIC9KIL-18-Intein载体,并通过双抗筛选、PCR、酶切以及DNA 测序证明.寻找到重组克隆高拷贝菌株.结论 成功构建mhIL-18在毕赤酵母中的表达载体pPIC9KIL-18-Intein,并筛选到重组克隆高拷贝菌株,为IL-18融合蛋白的高表达及纯化奠定了基础.     

重组sCR1在毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定

目的:酵母细胞SMD 1168表达人sCR1,并对重组蛋白进行纯化。方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD 1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及W estern b lot鉴定,并通过N i2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48~72 h sCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为M r大于31 KDa的蛋白区带,在W estern b lot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经N i2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

Neuritin在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的：构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,为进一步探讨Neuritin的生物学功能及作用机制奠定基础。方法和结果：在巳克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF与载体pPIC9k重组,然后利用电击转化将重组质粒pPIC9k—Neuritin导入GSll5酵母菌株。筛选出阳性克隆经PCR及测序正确后,用甲醇诱导Neuritin分泌表达;表达产物经SDS—PAGE及Western—blot鉴定。结论：成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

人CTLA-4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的 构建人CTLA－4胞外区蛋白毕赤酵母分泌型表达载体，获得高拷贝稳定整合菌株，为大量获得人CTLA－4胞外区蛋白，进行功能研究及其临床应用奠定基础。方法 从活化人外周血淋巴细胞总RNA中，扩增人CTLA－4基因胞外区cDNA片段，将目的基因插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游，再插入高拷贝载体pPIC9K，得到pPIC9K-CTLA4,SaL I线性化后电转GS115；G418梯度筛选转化菌。PCR，Suthern blotting鉴定目的基因整合及拷贝数。结果 成功构建了人CTLA－4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体，获得了高拷贝稳定整合菌株。结论 为表达人CTLA－4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。     

SP-A1在甲醇酵母中的分泌表达及产物的鉴定

目的：研究人肺表面活性物质相关蛋白A1(SP-A1)在甲醇酵母Pichia pastoris(P．pastoris)中的分泌表达、产物的分离纯化及免疫活性测定。方法：将人SP-A1基因克隆至P.pastoris的分泌表达质粒pPIC9K上，获得重组表达质粒pPIC9K／SP-A，转化P.pastoris GS115、KM71。通过G418筛选获得高拷贝转化子(HIS4Mut^ )，在摇瓶中培养、甲醇诱导表达SP-A1，纯化目的蛋白，并免疫小鼠，ELISA法和western blotting分析SP-A1的免疫活性。结果：SDS-PAGE结果显示，在P.pastoris中经甲醇诱导，SP-A1获得表达，其表达量在上清中为200mg／L。经过纯化可获得纯度达95％以上的蛋白质。ELISA法和western blotting结果表明，目的蛋白可被多克隆抗体识别。可刺激小鼠产生抗体。结论：人组织特异性蛋白SP-A1可在P.pastoris中表达，表达产物具有免疫原性。     

重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究

目的 实现TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)与人生长激素(human growth hormone,hGH)的重组融合蛋白rTMP-GH在巴氏毕赤酵母中的高效表达.方法 以含有rTMP-GH核苷酸序列的原核质粒为模板,PCR方法获得rTMP-GH的编码序列,并亚克降至载体pPIC9K中,将所构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒转化酵母宿主细胞GS115,MD/MM平板及G418抗性筛选高表达株,然后进行试管补料分批表达,Western blot对表达产物进行鉴定,通过巨核细胞集落形成能力对其,圭物学活性进行初步检测.结果 成功构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒,筛选到高表达rTMP-GH重组融合蛋白的巴氏毕赤酵母细胞株,初步证实所表达产物具有刺激巨核细胞集落形成的能力.结论 成功实现了rTMP-GH融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达.     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.