高密度脂蛋白及其受体的研究进展

本文对高密度脂蛋白的结构组成、代谢、与动脉粥样硬化的关系以及高密度脂蛋白受体的确认过程、与动脉粥样硬化的关系作了综述。小鼠清道夫受体BⅠ被确认是真正介导细胞与高密度脂蛋白作用的受体,对于了解高密度脂蛋白胆固醇的代谢是非常有意义的,它有可能作为一个新的治疗靶点,由此找到预防和治疗动脉粥样硬化性心脑血管疾病的方法。     

以MDR1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

通过构建以MDR1启动子为启动序列的荧光素酶报告基因载体,建立基于双荧光素酶报告基因系统的多药耐药抑制剂筛选模型。从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子的序列。将该序列重组到荧光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中,建立用于筛选多药耐药抑制剂的方法。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。通过MDR1基因激活剂（热诱导）和抑制剂（EGCG）来验证该方法。通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子序列且没有出现碱基突变。在n（pGL-MDR1）∶n（pRL-TK）=5∶5时,转染效率最高并具有最高的荧光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。     

一种高通量筛选PAC1受体激动剂的细胞模型的建立

目的 建立垂体腺苷酸环化酶激活肽Ⅰ型受体(pituitary adenylate cyclase activating peptide Ⅰ receptor, PAC1-R)激动剂的高通量筛选模型,筛选PAC1-R受体的激动剂,开发用于治疗神经系统疾病和能量代谢疾病的药物.方法 将人的PAC1-R cDNA克隆到哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1构成质粒hPAC1R/pCDNA3.1,将这种质粒与报告基因质粒(SRE/3×MRE/CRE/VIP /Luci)共转染到CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定细胞株,利用PAC1-R内源激动剂PACAP-27探索和优化了筛选条件.结果 建立了稳定表达hPAC1-R的筛选细胞株和可靠的筛选方法,Z'因子大于0.7.结论 该系统成功适合于PAC1-R激动剂的高通量筛选.     

高密度脂蛋白受体的酶标测定法

高密度脂蛋白受体的酶标测定法雷涛，朱禧星，顾建新，陈惠黎（上海医科大学华山医院糖尿病研究室２０００４０，基础医学院生物化学教研室２０００３２）蛋白质非酶糖化是糖尿病慢性并发症的主要发病环节之一［１］。高密度脂蛋白（ＨＤＬ）的非酶糖化与糖尿病并发症的发...     

基于报告基因的PPAR-α激动剂筛选体系的建立

目的 基于PPAR-α受体的信号传递通路和利用双萤光素酶报告基因分析方法,建立稳定的PPAR-α激动剂体外筛选体系。方法 pcDNA3.1-PPAR-α、pGL3-PPRE-luc及pRL-CMV共转染293T细胞后,设0,0.1,1,10,50 μmol·L^-1非诺贝特不同浓度点进行干预后,测定每浓度点重复5个样本。对转染优化试验数据,比较均值大小选取最佳结果;对不同转染组之间的差异性比较,采用t检验和方差分析。结果 浓度为0.1,1,10,50 μmol·L^-1非诺贝特干预组相对诱导率分别为：0.82,1.29,1.72,1.94,表现有统计学差异(P<0.05)。结论 成功建立基于PPAR-信号通路及双萤光素酶报告基因分析方法的PPAR-α激动剂筛药系统。     

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂高通量筛选模型的建立

目的:建立表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)抑制剂的高通量筛选模型。方法:通过基因工程技术表达EGFR-RTK,ELISA法验证其生物学活性;应用表面等离子共振原理筛选与激酶具有结合活性的化合物,ELISA法检测其生物学活性。结果:在原核表达系统中成功表达具有生物学活性的EGFR-RTK蛋白。将蛋白偶联至生物芯片,阳性化合物EI 188与EGFR酪氨酸激酶结合的Kd值为5.00×10-7mol.L-1,IC50为12.37μmol.L-1,与预期结果一致。应用该模型筛选31个待测化合物,发现了6个具有结合活性和酶抑制活性的EGFR-RTK抑制剂。结论:成功建立了基于表面等离子共振原理和ELISA法的高通量EGFR-RTK抑制剂的筛选模型,为发现新型酪氨酸激酶抑制剂奠定了基础。     

以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立研究

目的 以PRDM1基因启动子为靶点构建双荧光素酶报告基因载体,建立体外药物筛选细胞模型,并对中草药小分子化舍物进行筛选.方法 将人PRDM1基因启动子序列(267、1 257 bp)克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,构建重组质粒pGL3-PRDM1并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映PRDM1基因启动子的启动转录活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证.结果 成功构建了荧光素酶报告载体pGL3-PRDM1.用0.5、1、2、4μmol/L的5-Aza-CdR处理重组的U266细胞筛选模型,与0μmol/L 5-Aza-CdR相比,增加5-Aza-CdR的刺激,荧光强度及PRDM1基因启动子的活性呈剂量依赖性增强.与0μmol/L相比,青蒿琥酯从5 μmol/L浓度开始对PRDM1基因启动子活性呈明显降低(P＜0.05),在20 μmol/L浓度时降到最低;白芍总苷呈现小剂量促进PRDM1启动子活性,高剂量抑制PRDM1基因启动子活性.青蒿琥酯对细胞生长增殖影响较小,白芍总苷对细胞生长增殖的影响较复杂.结论 成功建立了以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型,并筛选出青蒿琥酯能抑制PRDM1基因启动子活性.     

体外三维抗血管生成药物筛选模型的建立

目的:建立一种新的用于筛选具有抗血管生成作用的体外血管生成模型。方法:人脐静脉的内皮细胞(HUVECs)在三维胶原纤维系统中培养，制备成具有毛细血管样网状结构模型；3种酪氨酸酶抑制剂genistein，tyrphostin A23和lavendustin C被分别加入到模型中，观察它们对血管形成的影响。结果:在不加入任何生长因子的条件下，HUVECs能迅速重组形成毛细血管样网状结构；3种酪氨酸酶抑制剂均对血管形成有抑制作用。结论该模型具有操作简单、可重复性好、易量化的特点。是一种在体外筛选血管生成抑制剂的理想模型。     

靶向HIV-1启动子的药物筛选系统的建立

目的:建立靶向HIV-1启动子的药物筛选系统.方法:将HIV-1启动子核心序列克隆入荧光素酶报告基因载体pGLA.17中,构建重组质粒pGL4.17-HIV-1P并转染H9细胞;分别用杜仲、黄芩、苦参及双黄连灌胃大鼠后采血,将含药血清分别作用于转染的H9细胞,检测H9细胞荧光素酶活性.以灌胃生理盐水的大鼠血清处理的转染...     

大鼠肝星状细胞LDL、HDL受体的测定

研究大鼠肝星状细胞ＬＤＬ、ＨＤＬ受体。方法用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流,Ｎｙｃｏｄｅｎｚ密度梯度离心分离大鼠ＨＳＣ,应用＾１２３Ｉ－ＬＤＬ和＾１２５Ｉ－ＨＤＬ３配体进行放射性配基结合实验测定ＨＳＣＬＤＬ、ＨＤＬ受体。     

脂康调节高脂血症家兔肝脏LDL-R mRNA水平的实验研究

目的通过建立新西兰家兔高脂血症模型，探讨肝脏低密度脂蛋白受体基因水平与高脂血症形成的关系。方法（1）建立高脂血症家兔模型；（2）应用原位杂交方法检测肝脏低密度脂蛋自受体基因水平。结果（1）成功建立高脂血症家兔模型；（2）脂康方剂可有效降低血脂水平，并能有效上调肝脏低密度脂蛋白受体基因水平。结论脂康方剂可激活肝脏细胞膜LDL—R基因表达，使LDL—R的活性增强，从而加速脂蛋白的分解，有效调节血脂水平。     

Exploration of the Relationship between Phlegm-Dampness Constitution and Polymorphism of Low Density Lipoprotein Receptor Genes Pvu Ⅱ and Ava Ⅱ

Objective:To explore the polymorphism of low density lipoprotein receptor (LDL-R) genes PvuⅡand AvaⅡin a population with phlegm-dampness constitution (PDC).Methods: Polymorphism of LDL-R genes at PvuⅡand AvaⅡof 48 persons with gentle constitution (GC) and 61 with PDC were analyzed with PCR-RELP technique,and their serum contents of lipids and glucose were determined and compared as well.Results:The A allelic and P- allelic frequency were higher and the P allelic frequency was lower in subjects with PDC than those in subjects with GC,which were 0.3083 vs 0.1771,0.9098 vs 0.7708 and 0.0902 vs 0.2292,respectively,all showing significant difference between the two groups (P<0.05).Comparison of the two groups in serum levels of triglyceride (TG),fasting blood glucose,2 h postprandial blood glucose,and 2 h postprandial insulin showed that all the parameters were higher in subjects with PDC than in subjects with GC respectively, showing significant difference (P<0.05).Conclusion:PDC is related with the P- and A allelic frequency of higher LDL-R genes at PvuⅡand AvaⅡ,therefore,the polymorphism of LDL-R genes could be taken as one of the genetic markers for PDC,and humans with PDC are more liable to suffer from blood lipids and glucose disorder than those with GC.     

菊藤胶囊对高脂血症大鼠血脂及肝脏高密度脂蛋白受体基因表达的影响

目的：观察菊藤胶囊对高脂血症大鼠血脂及肝脏高密度脂蛋白受体（SR-BI）基因表达的影响,从分子水平上探讨其作用机制,为其临床应用提供依据。方法：将60只雄性SD大鼠以普通饲料喂养1wk后测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）基础值。根据TC水平随机分为：空白对照组、模型组、血脂康组及菊藤胶囊低、中、高剂量组,每组各10只。空白对照组普通饲料喂养,其余各组予高脂饲料;自由饮水,模型组灌胃生理盐水,血脂康组灌胃血脂康胶囊0.090g／kg,菊藤胶囊低、中、高剂量组分别灌胃菊藤胶囊1.175,2.350,4.700g／kg,1次／d,连续给药6wk.采用酶法检测大鼠TC,TG,HDL-C和LDL-C;分别以RT-PCR技术和Western Blot法,对肝SR-BI在mRNA及蛋白水平进行检测。结果：模型组大鼠血TC,TG,LDL-C均显著高于空白对照组（P〈0.05）,HDL-C显著低于空白对照组（P〈0.05）,肝SR-BI mRNA及SR-BI蛋白含量与空白对照组比较显著降低（P〈0.05）。血脂康组及菊藤胶囊中、高剂量组大鼠血TC,TG,LDL-C均显著低于模型组（P〈0.05）,HDL-C显著高于模型组（P〈0.05）,菊藤胶囊高剂量组与血脂康组比较差异显著（P〈0.05）,血脂康组及菊藤胶囊中、高剂量组大鼠肝SR-BI mRNA及SR-BI蛋白含量与模型组比较显著升高（P〈0.05）。结论：菊藤胶囊可明显降低TC,TG,LDL-C,升高HDL-C,调节脂质代谢紊乱、治疗高脂血症,其作用机制可能与上调肝SR-BI的表达相关。     

培养人动脉平滑肌细胞诱发高密度脂蛋白的氧化修饰

目的：观察高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL）经与培养人动脉平滑肌细胞（Smooth muscle cell,SMC）保温后发生氧化修饰。方法：HDL组分琼脂糖凝胶脂蛋白电泳，及其共轭二烯（Conjugated diene CD)、硫代巴比妥酸反应物质（Thiobarbituric acid reaction substance TBARS）及脂氢过氧化物（Lipid hydroperoxide LOOH）的测定。结果：HDL经过与人动脉SMC共培养后，与天然HDL（Native HDL N-HDL)比较，其电泳迁移率明显增加，其CD、TBARS及LOOH的含量均显著增加（P＜0．01）。结论：HDL经过与培养人动脉SMC37℃保温48h后可发生氧化修饰。     

植物血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体介导氧化型低密度脂蛋白对内皮祖细胞存活和功能的影响

目的 研究植物血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体（LOX—1）是否介导氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）对内皮祖细胞（EPC）的存活及功能产生影响。方法 分选脐血CD34^＋细胞,培养于内皮细胞生长培养基（EGM-2）中。培养14d后,部分EPC与10、25、50μg/ml的oxLDL孵育48h;部分EPC先与LOX-1单克隆抗体（LOX—1mAb）预处理24h,再与50μg／ml oxLDL孵育48h;对照组不作处理。检测EPC存活率及EPC迁移、黏附和管状结构形成能力,并检测LOX-1的蛋白及mRNA表达。结果oxLDL浓度为25和50μg／ml时,凋亡率分别为（15．8±1．0）％和（18．8±2．0）％,显著高于对照组的（9．0±1．2）％（P〈0．05）;迁移率分别为（5．7±1．0）％和（5．1±0．8）％,显著低于对照组的（9．5±0．8）％,（P〈0．05）;黏附细胞数分别为（33±2）和（30±3）个,显著少于对照组的（37±5）个（P〈0．05）;形成的管状结构分别为（2．9±0．5）和（1．8±0．5）mm,显著短于对照组的（5．0±0．6）mm（P〈0．05）。OxLDL可增加LOX—1mRNA及蛋白的表达,oxLDL浓度为50μg／ml时,LOX—1mRNA表达由100％增加为（174±39）％,蛋白表达由100％增加为（172±8）％。OxLDL的上述作用能被LOX1mAb所阻断。结论OxLDL可降低EPC存活,抑制EPC功能,其作用是由LOX—1介导的。     

Oxidative modification of high density lipoprotein induced by cultured human arterial smooth muscle cells

Objective: To observe the oxidative modification of high density lipoprotein (HDL) induced by culturedhuman arterial smooth muscle cells (SMCs). Methods: HDL cocultured with SMCs at 37℃ in 48 h was subjected,and native HDL (N-HDL) served as control. Oxidative modification of HDL was identified by using agarose gel electro-phoresis. Absorbances of conjugated diene (CD) and lipid hydroperoxide (LOOH) were measured with ultravioletspectrophotometry at 234 and 560 nm respectively, and fluorescence intensity of thiobarbuturic acid reaction substance