基于报告基因系统的肝细胞核因子4α活性检测体系的建立

目的 建立一个基于荧光素酶报告基因系统的肝细胞核因子4α(HNF4α)活性检测系统,筛选可调控HNF4α活性的小分子化合物.方法 采用亲和层析法纯化HNF4α蛋白,行蛋白热迁移实验检测相关DNA片段及小分子化合物与HNF4α蛋白的直接相互作用.分别构建含有3个拷贝和9个拷贝的Ninjurin 1(NINJ1)基因启动子区HNF4α反应元件的荧光素酶报告基因质粒pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p,转染肝癌细胞,采用荧光素酶报告基因法检测肝癌细胞内HNF4α转录活性的改变,qPCR检测小分子化合物木犀草素或阿尔维林处理后肝癌细胞中HNF4α及下游基因的表达情况,荧光素酶报告基因法检测小分子化合物处理后细胞内HNF4α转录活性的改变.结果 蛋白热迁移实验证实,NINJ1基因启动子区HNF4α的DNA结合片段可与HNF4α蛋白结合.在过表达HNF4α的肝癌细胞中,pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p均可检测到肝癌细胞中HNF4α活性的改变,且pGL3-NINJ1-9p较pGL3-NINJ1-3p的检测灵敏度更高(P＜0.01).木犀草素和阿尔维林与HNF4α蛋白存在直接相互作用,分别下调和上调HNF4α靶基因;pGL3-NINJ1-9p可检测到木犀草素和阿尔维林对HNF4α转录活性的影响.结论 利用报告基因载体pGL3-NINJ1-9p成功建立了HNF4α活性的检测系统,为筛选调控HNF4α活性的小分子化合物等提供了基础工具.     

IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测

目的构建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。方法通过人工合成调控吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达的启动序列ISRE4（4个串联的ISRE序列）和GAS7（7个串联的GAS序列）,与pGL3-Enhancer连接成重组体pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7,通过转化扩增,筛选出阳性克隆,并通过酶切、测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果成功地构建了pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7两个荧光素酶报告基因载体,在IFN-γ的诱导下,能启动细胞内荧光素酶的表达。结论 pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7的荧光素酶报告基因载体的成功构建为研究IDO蛋白的表达调控机制和以IDO为靶标的抗肿瘤免疫耐受药物快速高通量的筛选提供了重要的研究工具。     

含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链基因表达载体的构建

目的：构建含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体。方法：利用PCR技术从人乳癌细胞MCF-7中扩增出DF3／MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3／MUC1启动子的转录调控序列并亚克隆入pGL3-Basic载体,构建重组质粒pGL3-DF3。从质粒pIBI30-DTA中切下DTA片断,以DTA基因替换重组质粒pG13-DF3中的虫荧光素酶基因,构建重组质粒pGL3-DF3-DTA。结果：构建了含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和DTA的表达载体,酶切和测序结果与预期完全相符。结论：重组质粒pGL3-DF3-DTA构建成功。     

催乳素调控序列荧光素酶报告基因的构建

目的通过将人催乳素(hPRL)启动子上游的调控基因(包括启动子,-3518 bp~+15 bp)插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中,构建成含催乳素调控序列的荧光素酶报告基因(PRL3400-pGL3-Basic),用于催乳素在淋巴细胞中的表达调控研究。方法将含hPRL启动子的PGEM-PRL3400,及荧光素酶报告基因pGL3-Basic转染大肠肝菌(JM109)后扩增,提取并纯化PGEM-PRL3400和pGL3-Basic;分别以SacⅠ、BamHI酶切PGEM-PRL3400,SacⅠ、BglⅡ酶切pGL3-Basic;电泳并回收PRL3400片段和pGL3-Basic酶切大片段,在T4 DNA连接酶的作用下,将PRL3400片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中。结果通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒含有pGL3-Basic全序列及催乳素启动子上游调控序列,并且PRL3400片段调控序列的插入位置与方向正确。结论该荧光素酶报告基因构建成功。     

人NaDC1基因启动子序列转录调控元件的初步分析

目的 对hNaDC1基因启动子序列转录调控元件进行初步分析.方法 构建hNaDC1基因5'侧翼序列系列缺失质粒,以双荧光素酶报告基因检测系统检测hNaDC1基因5'侧翼区(-2 232/ 136)的转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用.结果 pGL3-hNaDC1A质粒的转录活性最高,为(2.98±0.45);pGL3-hNaDC1D的转录活性最低,为(0.45±0.14).以pGL3-hNaDC1A质粒的转录活性为基准(100%),其他4种质粒相应的转录活性分别为:pGL3-hNaDC1B 86.7%,pGL3-hNaDC1C 89.4%,pGL3-hNaDC1D 15.8%,pGL3-hNaDC1E 61.2%.MatInspector 5.0软件预测结果显示hNaDC1基因5'侧翼启动子序列共含有22个14种转录因子结合位点.结论 hNaDC1基因5'侧翼区-1 084/-254和-12/ 136区域可能存在有正性作用转录因子的结合位点.     

利用双萤光素酶报告基因系统筛选有效的siRNA

目的 建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的 基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法.方法 以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照pSi-Negative.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的GFP与萤光素酶基因(LUC)的融合表达载体pGL3-GFPf.将包含3个GFPsiRNA靶序列的GFP片段插入到改建过的pGL3-promoter载体上LUC的3非翻译区(UTR),构建pGL3-GFPp.将GFP siRNA表达质粒联同内参照质粒pRL-TK分别与pGL3-GFPf、pGL3-GFPp共转化HEK293细胞.利用双萤光素酶检测试剂盒测定各组细胞中萤光素酶的活力水平,用荧光定量PCR检测各组细胞中GFP mRNA的表达水平.结果 同对照组相比,与pGL3-GFPf共转化GFP siRNA 表达质粒的各组细胞中萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶比值明显降低,其中GFPsiRNAl表达组中降低最显著(P<0.01);定量PCR检测也显示,GFPsiRNA1表达组中GFP mRNA的表达水平降低最明显(19<0.01).双萤光素酶活性检测和定量PCR结果还显示,与pGL3-GFPp共转化GFP siRNA表达质粒的各组细胞中,GFPsiRNA1抑制GFP的表达最显著(P<0.01).结论 本文建立了通过双萤光素酶活性检测来筛选有效的siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案.

Abstract：

Objective To establish an efficient method for screening effective small interference RNA (siRNA) using dual-luciferase reporter assay system. Methods Based on the siRNA expression vector pSilencer-4.1, 3 candidate green fluorescence protein (GFP) gene siRNA expression plasmids, namely pSi-GFPsiRNA1, pSi-GFPsiRNA2, and pSi-GFPsiRNA3, along with the negative control pSi-Negative, were constructed. Using the pGL3-promoter vector, the GFP-luciferase (GFP-LUC) expression plasmid pGL3-GFPf was constructed with the same Kozak consensus translation initiation site and start codon ATG for GFP-LUC coding sequence. The GFP fragment containing the target sequences of 3 GFP siRNAs was introduced into the 3' untranslate region of LUC in the modified pGL3-promoter vector to construct the plasmid pGL3-GFPp. The GFP siRNAs expression plasmids and Renilla luciferase reporter vector pRL-TK were co-transfected with pGL3-GFPf or pGL3-GFPp into the HEK293 cells, respectively. The luciferase activities were determined by dual-luciferase reporter assay, and the GFP mRNA expressions were detected by real-time quantitative PCR. Results In the groups cotransfected with GFP siRNAs expression plasmids and pGL3-GFPf, the luciferase activities were reduced obviously,and the reduction was more significant in cells transfected with GFPsiRNAl compared with the control cells (P<0.01).GFP mRNA levels were also markedly lowered in cells transfected with GFPsiRNAl as shown by real-time PCR (P<0.01). In addition, the results of dual-luciferase reporter assay and real-time PCR showed that among the groups cotransfected with GFP siRNAs expression plasmids and pGL3-GFPp, the GFP expression was inhibited most obviously by GFPsiRNA1 (P<0.01).Conclusion The dual-luciferase reporter assay system provides a useful method for screening effective siRNAs targeting specific genes.     

β1整合素启动子荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的克隆β1整合素(CD29)启动子区基因全长序列,构建并鉴定β1整合素启动子全长序列荧光素酶报告基因载体pGL3-β1。方法以含β1整合素启动子基因全长序列的基因片段(2 735 bp)的重组pGEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子基因全长序列1 756 bp,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体pGL3-β1,并NheⅠ、XhoⅠ酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染人表皮细胞株HaCaT进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1 756 bp与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且pGL3-β1启动子在人表皮细胞株HaCaT中有明显转录活性。结论成功构建了β1整合素启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究人β1整合素启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。     

TNF-α regulates netrin-1 expression through enhancing promoter activity

目的 探讨TNF-α对netrin-1基因表达的影响,并对其调控机制作初步研究.方法 采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测TNF-α对netrin-1表达的影响.用PCR反应扩增netrin-1启动子序列,克隆至pGL3荧光素酶报告基因载体,转染HEK 293A细胞,通过检测荧光素酶活性观察TNF-α对netrin-1转录水平的表达调控.结果 TNF-α(20 ng/ml)能上调netrin-1的表达.成功构建pGL3 netrin-1-promoter荧光素酶表达载体,并证实构建的报告基因载体启动子具有活性;发现TNF-α可使netrin-1启动子活性增加(P＜0.05),并以剂量和时间依赖方式调节netrin-1启动子的活性.结论 细胞因子TNF-α可能通过调控启动子的活性而调节netrin 1的表达.     

hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列的克隆及生物信息学分析

目的扩增人纤维蛋白原样蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶基因5′端调控序列,构建荧光素酶报告基因表达载体,对hfgl2基因5′侧翼启动子序列进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式作用元件。方法用聚合酶链反应(PCR)法从人外周血单个核细胞基因组DNA中扩增hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列,PCR产物酶切后克隆至pGL3-Basic载体,重组质粒行酶切及测序鉴定,使用在线分析软件对5′端调控序列中的转录因子结合位点及启动子序列进行预测。结果扩增了长度为1 567bp的hfgl2凝血酶原酶基因5′端序列,酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hfgl2质粒插入片段正确无误,分析显示该基因序列共含有138个、31种顺式作用元件。结论构建hfgl2基因近端启动子转录调控序列荧光素酶报告基因的表达载体为研究hfgl2的转录调控奠定了基础。     

AP-1在血管内皮细胞PAI-1表达中的作用

目的 研究核转录因子激活蛋白-l(activator protein-l,AP-1)在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、弱氧化修饰低密度脂蛋白(minimal modified low density lipoprotein,mmLDL)诱导血管内皮细胞PAI-l基因表达中的转录调控机制。方法 进行人脐静脉内皮细胞(human vascular endothelial cells,HUVECs)的培养和鉴定。采用基因重组技术,构建4个含人PAI-l基因不同长度5′上游序列的荧光素酶报告基因质粒,并结合瞬时转染分析实验,初步确定PAI-l基因上游具有调控作用的是位于-823到-553之间的AP-l元件。为进一步确证AP-l元件的调控作用,采用PCR法对该元件进行定点突变。结果 TNF-α能明显诱导构建质粒pGL3-PAl-l-823／ 90荧光素酶的表达,但对质粒pGL3-PAl-l-823／ 90的3个突变体诱导作用明显降低;mmLDL也能明显诱导质粒pGL3-PAI-1-823／ 90荧光素酶表达,但对质粒pGL3-PAl-l-823／ 90的3个突变体的诱导作用不明显。结论 在TNF-α、mmLDL作用下,内皮细胞转录表达PAI-l基因过程中,3个AP-l元件起着重要的作用。     

一个小型人酪氨酸羟化酶基因启动子的分离和活性分析

目的探讨酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因上游调控区的功能。方法PCR法扩增人TH基因上游片段,插入pGL3-Basic质粒,构建一个表达荧光素酶的报告基因。将报告基因瞬间转染MES23.5、293及Cos7细胞,用Dual Luciferase Assay法测定目的DNA片段的启动子活性。结果测序结果表明,分离的DNA片段长度为520bp,与人TH基因-493/+27区一致。与pGL3-Basic质粒相比较,构建的报告基因在3种细胞中显著表达(P<0.01)。结论TH基因-493/+27区具有明显的启动子活性,构建的报告基因有助于研究TH基因表达的调节。     

人牙釉质蛋白Amelotin，Ameloblastin及Enamelin基因启动子的初步研究

目的分析人釉成熟蛋白（Amelotin,AMTN）、成釉蛋白（Ameloblastin,AMBN）与釉蛋白（Ename—lin,ENAM）基因上游启动子序列,构建不同长度的基因上游启动子报告基因载体,为进一步判断启动子序列的转录调控区奠定基础。方法利用软件分析基因启动子序列,以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中。结果成功地获得了不同长度的Amelotin,Ameloblastjn及Enamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功。结论成功构建了不同长度启动子的pGL3．Basic荧光素酶报告基因载体,为进一步研究牙釉质蛋白2基因启动子的转录活性及转录调控特点奠定基础。     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的构建内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)基因启动子的报告基因重组质粒,为EOLA1启动子的分析鉴定奠定基础。方法提取人内皮细胞基因组DNA,设计引物克隆EOLA1基因上游不同长度的基因片段,插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,经限制性内切酶酶切鉴定、测序。结果成功构建了3种含有不同长度EOLA1上游基因的pGL3-EOLA1-Luc荧光素表达质粒,形成了系列的EOLA1启动子重组体。结论建立的不同长度EOLA1上游基因的报告基因系统为EOLA1启动子的活性分析奠定了基础。     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的 克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式.方法 设计引物,以小鼠肝脏组织DNA 为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic 中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc.通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7 及c2c12 细胞系,检测荧光素酶的表达情况.结果 构建的pGL3-PGC-1α-Luc 系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA 测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域（-2533~＋78）具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低.结论 成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域（-2533~＋78）具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点.     

人PDLIM4基因启动子报告基因载体的构建及其在人类肿瘤细胞中的表达

目的构建人PDLIM4基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-promoter,检测其在不同肿瘤细胞中的表达。方法据Genebank中人PDLIM4基因启动子序列分别设计上下游引物,扩增其启动子片段,并插入到pGL3-Basic报告基因载体,分别得到含有3kb和1.2kb的PDLIM4基因启动子的两个报告基因质粒pGL3-PD-LIM4-3kb和pGL3-PDLIM4-1.2kb。序列为1.2kb的启动子利用Erase-a-base试剂盒,经外切酶Ⅲ从5’端逐步酶切得到5个含不同长度启动子序列的报告基因载体:pGL3-PDLIM4-1.2D1、pGL3-PDLIM4-1.2D2、pGL3-PDLIM4-1.2D3、pGL3-PDLIM4-1.2D4、pGL3-PDLIM4-1.2D5。将构建的报告基因载体分别瞬时转染以下细胞株:Hela、MDA-MB231、KB、PC-3、LNCaP,检测其荧光素酶表达活性。结果所构建质粒经酶切、测序鉴定,其片段长度及序列均正确。转染结果显示,长片段的3kb和1.2kb启动子序列在所测试的细胞株中均有表达,但在人激素非依赖前列腺癌PC-3细胞株、人激素依赖前列腺癌LINCaP细胞株中表达较低。而不同长度的启动子报告基因质粒转染PC-3、LNCaP的结果显示,pGL3-PDLIM4-1.2kb表达活性最强,pGL3-PDLIM4-970bp表达活性最弱。结论成功构建了7个分别含有不同长度的PDLIM4启动子报告基因载体,其在不同的肿瘤细胞株中均有不同程度的表达,而在前列腺癌细胞中表达较低。     

LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的:LAPTM4B基因是肝癌中高度表达的新基因.为下一步LAPTM4B启动子的活性分性,本文构建了LAPTM4B基因启动子调控的报告基因重组表达质粒.方法:以LAPTM4B基因组cDNA为模板扩增翻译起始位点上游DNA序列.PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,并经限制性内切酶消化鉴定.结果:通过酶切鉴定和基因测序,证明成功地构建了三种不同长度的pGL3-LAPTM4B-Luc荧光素酶表达质粒,形成了系列的LAPTM4B启动子重组体.结论:充分利用生物信息学资源,利用已知基因的启动子序列,可快速,准确地克隆已知基因启动子序列并构建启动子载体.LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建为LAPTM4B启动子的活性分析奠定了基础.     

Survivin启动子的克隆及其在膀胱癌细胞BIU87中的活性鉴定

目的克隆Survivin启动子的有效片段,并检测其在人膀胱癌细胞株BIU87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的转录活性。方法用PCR扩增Survivin基因的启动子片段,克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3BSurvivin重组质粒,用脂质体法瞬时转染BIU87及SV-HUC-1中,检测Survivin启动子在细胞中的转录活性。同时构建含CMV启动子的pGL3BCMV重组质粒作为阳性对照。48h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应,检测荧光素酶活性。结果成功克隆440 bp的Survivin基因启动子,并构建了携带有Survivin基因启动子的pGL3Basic真核表达载体,转染BIU87细胞后的荧光素酶活性为2 286.98±440.21,而SV-HUC-1荧光素酶活性为12.32±1.16,两者差异有统计学意义（〈0.01）。结论本实验成功克隆的Survivin启动子在BIU87细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性,其有可能作为调控元件用于膀胱癌的靶向性基因治疗。