深圳市首例本地登革热3型病例的病原学检测与分析

目的对2016年深圳市报告的首例本地疑似登革热病例查明病因.分离鉴定病原体,从分子水平分析分离株的生物学特征.方法对疑似患者血清标本采用ELISA、胶体金免疫层析法和荧光RT-PCR方法分别检测登革病毒抗体、NS1抗原和病毒核酸,并用C6/36细胞分离登革病毒.采用RT-PCR方法扩增病毒PrM/M-E基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的登革毒株进行同源性比较和进化树分析.结果从患者血清标本中检测到登革病毒IgM抗体、NS1抗原和登革3型病毒核酸,并成功分离到登革3型病毒,将其命名为DENV3-SZ1648.深圳市登革3型病毒分离株SZ1648与登革3型国际标准株H87株、国内外流行株80-2、GWL-25株在PrM/M-E基因上核苷酸同源性分别为92.0％、91.8％和90.3％,而与登革1、2、4型国际标准株HAWAII、NGC、H241同源性分别为68.7％、64.2％和63.2％.进化树显示SZ1648株与2007年印度尼西亚分离株MKS-0098亲缘关系最近,在进化树的同一分支上,和85-159株(Indonedia 1985)、2167株(Tahiti 1989)、29472株(Fiji1992)等同属基因Ⅰ亚型.患者发病前1个月在深圳居住,无输血史、无外出史.结论从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该本地病例是由登革3型病毒引起,这也是深圳市首次报道存在本地登革3型病毒的疫情,该毒株最有可能来源于印度尼西亚.     

登革2型病毒海南分离株全长E基因的测定与分析

目的 测定我国登革2型病毒海南分离株E基因的全序列，并分析其病毒学特性和分子进化特征。方法 运用RT-PCR法扩增我国登革2型病毒海南分离株D2V—HN89)E基因，测序并用计算机分析序列，作毒株感染细胞及乳小白鼠试验。结果 D2V-HN89株E基因核苷酸全长1464bp，核苷酸和氨基酸序列与D2V—NGC株的同源性分别为95％和980A，系统树分析显示其与登革2型牙买加株及登革2型巴西90株的亲缘关系最近。D2V—HN89株的细胞病变效应与D2V—NGC株相同，但对乳小白鼠神经毒力较弱。结论 D2V-HN89株的E基因区有缺失，该流行毒株可能来源于牙买加或巴西登革热流行区。     

广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株E基因序列分析

目的测定广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株的E基因序列并进行分析。方法收集广州市2006年登革热患者急性期血清,用C6／36细胞培养分离登革病毒,RT-PCR法扩增全长E基因,测定序列并绘制系统发生树,进行生物信息学分析。结果59份标本中38份病毒分离培养阳性,获得广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株GZ2006／1707的E基因序列,其同源性与东南亚缅甸、泰国、柬埔寨等地的流行株接近,但与广州市2002年Ⅰ型登革病毒流行株GZ2002／281较远。结论广州市2006年流行的登革病毒属输入性,但与2002年流行的登革病毒有不同的输入源。     

广州4株登革1型病毒E基因的全序列测定和分子进化分析

目的 通过对广州市不同年份分离的4株登革1型病毒(DEN-1)蛋白E基因进行全序列测定及分子进化分析,了解各流行株之间的遗传差异及进化关系,追踪其可能的传染来源.方法 应用RT-PCR技术分别扩增各株病毒的蛋白E基因,克隆到pGEM-T Easy载体,转化DH5α宿主菌,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定.测序结果与国内外流行株进行同源性比较和毒力位点分析,并绘制基因系统发生树.结果 4株DEN-1病毒E基因序列长度均为1485 bp,编码495个氨基酸,核苷酸序列同源性为91%～98%,推导的氨基酸序列同源性为96.0%～99.2%.广州1995年流行的DEN-1和2002、2004、2006年流行株的毒力位点氨基酸存在差异.结论 通过对登革1型病毒E基因的进化分析,GZ01/95、GZ01/02和GZ01/04这3株同属于基因型Ⅳ,而GZ17/06属于基因型Ⅰ.1995年广州地区流行的DEN-1可能来源于印度尼西亚,而2002和2004年的流行可能与澳大利亚流行株有关.2006年广州又出现的DEN-1可能与泰国2002年的流行株输入有关.     

应用长链RT-PCR法扩增我国登革2、4型病毒株全长cDNA

目的：采用长链RT-PCR技术扩增登革2型及4型病毒基因组全长cDNA，为构建登革病毒全长cDNA克隆、表达，深入阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法：根据已测定的登革2、4型病毒全基因组序列，设计上下游引物。从感染登革病毒的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA，采用长链RT-PCR技术进行扩增。为检验扩增产物的特异性，以PCR产物为模板扩增覆盖基因组的10个片段。将含有复杂二级结构的5′非编码区扩增片段，在377A型自动测序仪进行序列分析。结果：扩增出登革2、4型病毒基因组全长近11kb cDNA分子，非编码区测序结果表明扩增产物为登革2、4型病毒所特有。结论：利用长链RT-PCR首次成功扩增出登革病毒全长cDNA分子。     

登革2型病毒NGC株E基因扩增和部分序列分析

目的 体外扩增、克隆登革2型病毒（NGC株）包膜糖蛋白E基因约1．5kb的基因片段,并对目的基因片段进行部分碱基序列测定和分析。方法 采用逆转录聚合酶链反应扩增出E目的基因片段,经限制性内切酶Kpn1/Xbal酶切后用低熔点琼脂糖挖块回收法回收纯化,插入真核表达载体pcDNA3的多克隆位点,构建重组体pcDNA3-E,转化大肠杆菌DH5a,通过对目的基因片段的部分碱基序列测定鉴定克隆的正确性,并分析其氨基酸变异。结果 从登革2型病毒（NGC株）中扩增出约1．5kb的DNA片段,目的基因片段的部分测序与参考序列的同源性为96．53％,7个氨基酸发生变异,4个变异氨基酸与登革2型病毒Jamaica株相应位置的氨基酸相同。结论 体外成功扩增并克隆DV2（NGC株）全长E基因片段,其序列变异及与其他毒株的同源性研究为登革病毒致病机理和疫苗的研究提供材料。     

广东登革3型病毒株的分离培养和鉴定

目的对2009年发生于广东地区的3例家庭聚集性登革热患者血清进行登革病毒的鉴定和病毒株的培养分离。方法用胶体金法检测患者血清中登革病毒特异性IgM、IgG抗体;C6／36细胞培养患者血清中登革病毒;RT—PCR扩增C．PrM基因序列的片段以检测患者血清中登革病毒RNA,PCR产物经序列测定后进行生物信息学分析。结果3例患者血清学检测均为登革病毒特异性IgM阳性、IgG阴性;特异性RT—PCR产物长约290bp,经琼脂糖电泳和测序分析,证实3例患者血清中均存在登革3型病毒;从1例患者血清中培养分离到了登革病毒株,经RT—PCR和测序证实为登革3型病毒。结论2009年发生于广东地区的3例登革热患者经病毒培养和分子生物学鉴定,证实均为登革3型病毒感染。     

西非登革病毒森林株的跨种传播

西非地区不断出现登革2型病毒森林株感染病例,病原学和流行病学研究显示在当地人群、蚊媒和丛林红猴体内均检测到登革病毒森林株或其抗体.当地一种在森林和乡村广泛分布具义伊蚊对登革病毒高度易感,可能是造成森林株跨种传播的关键宿主.该森林株在人体感染模型如人树突状细胞和肝癌移植小鼠中可有效增殖,与引起广泛流行的登革病毒株一致.这些发现卓显出西非登革2型病毒森林株跨种传播的可能性,及其感染人类引起广泛流行的潜在威胁.     

西非登革病毒森林株的跨种传播

西非地区不断出现登革2型病毒森林株感染病例,病原学和流行病学研究显示在当地人群、蚊媒和丛林红猴体内均检测到登革病毒森林株或其抗体.当地一种在森林和乡村广泛分布具义伊蚊对登革病毒高度易感,可能是造成森林株跨种传播的关键宿主.该森林株在人体感染模型如人树突状细胞和肝癌移植小鼠中可有效增殖,与引起广泛流行的登革病毒株一致.这些发现卓显出西非登革2型病毒森林株跨种传播的可能性,及其感染人类引起广泛流行的潜在威胁.     

我国新分离盖塔病毒的部分基因组分子特征研究

目的 通过分子生物学方法研究我国山东省2008年分离的盖塔病毒(DY0824)基因组分子生物学特征.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出结构区基因和3' UTR片段,连接到载体中进行序列测定,然后用Clustal X1.83和MegaAlign软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用Mega4软件绘制系统发生树.结果 DY0824病毒株衣壳蛋白由804个核苷酸组成,编码268个氨基酸,与国内外其他分离株的核苷酸同源性为95.4%～99.9%,氨基酸同源性为97.4%～100%.E2蛋白全长1266个核苷酸,编码422个氨基酸,与其他株的核苷酸同源性为94.8%～99.5%,氨基酸同源性为97.6%～100%.该病毒3' UTR由401个核苷酸组成,存在3个重复序列.结论 山东省新分离盖塔病毒衣壳蛋白和E蛋白基国与该病毒原型分离株相比分别存在7个和10个氨基酸差异位点,病毒3'UTR区域存在多个核苷酸差异位点.     

广东登革Ⅰ型病毒株变异性的初步研究

Objective　To study the variation of Guangdong dengue-1 virus strains. Methods　Partial nucleotide fragments in E/NS1 gene junction of 2 degue-1 isolates(LD-25, LD-26) and 1 positive sera sample (95-142) of Guangdong province collected in different years, were amplified by RT-PCR and sequenced. The 240bp sequences of the above-mentioned fragments were compared with those of other well-characterized dengue-1 strains. A divergence of 6% between the nucleotide sequences was taken as an indication for dengue virus subtype classification. Results　LD-25 and LD-36 or 95-142 may belong to two different subtypes. Dengue strains of LD-25 (1985), Thai(1980) and Taiwan of China(1987,1988) could fall into the same subtype in the light of their sequence homology ranging from 97.1% to 98.8%. The sequence homology among LD-36(1991), 95-142(1995), Philippine(1988) and three other dengue-1 virus strains ranged from 97.5% to 100%, indicating that they belonged to another subtype of dengue virus. Possible source of infection of these dengue virus strains is discussed. Conclusion　Guangdong dengue viruses may have not only one source.     

2006年广东省流感病毒流行的分子基础

目的了解广东省2006年流行性感冒（流感）流行情况的分子基础。方法选择广东省流感监测网络实验室分离的11株流感毒株,对血凝素基因进行基因和抗原性的分析。此外,还检测人群抗体水平。结果2006年流行的H1N1亚型病毒血凝素蛋白重链（HA1）区氨基酸序列与A/New Caledonia/20/99（H1N1）相比,同源性为95.7%～96.3%,有2个抗原决定簇的氨基酸发生了替换。Victoria系的HA1区基因与B/HongKong/330/2001相比,同源性为97.2%～97.5%,有6个位于抗原决定簇的氨基酸发生了替换,这种变化和B/Malaysia/2506/2004相一致,这在B型的基因种系发生树也得到证实。同时发现人群针对H1N1亚型和B/Victoria的抗体水平较低。结论2006年广东H1N1亚型和B/Victoria系病毒株发生了一定程度的变异,以及人群保护性抗体水平较低,共同造成其在本地的流行。     

Cloning,Expression and Sequence Analysis of the Classical Swine Fever Virus Nucleocapsid Protein

The DNA complementary to the 5′-terminal 1929 nucleotides of classical swine fever virus (CSFV; alias hog cholera virus, HCV) LPC vaccine strain RNA was cloned and sequenced. The sequence encompasses a 5′-noncoding region (NCR) of 264 nucleotides and an open reading frame (ORF) of 1665 nucleotides. The cloned sequence contains genes of four viral proteins, P23, nucleocapsid (core) protein, E0 and part of E1 proteins. Alignment of the 5′-terminal 1929 nucleotides of LPC strain with other strains of CSFV showed well conservation and a homology as high as 84–95% was found between these strains. The cDNA of CSFV-LPC core was cloned into an expression vector, and a fusion protein of 38.5 kDa was obtained which reacted strongly to CSFV antiserum. Purification of the core fusion protein was achieved by a single-step affinity chromatography and the purified product could be recognized by the sera of CSFV-infected swine in ELISA assay. Phylogenetic analysis of the 5′-terminal 1929 nucleotides between pestiviruses revealed that the 5′-end region seems to be suitable for differentiation of different strains of CSFV. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

贵州省一例犬伤致人患狂犬病的病原学及病毒基因分析

目的 从病原学角度证实贵州省凯里市一起犬伤人致儿童死亡病例为狂犬病所致,了解狂犬病病毒的基因特征.方法 采用dFA实验初步检测犬和患儿脑组织狂犬病病毒抗原,以RT-nested PCR检测狂犬病病毒核酸,测定狂犬病病毒N基因全长序列,根据同源性比较及系统进化树进行分子流行病学分析.结果 dFA与RT-nested PCR检测显示犬脑和人脑组织标本均为狂犬病病毒抗原和核酸阳性.经测序拼接均得到长度为1353 bp的核苷酸序列,同源性分析显示犬脑组织(GZD)和人脑组织(GZH)检出的狂犬病病毒N基因核苷酸与推导的氨基酸同源性均为100％,与我国各省已报道的狂犬病病毒基因1型流行毒株及疫苗株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.4％～99.6％和98.2％～100％,与我省往年报道的毒株N基因核苷酸和推到的氨基酸同源性最高.此外,在与疫苗株的比较中,与CNT株的核苷酸和氨基酸同源性最高.进化树分析显示犬脑和人脑组织标本狂犬病病毒N基因亲缘进化关很近,同属于基因1型狂犬病病毒.结论 从病原学和病毒分子生物学证实了贵州省一起犬伤人致儿童死亡病例为狂犬病所致,其病原为狂犬病病毒基因1型,与疫苗毒株中的CNT毒株的亲缘进化关系最近,该起病例可能为我省境内传播,因此,应加强我省狂犬病疫区的防制工作.     

云南省西南边境登革2型病毒全基因组序列特征研究

为阐明云南省西南边境地区登革2型病毒(DENV-2)流行株的全基因组序列特征及流行病学特点,采用C6/36细胞培养法分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-2的全基因组序列,采用Clastal X1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸同源性及系统进化分析。结果从登革热患者血清中分离到10株DENV-2,其中德宏州瑞丽市6株(2013年3株和2015年3株),西双版纳州景洪市2015年4株。经RTPCR和序列测定,获得这10株DENV-2的全基因组序列。基于结构蛋白和非结构蛋白基因的系统进化和同源性分析表明,这10株病毒中5株为亚洲基因Ⅰ型(AsianⅠGenotype,AG-Ⅰ),5株为全球基因型(Cosmopolitan genotype,CG)。其中2013和2015年瑞丽流行株均为AG-Ⅰ,景洪市2015年流行株均属CG,它们均与东南亚相同基因型流行株具有较高的同源性和较近的亲缘关系。云南株与DENV-2原型株(New Guinea-C)的E和NS5基因核苷酸同源性分别为93.38%~93.77%和92.80%~94.74%。所有云南株和东南亚参考株与New Guinea-C株在结构蛋白或非结构蛋白的氨基酸位点均存在一定程度的改变。本研究证实,云南省西南边境地区存在DENV-2两种基因型流行,瑞丽和景洪流行株分别为AG-Ⅰ和CG,但它们的输入来源均为相邻东南亚国家。云南株与DENV-2原型株New Guinea-C株间存在明显差异,但决定病毒抗原、致病性和毒力的关键位点未发现明显变化。     

Complete genome sequences of three rabies viruses isolated from rabid raccoon dogs and a cow in Korea

The complete genomes of three rabies viruses (BD0406CC, BV9901PJ, and 08F40) of two raccoon dogs (Nyctereutes procyonoides koreensis) and a cow were determined. The genomic organization is typical of rabies viruses, and the open reading frames of the N, P, M, G, and L genes are 1,353, 894, 609, 1,575, and 6,384 bases in length, respectively. The full genome length of the three strains was 11,928 nucleotides, and the sequence similarity between the rabies viruses at the nucleotide level was 98.5–99.5 %. Sequence comparisons indicated that these rabies viruses belong to the “Arctic and Arctic-like” group, with high homology to the Eurasian cluster. All Korean strains were clustered with the Mongolia strains, which belong to Arctic-like 1 clade. The 08F40 and BD0406CC strains were constructed with rabies virus strains isolated in Gangwon province. The BV9901PJ strain was closely related to strains isolated in Gyeonggi province in Korea. Three strains were more dependent upon geographical distribution and time period than host species. Complete genome sequencing of different host-origin rabies viruses will provide information that should contribute to understanding the transmission cycle and genetic variability of rabies from different hosts.     

中国分离乙脑病毒与灭活疫苗株(P3株)E基因差异分析

目的 分析我国近年来从蚊虫及患者标本中分离的乙脑病毒与灭活疫苗株（P3株）之间在E基因区段核苷酸及氨基酸差异。方法 从GenBank中获取相应乙脑病毒株E基因区段核苷酸序列，通过Clustal X（1．8）、DNASTAR、GENEDOC（3．2）等生物学软件进行分析。结果 P3株与福建分离株之间核苷酸同源性在98．3％-98．5％之间、氨基酸同源性在98．2％-98．6％之间；P3株与上海分离株之间核苷酸同源性在88．0％-88．5％之间、氨基酸同源性在98．0％-98．4％之间。E基因区段500个氨基酸中P3株与所有新分离乙脑病毒株之间共存在19个位点的差异，其中在E-76、E-306、E-408处所有新分离毒株与P3株存在共同的差异；在E-160、E-487处福建分离株与P3株存在共同差异；上海分离株与P3株在E-129、E-222、E-227、E-366存在共同差异。结论 上海蚊虫中分离的Ⅰ型乙脑病毒和福建省脑炎患者中分离的Ⅲ型乙脑病毒与P3株在E基因的部分氨基酸位点存在差异，但均不处在影响病毒生物学特性的关键位点。