幽门螺杆菌尿素酶B亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位的编码基因(ureB)的克隆和序列分析，为H．pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法应用PCR方法获得国内分离H．pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H．pylori的ureB基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到1．71kb的ureB基因片段，特异PCR可扩增出ureB基因片段，证实H．pylori ureB基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离H．pylori MEL-HP27的ureB基因全长1710bp( Genbank收录号：AY295085)，编码由569个氨基酸残基组成的肽链，ureB基因序列与GenBank公布的H．pylori相应基因同源性高达96．08％～98．30％，氨基酸序列同源性在98．77％．99．82％之间。结论 成功克隆了MEL-HP27菌株的ureB基因，其核苷酸序列与国际参考株NCTC11637的同源性为97．67％。     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

新近研究表明:幽门螺杆菌(Ｈｐ)的尿素酶Ｂ亚单位(ＵｒｅＢ)、热休克蛋白Ａ亚单位(ＨｓｐＡ)和空泡细胞毒素(ＶａｃＡ)均是有效的抗原成分。由于Ｈｐ属微需氧菌,培养条件要求高,难以获得大量天然来源的ＵｒｅＢ,ＨｓｐＡ,ＶａｃＡ等成分。我们运用ＰＣＲ技术克隆ＨｐｈｓｐＡ基因,并构建载体对其进行序列分析。材料与方法一、材料质粒ＰｉｎＰｏｉｎｔＴＭＸａ3购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。大肠杆菌ＪＭ109及Ｈｐ菌株系本室保存菌种。ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄⅢ(宝灵曼公司),Ｔ4连接酶,ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＰＣＲ分子量标准(华美生物工程公司)。…     

幽门螺杆菌临床分离株热休克蛋白60基因序列分析

目的分析幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床分离株热休克蛋白60基因编码区序列特征。方法对分离自我国不同地区、患有不同胃肠疾病患者的63株Hp提取基因组DNA并设计hsp60特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增hsp60基因,经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收、纯化PCR产物并测序,用DNAstar 5.0软件中的Clustal W程序对hsp60基因序列及由该序列翻译的氨基酸序列进行比较分析。结果成功特异性扩增并纯化到hsp60全基因序列。经序列比对,发现不同胃肠疾病来源的hsp60基因核苷酸序列在877、1 399以及1 579位点处存在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。其中来源于非胃癌患者的Hp在以上三位点处分别有8株(8/48,16.67%)G→A置换,9株(9/48,18.75%)C→G置换,7株(7/48,14.58%)A→G置换;胃癌患者来源的Hp在以上三位点处分别有3株(3/18,16.67%)G→A置换,1株(1/18,5.55%)C→G置换,2株(2/18,11.11%)A→G置换。将核苷酸序列翻译为氨基酸序列后,在以上三位点所对应的氨基酸序列,即293、467以及527位点处分别发生了由缬氨酸(V)到异亮氨基酸(I)、谷氨酰胺(Q)到谷氨酸(E)以及苏氨酸(T)到丙氨酸(A)的改变。结论我国Hp临床分离株热休克蛋白60基因序列存在单核苷酸多态性位点。     

携带幽门螺杆菌热休克蛋白B亚单位基因重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建和鉴定

背景：幽门螺杆菌(h.pylori)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌，以减毒鼠伤寒沙门菌为载体构建活疫苗己成为探索新型H．pylori疫苗的重要途径。目的：构建携带H．pylori热休克蛋白B亚单位(hspB)基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌。方法：应用基因工程技术将1640bp的hspB基因克隆入原核表达质粒pTrc99A。对重组质粒进行序列测定，并将测序结果与基因文库中H.pylori-hspB的基因和蛋白序列进行BLAST分析，再将重组质粒导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。结果：重组质粒经聚合酶链反应(PCR)和双酶切，证实构建了携带hspB基因的重组原核表达质粒pTrc99A—hspB，后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。所构建的重组质粒pTrc99A—hspB中所含的H.pylori-hspB与基因文库中量H.pylori-hspB基因和蛋白的同源性均为97％。结论：成功构建并鉴定了携带量H.pylori-hspB基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌，为研制H.pylori口服疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和热休克蛋白A亚单位的融合表达

目的将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因和热休克蛋白A亚单位基因融合,并实现其在大肠杆菌中的表达,为构建该菌的基因工程二价苗打下基础.方法通过交叠延伸拼接PCR法将幽门螺杆菌ureB基因和hspA基因通过(Gly4Ser)3linker连接起来,经NcoⅠ和NotⅠ双酶切后定向克隆入表达载体pET22b+的pelB前导序列下游,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL31(DE3),用1PTG诱导表达.结果幽门螺杆菌的尿素酶B亚单位基因和热休克蛋白A亚单位基因通过linker获得了融合,序列分析表明,此融合基因序列拼接正确,且是通读的.含有该融合基因表达载体的表达菌株BL31(pET-BA)在30℃经IPTG诱导表达4h后,用10%SDS-PAGE电泳分析表明,在细菌周质表达有约与预期融合基因表达蛋白大小一致的外源蛋白质表达带.结论幽门螺杆菌ureB与hspA成功地实现了在大肠杆菌中的融合表达,为进一步评价其对Hp的免疫保护效果和构建Hp二价基因工程苗打下了基础.     

幽门螺杆菌热休克蛋白的致病机理研究

幽门螺杆菌(H.pylori)与胃部疾患关系密切并可能与许多胃外疾病有关。热休克蛋白(HSP)是一类广泛分布于生物界、具有高度保守性的蛋白。H.pylori能产生多种HSP。本文就H.pylori表达的HSP的致病机理作一简要综述。     

幽门螺杆菌热休克蛋白的致病机理研究

幽门螺杆菌(H．pylori)与胃部疾患关系密切并可能与许多胃外疾病有关。热休克蛋白(HSP)是一类广泛分布于生物界、具有高度保守性的蛋白。H．pylori能产生多种HSP。本就H．pylori表达的HSP的致病机理作一简要综述。     

幽门螺杆菌HSPB基因的克隆与序列分析

幽门螺杆菌(Hp)的研究已普遍受到关注。毒力因子中,目前研究的一个热点是热休克蛋白(heat shock protein,HSP)。已知所有的Hp菌株都产生HSP,它作为分子伴侣对于Hp的生存及其致病具有重要作用。HSP位于细菌表面,具有较强的免疫原性,抗HSP免疫反应可使机体产生保护性免疫,因而存在着发展为疫苗成分的可能性。目前在我国对于Hp的HSP研究较少。因此,克隆中国菌株的HSPB基因,阐明其基因结构特征,对于研究它的生物学功能及探索其基因产物作为疫苗成分的价值有重要意义。 1 材料和方法 1.1 材料 pGEM-T克隆载体、DNA Clean Up System为Promega产品;大肠杆菌JM109、Taq DNA聚合酶购自华美生物工程公司。实验所用Hp菌株CAPMN62株由本实验室中国     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因ureI的检测、克隆及序列分析

目的:检测镇江地区幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H pylori)尿素通道蛋白基因ureI,并进行克隆和序列分析.方法:从胃十二指肠疾病患者胃黏膜组织中分离培养获得60例H pylori,PCR扩增检测ureI基因,部分菌株的ureI基因克隆至pMD18-T载体上,进行测序和序列分析.结果:60例H pylori菌株的ureI检出率为100%,成功克隆了8株来源于慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的H pylori菌株ureI并进行了序列分析.结果表明不同来源H pylori菌株之间ureI核苷酸和氨基酸序列同源性均高达95.6%以上.结论:ureI基因在H pylori中高度保守,可以作为鉴定H pylori的分子诊断标志.     

血清中幽门螺杆菌热休克蛋白抗体与胃炎性病变的相关性研究

目的　对血清中幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白 (HSP)B抗体 (IgG)的滴度与胃黏膜病理变化之间的关系进行研究 ,以探讨HSPB抗体在Hp相关性疾病中的作用。 方法　从山东胃癌高发区随机取样 10 36例 ,其中Hp阳性者 6 0 0例 ,选取 30 0例行Hp三联根治治疗。第 5年复查胃镜并留血标本 ,随机抽取诊断为Hp阴性慢性浅表性胃炎 ,Hp阳性慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡各 2 0例 ,用Westernblot法对患者血中Hp的HSPB抗体滴度进行比较。 结果　Hp阳性慢性浅表性胃炎患者的抗体滴度 (0 .5 0 5± 0 .0 6 1)高于Hp阳性萎缩性胃炎 (0 .4 4 8± 0 .10 5 ,P <0 .0 5 )及消化性溃疡(0 .4 4 7± 0 .10 9,P <0 .0 5 ) ,Hp阴性慢性浅表性胃炎的HSP抗体滴度最低。结论　血清中的HpHSPB抗体对于胃黏膜炎症的加重可能具有一定的保护作用     

幽门螺杆菌NCTC 11637 cagT基因的克隆及序列分析

目的:克隆幽门螺杆菌(H pylori)NCTC 11637 cag T(HP0532)的编码基因,并分析其核苷酸序列.方法:应用PCR技术从H pylori基因组DNA中扩增cag T编码基因片段,克隆至pGEM-T载体后,再将其定向插入pQE30载体中,双酶切鉴定筛选阳性克隆,并进行序列分析.结果:NCTC 11637 cag T基因全长843 bp(GenBank登录号为EF114758),编码280个氨基酸,与GenBank公布的其他H pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97%-99%.结论:成功克隆了cag T基因,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

幽门螺杆菌中国株cagA全长基因克隆及其分子特征分析

目的克隆幽门螺杆菌中国株MEL-Hp 27cagA全长基因,并进行分子特征分析。方法参考Hp26695基因组序列,分别针对cagA基因编码区保守序列和位于cagA基因上、下游的基因序列设计两对PCR引物,交叉分段扩增包括cagA基因编码区、5′、3′非编码区在内的全长基因序列,并对cagA基因调控序列、编码序列及源自中国的CagA分子EPIYA基序分布特点进行分析。结果Hp27cagA基因编码区长3510bp,编码1169个氨基酸。5′端非编码区长649bp,-10区、-35区分别位于起始密码子ATG上游89bp和154bp处,3′端非编码区长476bp。Hp27cagA基因编码区核苷酸序列与东亚菌株同源性为96%,与西方菌株的同源性仅为86%左右。Hp27CagA分子存在典型的EPIYA基序,属于ABD型,与国际参考株NCTC11637的AB-CCC型不同。比较源自中国的HpCagA序列的EPIYA基序分布特点,未发现中国Hp分离株之间存在CagAEPIYA基序与疾病结局(胃癌、慢性胃炎和十二指肠溃疡)的聚类关系。结论成功克隆幽门螺杆菌全长ca-gA基因;cagA基因编码区及非编码区序列存在东西方差异;未发现中国Hp分离株之间存在CagA EPIYA基序与疾病结局的聚类关系。     

Construction and identification of a recombinant live attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain carrying Helicobacter pylori heat shock protein subunit B gene

OBJECTIVE: Because Helicobacter pylori is the principal cause of chronic active gastritis and peptic ulcer disease, the present study explored the possibility of constructing a recombinant live attenuated S. typhimurium vaccine strain carrying H. pylori heat shock protein subunit B (HspB) gene. METHODS: A 1640‐bp HspB gene was cloned into a prokaryotic expression plasmid pTrc99A. After sequence analysis, the result was compared with the sequence of H. pylori‐HspB gene and protein provided by the Genebank using BLAST analysis. The identified recombinant plasmid was then introduced into a live attenuated S. typhimurium strain SL3261. RESULTS: Using polymerase chain reaction (PCR) and restriction enzyme digestion, a recombinant pro­karyotic expression plasmid pTrc99A‐HspB harboring the HspB gene was constructed and successfully introduced into a live attenuated S. typhimurium strain SL3261. Most of the H. pylori‐HspB in the recombinant plasmid pTrc99A‐HspB was consistent with the H. pylori‐HspB sequence provided by the Genebank. The exchange of A/T or C/G in the cloned sequence hardly changed the encoded amino acids; the homology for both the genes and proteins of H. pylori SS1 strain was 97%; the homology with other common H. pylori strains J99 and 26695 was 96% for both. CONCLUSION: A recombinant live attenuated S. typhimurium vaccine strain harboring H. pylori‐HspB gene was successfully constructed and verified, which may help in the development of an oral vaccine against H. pylori infection.     

幽门螺杆菌上皮接触诱导基因iceA1的克隆及序列特征

目的:克隆和分析镇江地区来源于不同疾病的(胃癌、溃疡和胃炎)幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的表皮接触诱导基因iceA1.方法:从胃十二指肠疾病患者胃黏膜组织中分离培养获得H.pylori,PCR扩增检测iceA1基因,并克隆至pMD18-T载体上,进行测序和序列分析.结果:克隆和测序了镇江地区来源于不同疾病的(胃癌、溃疡和胃炎)共12株H.pylori的i c e A1基因片段,并与标准菌株60190比对,结果显示镇江地区的H.pylori的iceA1基因中存在着3处框内缺失突变热点(780del6、809del5、914del7),这些缺失突变在溃疡和胃炎中均存在,但是胃癌株只存在809del5.对缺失片段周围的序列进行分析,这些缺失序列的两端基本都与同向重复序列相连,这可能与复制过程中滑动错配的小片段缺失模型有关.结论:iceA1序列的变异性有可能作为分析H.pylori群体遗传学的有用工具.     

幽门螺杆菌临床株粘附素HapA基因的克隆表达及在诊断中的价值

目的　构建表达幽门螺杆菌临床株粘附素 (HpaA)的重组质粒 ,在大肠杆菌中表达获得重组蛋白 ,探讨重组蛋白作为Hp抗原在感染诊断中的价值。 方法　用PCR方法从幽门螺杆菌临床株DNA中扩增HpaA基因片段。克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达 ,表达产物经纯化和Westernblot鉴定后 ,作为Hp抗原 ,ELISA法对 10 0例临床标本进行相应抗体检测 ,并与细菌培养、组织学染色和快速尿素酶试验比较来评价其应用的可行性。结果　经酶切、测序分析插入的基因片段全长 783bp ,与基因文库中的粘附素基因同源性达 98 87%。表达蛋白经SDS -PAGE分析 ,相对分子量 (Mr)约为 300 0 0 ,可溶性表达占全菌的 4 1 6 7%以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 90 %以上的重组蛋白。Westernblot证实了其免疫反应性。通过对临床病例的检测结果显示细菌培养、组织学染色、快速尿素酶试验和HpaA抗体检测的敏感性、特异性和准确性分别为 10 0 0 %和 80 9% ;10 0 0 % ;和 90 5 % ;90 5 %和 85 8% ;93 3%和 85 9% ,相差不多。结论　HpaA能在大肠杆菌中高效表达 ,具有较强的免疫反应性 ,作为检测试剂敏感性和特异性均较好 ,有望成为Hp新的非侵入性的检测方法。     

幽门螺杆菌过氧化氢酶基因的克隆、高效表达及活性评价

目的：构建高效表达幽门螺杆菌（Hp）过氧化氢酶重组蛋白的候选菌株并测定其活性。方法：用PCR方法从Hp染色体DNA上扩增过氧化氢酶基因，将其定向插入表达pET-22b(＋），并在BL21（DE3）大肠杆菌中表达，进一步利用贝尔斯－西策尔斯法测定其活性。结果：DNA序列分析表明，所克隆的过氧化氢酶基因序列与基因库公布的一致。在37℃诱导表达3h后，过氧化氢酶重组蛋白表达量占苗体总蛋白的24．4％，并显示了良好的活性。结论：本研究获得了表达高活性Hp过氧化氢酶的克隆，为深入研究其相关功能奠定了良好基因。     

幽门螺杆菌脂蛋白基因的克隆和生物信息学分析

目的完成幽门螺杆菌(Hp)郑州分离株MEL-HP27脂蛋白(lipoprotein)基因lpp20的克隆和测序;分析该基因序列的变异性和表达蛋白的化学及免疫学特征,为Hp疫苗抗原的筛选奠定基础。方法用PCR方法从MEL-HP27的染色体DNA中扩增lpp20基因片段,将其与载体pNEB193连接后,用于转化大肠杆菌JM109,通过酶切和测序鉴定重组质粒。应用生物信息学软件Omiga2.0、GeneDoc2.3和GenBank、Swiss-port数据库对7个Hp菌株(MEL-HP27、60190、Chongqing、CH-CTX1、J99、17874、26695)的lpp20基因序列进行同源性比较,并对该基因编码蛋白的主要化学特征和抗原结构域进行分析。结果Hplpp20基因的核苷酸序列长度为528bp,不同菌株间的同源性为96.0%~98.1%。lpp20基因编码的氨基酸序列长度为175aa,不同菌株间的同源性为98.3%~100%。MEL-HP27lpp20表达蛋白的分子量为19.122kDa,等电点为9.950,具有2个抗原性结构域。结论Hplpp20基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列均具有较高的保守性,但保守性低于100%,采用该基因表达蛋白作为疫苗和诊断抗原时,有必要考虑人群感染的优势菌株的遗传特征,以提高免疫保护的覆盖率和免疫诊断的敏感性。Hplpp20基因编码的蛋白具有典型抗原分子的结构特征,有望成为Hp疫苗候选抗原。