哺乳动物睾丸生精细胞的体外培养

哺乳动物精子发生是一个十分复杂的过程,影响因素众多,体外培养生精细胞一般有组织培养和细胞培养两类方法,目前,已有生精细胞成功地在体外从细线期精母细胞经2次减数分裂分化为精子细胞的报道,但 精原细胞的分化和精子细胞的成熟仍是两个难点,建立生精细胞体外培养模型有助于研究精子发生的调控机制,可用于辅助生育技术,治疗精子发生阻滞的患者,对精子发生机制的进一步阐明,也会促进生精细胞体外培养研究的发展。     

大鼠生精细胞体外培养条件的研究

目的:寻找一个最适合生精细胞体外培养的培养体系,为进一步培养人类生精细胞提供技术基础.方法:用单一酶-研磨-Percoll法制备15 d龄雄性大鼠生精细胞混悬液用于体外培养.①设计两种不同的培养条件:DMEM/F12和改良人类输卵管液(HTF)作为基础培养液,分为两组.每组根据添加不同浓度的激素分为6小组.添加的睾酮(T)和FSH浓度分别为:对照组H0(T 1 μmol/L,FSH 0 IU/L)、H1组(T 1 μmol/L,FSH 10 IU/L)、 H2组(T 1 μmol/L,FSH 25 IU/L)、H3组(T 1 μmol/L,FSH 50 IU/L)、H4组(T 1 μmol/L,FSH 100 IU/L)、H5组(T 0 μmol/L,FSH 50 IU/L). ②通过BRDU标记和流式细胞仪检测所有实验的生精细胞倍体的变化来判断其发育,进一步确认本研究使用培养条件的可靠性.结果:在生精细胞与支持细胞共培养过程中以改良人类输卵管液作为基础培养液,添加T 1 μmol/L ,FSH 50 IU/L或100 IU/L都适宜生精细胞体外培养;另通过BRDU标记及流式细胞仪检测均表明,在本研究条件下体外培养生精细胞能从初级精母细胞阶段分化到精子细胞阶段.结论:改良人类输卵管液作为基础培养液,添加浓度为50 IU/L或100 IU/L的FSH及T 1 μmol/L,最适合生精细胞的体外成熟培养.     

人类睾丸生精细胞体外培养的初步研究

目的对人类生精细胞体外培养分化、成熟进行初步研究。方法将4例患者的睾丸组织制备成生精细胞，观察生精细胞体外培养后生精细胞的分化、成熟情况。结果4例患者睾丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化、成熟。初级精母细胞能分化为精子细胞，分化率平均为0．47％～1．50％；Sa期精子细胞能变形、成熟为Sc期精子细胞，成熟率为0．93％～5．72％。结论在该研究条件下，人类睾丸生精细胞体外培养能进一步分化、成熟。     

小鼠精原干细胞生物学特征的研究

目的:探讨培养状态下精原干细胞的生物学特征,为体外鉴定精原干细胞及认识精原干细胞在体内的生物学行为打下实验基础.方法:在预先制备的骨髓基质饲养单层上接种生后6～10天雄性小鼠生精细胞,于IMDM培养基及37℃下培养,倒置显微镜观察细胞增殖行为并对增殖后的细胞进行组织学、细胞化学、免疫组化及遗传学检测.结果:培养状态下的精原干细胞增殖经历了短暂增殖期、静止期和分离增生期三个阶段,且增殖细胞呈簇、团状生长,细胞问可见明显的胞质间桥,细胞核大,核/质比高,碱性磷酸酶及C-KIT受体阳性,染色体核型为20对(40条).结论:精原干细胞具有典型的生物学行为和特征,结合行为及生物学特征可对增殖的精原干细胞进行鉴定.     

BrdU标记在大鼠生精细胞体外培养中的应用

目的探讨应用5-溴-2-脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxy-uridine，Brdu）标记检测大鼠生精细胞体外的分化、发育情况。方法采用BtdU体内标记生精细胞的DNA，免疫细胞化学法跟踪观察大鼠生精细胞在体外培养中的分化、发育情况。结果培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞。经培养后在BrdU标记的细胞中出现早期精子细胞。结论大鼠生精细胞体外培养过程中，应用BrdU标记能检测生精细胞的分化、发育情况。     

小鼠生精细胞体外长期培养及超微结构分析

目的初步探讨新生小鼠睾丸组织中生精细胞在体外培养条件下的增殖分化条件,建立有效的生精细胞体外成熟模型。方法用酶法和Percoll不连续密度梯度法分离纯化新生小鼠睾丸生精细胞,获取富精原细胞层,采用自制小鼠睾丸组织培养液对分离纯化后的细胞进行体外培养。用电子显微镜观察培养的细胞超微结构。结果新生小鼠生精细胞在用成年小鼠睾丸组织提取液配制的培养基中存活达194d。电子显微镜观察可见,培养后的细胞中含有精子细胞顶体样结构。结论采用小鼠睾丸组织制备的培养液培养的小鼠生精细胞可体外长期培养并显示出一定的分化趋势。     

睾丸生精细胞完全体外成熟培养的研究

目的在动物实验研究的基础上对人类睾丸生精细胞在体外培养分化、成熟进行初步探索,为临床治疗无精子症奠定基础.方法将14例患者的睾丸组织分离成生精细胞混悬液,采用生精细胞与支持细胞共培养或分选出初级精母细胞和精子细胞培养,观察培养前后各级生精细胞的分化或成熟情况.结果14例患者睾丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化和成熟.初级精母细胞能分化为精子细胞,分化率平均为4.54%～6.51%;Sa期精子细胞能变形、成熟为Sc期精子细胞,成熟率为3.13%～5.74%.结论人类生精细胞经体外培养能进一步分化、成熟.初级精母细胞能分化为早期精子细胞,Sa期精子细胞可变形为更成熟形式的Sc期精子细胞.甚至可以通过使用被拉长的精细胞或圆形细胞进行显微受精,以达到妊娠的目的.     

Sertoli细胞的培养及其对生精细胞支持作用的研究

本文培养幼龄大鼠Sertoli细胞,培养1周细胞纯度达95％以上,3周细胞仍保持止常形态。生精细胞和Sertoli细胞混合培养及Sertoli细胞条件培养液培养生精细胞,结果表明Sertoli细胞可通过和生精细胞在接接触及分泌调节物质对生精细胞的体外存活、增殖、分化等起着支持作用。     

大鼠睾丸支持细胞、生精细胞及管周细胞的体外团聚研究

用5、10、15、20和25天龄大鼠睾丸曲细精管分离细胞制成悬液,在体外经固体琼脂培养和旋转培养,得到圆球状和索状细胞团聚体,其主要由支持细胞组成,管周细胞包绕在支持细胞外周。10天龄以前组,在团聚体中可见到部分生精细胞,15天龄以后组的生精细胞全部位于团聚体外.表明新生大鼠睾丸支持细胞、管周细胞及生精细胞间仍保留着部分胚胎期的识别和选择性粘附能力。     

小鼠生精细胞的体外双室无血清培养

目的 探讨无血清条件下应用插入式细胞培养皿( Transwell 小室)对小鼠睾丸间质细胞 - 支持细 胞 - 生精细胞的双室培养技术。方法 取 60 日龄 C57BL / 6 雄性小鼠睾丸间质细胞和 15 日龄雄性小鼠睾丸支持细 胞与生精细胞混合细胞团双室共培养,不添加血清。每日在倒置显微镜下观察生精细胞的形态和生长情况,苏木 精染色观察生精细胞形态,染色体倍性分析检测细胞分化情况。结果 在培养 1 周后,可见圆形精子细胞出现, 2 周 后可见长形精子细胞, 3 周后可见较短鞭毛,生精细胞可存活 8 周;培养 1 周时,流式细胞术可检测出单倍体细胞, 单倍体细胞百分比随培养时间延长而增加。结论 应用双室无血清培养体系体外培养小鼠生精细胞可获得精子且 生精细胞存活时间较长。     

诱变剂诱导的精子染色体异常对胚胎发育的影响

环磷酰胺处理雄性小鼠后每周与超排卵雌鼠交配,制备分析受精卵染色,持续整个生精周期（７周）。处理组小鼠雄原核染色体出现多种畸形,最敏感期在处理后第８天,相当于诱变剂作用于睾丸精子期。处理后第８天的小鼠精子体外受精试验表明,睾丸精子期受环磷酰胺作用后精子的活力和密度及其受精能力未受显著影响,但胚胎发育受到显著阻滞（＜００１）。     

诱变剂诱导的精子染色体异常及其对胚胎发育的影响

以环磷酰胺处理雄性小鼠后每周与超排卵雌鼠交配,制备分析受精卵染色体,持续整个生精周期（７周）。处理组小鼠雄原核染色体出现多种畸形,最敏感期在处理后第８天,相当于诱变剂作用于睾丸精子期。处理后第８天的小鼠精子体外受精试验表明,睾丸精子期受环磷酰胺作用后的精子其活力和密度未受显著影响,但其对卵子的受精能力降低,胚胎发育受到显著阻滞（Ｐ＜０．０１）。     

大鼠附睾上皮细胞的体外培养与研究

目的：对体外培养的大鼠附睾上皮细胞进行动态观察与鉴定,了解体外条件下精子与附睾上皮细胞共同培养后精子活动力的变化。方法：用酶消化法对大鼠附睾上皮细胞进行培养,观察与体尾部上皮细胞复合培养的精子鞭毛摆动与前向直线运动能力变化的情况。结果：培养的细胞呈多角形态并保持其形态１２ｄ以上;电镜证实细胞表面存在微绒毛,有丰富的滑面内质网;复合培养的精子运动能力明显增加。结论：体外条件下培养的细胞具有明显上皮细胞特征,精子在复合培养后,能逐渐获得授精所必需的运动能力,从而达到功能的成熟