肾小管上皮细胞转分化中CIP4与β连环素的相互作用

目的 探讨在大鼠肾脏纤维化组织中CIP4(Cdc42-interacting protein 4)的表达和分布,以及在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)-间质细胞转分化(EMT)模型中,CIP4与β连环素(β-catenin)之间的相互作用关系.方法 体内实验用SD大鼠5/6肾切除法建立肾纤维化模型,根据Masson染色结果观察肾脏组织纤维化程度;用免疫组织化学染色观察CIP4在模型组和假手术组的表达和分布.体外实验用HK-2细胞株作为研究对象,使用TGF-β1(10 μg/L)刺激72 h建立EMT模型.Western印迹法检测E钙黏蛋白(E-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达变化,同时检测CIP4和β-catenin的表达水平;免疫荧光法观察CIP4和β-catenin在两组细胞中的共定位关系;免疫共沉淀方法检测CIP4和3-catenin之间的相互作用关系;用脂质体2000将质粒pcDNA4.0-CIP4瞬时转染至HK-2细胞,Western印迹法检测高表达CIP4对上述指标的影响,以及高表达CIP4与TGF-β1刺激对β-catenin入核的影响.结果 体内实验,CIP4在假手术组和5/6肾切除组大鼠肾组织中都有表达,在纤维化的肾脏组织中表达上调,主要分布在肾小管中,且在上皮细胞侧基底膜处聚集.体外实验,与对照组相比,EMT模型组HK-2细胞CIP4和α-SMA蛋白表达明显增高,分别是对照组的1.8倍和2.5倍,同时E-cadherin表达量减少(均P＜0.05),β-catenin表达量无明显变化.免疫荧光结果显示对照组CIP4与β-catenin主要分布于细胞膜,且在细胞膜上存在部分共定位;模型组中,CIP4与β-catenin在细胞膜上分布减少,细胞核内表达增多,细胞核内存在部分共定位现象.免疫共沉淀结果表明在以上两组细胞中,CIP4和β-catenin均存在相互作用.单独转染CIP4目的基因质粒的HK-2细胞中,CIP4与α-SMA表达上调,分别为对照组的3.5倍与1.7倍,并伴有E-cadherin表达下降(均P＜0.05),与单独TGF-β1刺激相似;高表达CIP4与TGF-βl刺激均可上调β-catenin在核蛋白中的表达,分别为对照组的2.0倍和2.5倍(P＜0.05).结论 CIP4在5/6肾切除组大鼠肾脏组织中表达上调,且主要分布于肾小管上皮细胞侧基底膜处,其与β-catenin有部分共定位,且存在相互作用,提示CIP4可能通过促进β-catenin入核,参与EMT的进程.     

上皮钙黏蛋白、α-连环素和β-连环素在乳腺癌中的表达及意义

应用免疫组织化学法检测上皮钙黏蛋白(E-cad)、α-连环素(α-cat)和β-连环素β-cat)在乳腺癌中的表达，探讨E-cad、α-cat和β-cat异常表达与乳腺癌临床病理特征之间的关系。     

转化生长因子β1诱导肾小管上皮细胞转分化的蛋白质组学研究

目的 研究转化生长因子（TGF）β1诱导肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中相关靶蛋白的表达变化。 方法 应用比较蛋白质组学方法。用双向凝胶电泳（2-DE）对TGF-β1刺激组和对照组 NRK52E细胞总蛋白进行分离。两组间差异蛋白点用质谱和数据库搜索鉴定，并用RT-PCR和Western 印迹在蛋白质和mRNA水平上进一步检测验证。 结果 鉴定出22个差异蛋白，包括与细胞骨架相关蛋白、参与物质转化和能量代谢的酶类、与蛋白翻译后修饰相关蛋白、细胞因子及其他蛋白等。应用RT-PCR验证了转胶蛋白（transgelin）、ATP合成酶α亚型、苹果酸脱氢酶、丝氨酸（半胱氨酸）蛋白酶抑制因子、泛素结合酶9（Ubc9）和表皮生长因子8在mRNA水平的表达差异，与2-DE结果一致。用Western 印迹验证了transgelin、ATP 合成酶α亚型两种蛋白的表达差异，亦与2-DE结果一致。 结论 TGF-β1刺激NRK52E细胞EMT发生过程中可诱导包括与细胞骨架相关蛋白、与翻译后修饰相关蛋白、代谢酶类及细胞因子等多种蛋白表达变化。本研究结果有助于深入理解EMT的具体分子机制及阐明肾脏疾病慢性进展的机制。     

乳腺癌中上皮钙黏蛋白和β-连环素的表达及其意义

目的　探讨乳腺癌组织中上皮钙黏蛋白和 β -连环素的表达及其临床意义。 方法　采用免疫组织化学方法检测上皮钙黏蛋白和 β -连环素在乳腺癌、癌旁乳腺组织、乳腺单纯性增生和非典型增生的表达情况 ,并进行对比。结果　乳腺癌组织中上皮钙黏蛋白和 β -连环素的异常表达率分别为 5 1.9%和 61.1%。上皮钙黏蛋白异常表达与组织学分级密切相关。β -连环素异常表达与TNM分期、腋淋巴结转移和术后远处转移显著相关。COX多元回归分析显示两种蛋白表达均未能成为影响乳腺癌预后的独立指标。结论　上皮钙黏蛋白和 β -连环素表达异常与乳腺癌的发生和发展有关 ,上皮钙黏蛋白和 β -连环素的异常表达是判断乳腺癌侵袭、转移的良好指标。     

LeftyA真核表达载体的构建及其对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化(EMT)的影响.方法 基因克隆技术构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,将其瞬时转染HK-2细胞,TGF-β1(10μg/L)刺激后,观察细胞形态变化,检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因及蛋白的表达.结果 TGF-β1刺激后HK-2细胞内E-cadherin mRNA和蛋白时间依赖性表达下调,α-SMA mRNA和蛋白时间依赖性表达上调,同时E-cadherin表达变化早于α-SMA;LeftyA蛋白可以显著抑制E-cadherin蛋白的下调表达(P＜0.05),其表达比同时间点单纯刺激组高17.6%;同时可逆转α-SMA蛋白的上调表达(P＜0.05),其蛋白表达比单纯刺激组低14.0%.结论 LeftyA蛋白可以抑制TGF-β1所致的EMT.

Abstract：

Objective To construct the eukaryotic expression vector for LeftyA and study the effects of LeftyA on epithelial to mesenchymal transition of human proximal tubular epithelial cells induced by transforming growth factor-β1 ( TGF-β1 ). Methods The pcDNA3. 1-LeftyA was constructed by recombinant DNA technique. After transfection with pcDNA3. 1-LeftyA HK-2 cells were stimulated by TGF-β1( 10 μg/L). The morphological changes, and the expression of E-cadherin, α-SMA and LeftyA mRNA and protein were observed and detected, respectively. Results TGF-β1 could markedly decrease the expression of E-cadherin mRNA and protein in HK-2 cells induced, and dramatically increase the expression of α-SMA mRNA and protein in a time-dependent manner. Forced expression of exogenous LeftyA led to a blockage of TGF-β1 -induced E-cadherin ( 17.6% ) suppression and α-SMA induction ( 14. 0% ). Conclusion Disruption of cell adherence is the beginning stage of EMT, and overexpression of LeftyA can suppress EMT induced by TGF-β1, which suggests a alprostadil role for LeftyA in TGF-β1-induced tubular EMT and renal fibrosis.     

粘附分子E-钙粘素/β-连环素在LNCaP和ARCaP亚细胞系中的差异性表达及意义

目的:检测粘附分子E-钙粘素/β-连环素(E-cadherin/β-catenin)复合体在LNCaP和ARCaP亚细胞系IF11、IA8中的差异性表达,以探讨E-cadherin/β-catenin复合体与前列腺癌转移侵袭的关系。方法:用Western印迹及免疫荧光鉴定LNCaP和ARCaP亚细胞系IF11、IA8中E-cadherin、β-catenin的表达以及分布情况。结果:Western印迹显示E-cadherin在LNCaP细胞系中表达较高,在IF11、IA8中表达缺失,β-catenin在IF11、IA8中表达显著高于LNCaP(P<0.01)。免疫荧光显示β-catenin在LNCaP细胞系中主要分布在细胞膜上,而在ARCaP亚细胞系IF11、IA8中,主要分布于细胞核中;E-cadherin在LNCaP细胞中主要分布在细胞膜上。结论:不同上皮细胞间质转化态(EMT)特性的前列腺癌细胞系中E-cadherin/β-catenin表达以及分布存在差异,β-catenin的核转位可能是诱发前列腺癌细胞系发生EMT改变的机制之一。     

黄芪通过c-met调控TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化

AB 目的：探讨黄芪对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质分泌的作用及机制。方法：体外培养正常大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）,应用倒置相差显微镜观察NRK52E细胞形态学变化;免疫组织化学染色法及实时荧光定量PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,肝细胞生长因子HGF受体（c-met）的表达;ELISA法定量检测细胞上清液中胶原Ⅰ（Col-Ⅰ）,胶原Ⅲ（Col-Ⅲ）和纤维黏连蛋白（FN）的水平。结果：TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（TEMT）,TGF-β1诱导组细胞肥大、拉长,呈长梭形,α-SMA表达明显增强,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN分泌增加（P〈0.05）。加入不同浓度黄芪后,细胞形态接近正常肾小管上皮细胞形态,α-SMA表达、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN分泌均较TGF-β1诱导组明显抑制（P〈0.05）,c-met表达较TGF-β1诱导组增加（P〈0.05）且呈剂量依赖性。结论：TGF-β1可以诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化,增加细胞外基质成分Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN的分泌;黄芪能够抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞转分化以及细胞外基质的分泌;黄芪抑制细胞转分化的机制可能与其增强c-met的表达有关。     

大肠癌黏蛋白1和β-连环素联合表达的临床意义

目的 探讨大肠癌黏蛋白1(MUC1)与β-连环素(β-catenin)表达的临床意义.方法 应用免疫组织化学法检测90例大肠癌标本MUC1与β-catenin表达,分析两种分子标志的分布类型与大肠癌临床病理的关系;进一步检验MUC1表达与β-catenin分布的关系,评价联合表达对临床预后的判断价值.结果 54.44%出现MUC1极性分布的丧失,与肿瘤浸润深度相关(P＜0.05),而58.89%出现β-catenin核转移,与大肠癌TNM分期有关(P＜0.05).MUC1与核β-catenin的联合表达与大肠癌淋巴结转移和TNM分期相关(P＜0.01);联合表达阳性者生存率显著低于阴性者(P＜0.05).结论 MUC1极性分布的丧失与β-catenin核转移相关,两者联合表达的阳性提示较差的临床预后.

Abstract：

Objective To investigate the clinical significance of combined expression of mucin 1(MUC1) and β-catenin in colorectal cancer. Methods Ninety colorectal cancer specimens were subjected to immunohistochemistry for detection of MUC1 and β-catenin. The relationships of expression patterns of these two biomarkers and clinicopathological parameters and survival were analyzed. Results Loss of polarity distribution of MUC1 was detected in 54. 44% cases and was related to depth of invasion ( P ＜0.05), and nuclear translocation of β-catenin was found in 58. 89% cases and correlated with TNM stage (P ＜0.05). The combined expression of MUC1 and nucrear β-catenin was related to lymph node metastasis and TNM stage (P ＜ 0.01 ) and also, a significantly lower survival rate (P ＜0.05 ). Conclusion Combined expression of MUC1 and nuclear β-catenin indicated a worse prognosis in colorectal cancer.     

上皮钙黏蛋白和α-连环素在乳腺癌中的表达

上皮钙黏蛋白 (E cad)是钙依赖性黏附蛋白家族成员之一 ,在维持细胞形态和调节细胞间黏附中起重要作用。我们应用免疫组织化学法检测E cad和α cat在乳腺癌及癌旁正常乳腺组织中的表达 ,探讨E cad和α cat异常表达与乳腺癌分化、增殖、转移和预后的关系。一、材料和方法1.临床资料 :取自我科 1998年 8月～ 1999年 3月手术切除的女性乳腺癌标本 5 4例 ,癌旁正常乳腺组织 2 1例作为对照研究 ,均经病理证实。乳腺癌患者年龄 3 0～ 76岁 ,平均 (4 8.5± 11.7)岁。均行标准乳腺癌根治术或改良根治术。2 .试剂 :鼠抗人α cat单克隆抗体、鼠抗人E…     

CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein 4）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的影响,并探讨其产生的机制。 方法 10 ?滋g/L TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质转分化。Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。倒置显微镜观察细胞形态的变化。根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段（CIP4-siRNA）和含野生型CIP4的重组真核表达质粒（pcDNA3.1-hCIP4）,利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞。Western 印迹法检测对照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察 E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素（wortmannin） 1 μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western 印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化。 结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功。CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,诱导了肾小管上皮细胞EMT。用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）。 结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程。     

黏着斑激酶在转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF）β1诱导的正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化（EMT）过程中黏着斑激酶（FAK）的表达及下调FAK的表达后对TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E钙黏蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、FAK mRNA和蛋白的表达及磷酸化（p）-FAK（Tyr397）的蛋白表达。应用Lipofectmine2000将FAK siRNA转染HK-2细胞,采用Western印迹观察下调表达FAK对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后,HK-2细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调,E-cadherin蛋白和mRNA表达下调。FAK蛋白和mRNA随时间的延长表达逐渐增多,48 h达到高峰。p-FAK（Tyr397）蛋白表达趋势与FAK相同。脂质体转染siRNA后FAK的mRNA和蛋白分别下调了50%和41%,下调表达FAK后可以显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞α-SMA蛋白的上调表达,逆转 E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化进程FAK蛋白表达上调,敲低FAK蛋白表达后可以部分减轻EMT的程度,提示FAK在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中发挥一定的作用。     

E-钙粘素和β-连环素在膀胱移行细胞癌的表达及其意义

目的 :探讨E 钙粘素 (E cad)和 β 连环素 (β cat)的表达与膀胱移行细胞癌病理分级、临床分期以及预后的关系。方法 :应用免疫组织化学方法检测 5 8例膀胱移行细胞癌中E cad和 β cat的表达。 结果 :5 8例中E cad和 β cat的异常表达率分别为5 0 .0 %和 5 3.5 % ,二者同时正常或异常表达者为 79.3% ,二者表达之间具有显著相关性 (P <0 .0 1) ,并且二者中至少有一个异常表达者为 6 5 .5 %。E cad和 β cat在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤中的异常表达率分别为 11.1%、5 2 .9%、78.3%和 2 7.7%、4 1.2 %、82 .6 % ,上述的异常表达率在病理分级间比较差异均有极显著性意义 (P <0 .0 1)。E cad和 β cat在浅表组、浸润组的异常表达率分别为2 0 .8%、70 .6 %和 33.3%、76 .5 % ,两组比较差异均有极显著性意义 (P <0 .0 1)。E cad和 β cat正常表达组与异常表达组之间 2年生存率差异分别有极显著性或显著性意义 (P <0 .0 1,P <0 .0 5 )。结论 :E cad和 β cat异常表达与膀胱移行细胞癌的恶性程度有关 ,可以作为检测膀胱移行细胞癌分期、分级及预后的重要指标     

上皮钙黏附素/β连环素在滑膜肉瘤中的表达及意义

目的通过研究上皮钙黏附素（Ecadherin）,β-连环素（β-catenin）以及ki-67在滑膜肉瘤中的表达变化,探讨上皮钙黏附素/β-连环素（E-cadherin/β-catenin,E-cad/cat）复合物与滑膜肉瘤的形态发生学及其进展的关系.方法采用免疫组织化学方法（ Envision 二步法）检测 Ecadherin,β-catenin 以及 ki-67 在26 例滑膜肉瘤（其中双相分化型6 例,单相分化型20 例）中的表达情况.结果 a）E-cadherin在7 例滑膜肉瘤中表达,阳性表达率为26.9%（7/26）,且主要表达在有上皮样分化区域的肿瘤细胞膜上,其表达与肿瘤的分型有关;b）β-catenin除表达于肿瘤细胞细胞膜上以外,57.7%（15/26）出现有意义的异常表达（表现为肿瘤细胞细胞浆或细胞核表达）,其异常表达与ki-67指数具有相关性（P＜0.01）.结论 a）Ecadherin/β-catenin介导了滑膜肉瘤中上皮样分化肿瘤细胞间的粘附,可能参与了该肿瘤的形态学发生;b）β-catenin的异常表达可能激活了相关信号传导通路,引起滑膜肉瘤肿瘤细胞的异常增殖,从而促进该肿瘤的发生、发展.     

核因子κB反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下，核因子κB（NF-κB）反义寡核苷酸对体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响。 方法 采用脂质体介导的方法将NF-κB反义寡核苷酸（AS-ODN）导入细胞，以TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞24 h后，用RT-PCR方法检测细胞中NF-κB mRNA及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达，用荧光光谱法分析α-SMA蛋白的表达，并以倒置相差显微镜观察细胞转分化过程的形态变化。 结果 TGF-β1诱导24 h后，HK-2细胞中NF-κB mRNA的表达显著上调，为空白对照组的8倍以上（P < 0.01）。NF-κB反义寡核苷酸导入细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的 NF-κB mRNA表达，比TGF-β1组减少75％（P < 0.05），同时，α-SMA mRNA和蛋白表达亦较TGF-β1组均明显下调（P < 0.05）。 结论 NF-κB反义寡核苷酸可抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞NF-κB的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，可能有利于肾间质纤维化的防治。     

NADPH氧化酶在转化生长因子β1诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的探讨NADPH氧化酶在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）转分化中的作用。方法用TGF-β1（10μg/L）刺激NRK-52E细胞不同时间,观察α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI- 1）及Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）的表达。部分实验中细胞在TGF-β1刺激前用NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理1 h。用激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧（ROS）的产生。用RT-PCR方法检测NADPH氧化酶p22phox、gp91phox、p47phox和p67phox亚单位mRNA的表达。α-SMA、E-cadherin、PAI-1及Col-ⅠmRNA及蛋白的表达分别采用RT-PCR、Western印迹和细胞免疫化学检测。结果TGF-β1可显著上调NADPH氧化酶p67phox亚单位mRNA的表达,8 h及24 h时分别为对照组的2.43倍及3.59倍（P〈0.01）。TGF-β1可显著促进细胞ROS的产生,5 min时已是对照组的2.5倍（P〈0.05）。DPI预处理同时可显著逆转TGF-β1诱导NRK-52E细胞ROS的产生（P〈0.05）、α-SMA的表达上调、E-cadherin的表达下调以及PAI-1和Col-Ⅰ的表达上调。结论TGF-β1可促进NRK-52E细胞增加ROS的产生。ROS介导了TGF-β1诱导NRK-52E细胞的转分化,促进肾脏纤维化。     

G肽对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞转化生长因子β1活化的影响

目的观察根据血小板反应蛋白1（TSP1）分子WSHW序列人工合成的六肽（GGWSHW，G肽）对由血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1过度活化的抑制作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞系（HK-2），以未处理HK-2细胞为正常对照，以AⅡ刺激HK-2细胞（AngⅡ组），选择合成TSP1和TGF-β1最佳刺激浓度和时间。刺激前加入10μmol／LG肽进行干预（G肽组），并以AngⅡ受体阻断剂洛沙坦（losartan）为抑制对照（ losartan组）。分别用RT-PCR和Western印迹检测TSP1和TGF-β1以及细胞外基质纤连蛋白（FN）和纤溶酶原活化物抑制剂-1（PAI-1）mRNA转录和蛋白表达。共聚焦显微镜和流式细胞仪观察TSP1和TGF-β1的表达以及两者共表达。ELISA法检测培养细胞上清液中活性TGF-β1、总TGF-β1、FN和PAI-1的分泌含量。Western印迹检测TGF-β1信号转导蛋白Smad2及磷酸化Smad2（p-Smad2）表达水平。结果AngⅡ以时间和剂量依赖方式促进HK-2细胞合成TSP1和TGF-β1（优化后分别为6h的1μmol／L，12h的0．1μmol／L）。与正常对照组比较，AngⅡ组TSP1与TGF-β1阳性共表达的细胞数上调5．4倍；总TGF-β1和活性TGF-β1水平分别增加1．8和2．0倍；p-Smad2蛋白水平明显上调；FN和PAI-1 mRNA转录水平分别上调3和1．5倍，且细胞上清液中两者含量分别增加2和1．9倍。G肽对TSP1和TGF-β1 mRNA转录和蛋白表达水平均无显著性影响，且对总TGF-β1分泌无明显抑制作用，但可显著抑制活性TGF-β1的水平。此外与losartan组比较，G肽组p-Smad2蛋白表达减少28．9％。FN和PAI-1 mRNA转录水平分别下调34．5％和26％，且细胞上清液中两者含量分别减少11％和8．9％。结论TSP1肽抑制物体外能通过有效竞争抑制TSP1致HK-2细胞的TGF-β1活化作用，并可相应下调FN和PAI-1的合成分泌。     

E-钙粘附素/β-连环素复合体对孕鼠神经干细胞迁移和归巢的影响

[目的]干细胞的微环境是影响干细跑行为的关键因素之一,微环境中的粘附分子E-钙粘附素是其重要组成部分,在微环境中扮演重要角色,它功能的发挥离不开β-连环素,常作为一种复合体研究他们的功能。本课题采用实时定量PCR技术测量神经干细胞在原代和传代4⁶代后E-钙粘附素和β-连环素的表达量是否有所变化,同时在蛋白表达水平借助流式细胞技术测量β-连环素相应的表达变化,进而判断这两种粘附分子在神经干细胞的传代过程中有何影响,为神经干细胞的迁移、植入的研究打下基础。[方法]孕鼠神经干细胞若干,为了说明前后实验细胞均为神经干细胞,本实验在取得细胞之时,立刻取少量神经干细胞行特异性Nestin染色,证明其并未分化。取一部分进行实时定量PCR检测E-钙粘附素和β-连环素的含量,毕竟这是在RNA水平借助实时定量PCR来测量的,为了佐证本结论,在蛋白水平借助流式细胞计数测量β-连环素的含量变化,β-连环素是一种胞浆蛋白,在细胞核内也有少量的表达,且核内核外保持一种动态的平衡,β-连环素处于E-钙粘附素/β-连环素复合体的核心部位,它表达的变化也间接体现了E-钙粘附素/β-连环素复合体的变化。剩余的继续培养,保持传代不分化,传代46代后E-钙粘附素和β-连环素的表达量是否有所变化,同时在蛋白表达水平借助流式细胞技术测量β-连环素相应的表达变化,进而判断这两种粘附分子在神经干细胞的传代过程中有何影响,为神经干细胞的迁移、植入的研究打下基础。[方法]孕鼠神经干细胞若干,为了说明前后实验细胞均为神经干细胞,本实验在取得细胞之时,立刻取少量神经干细胞行特异性Nestin染色,证明其并未分化。取一部分进行实时定量PCR检测E-钙粘附素和β-连环素的含量,毕竟这是在RNA水平借助实时定量PCR来测量的,为了佐证本结论,在蛋白水平借助流式细胞计数测量β-连环素的含量变化,β-连环素是一种胞浆蛋白,在细胞核内也有少量的表达,且核内核外保持一种动态的平衡,β-连环素处于E-钙粘附素/β-连环素复合体的核心部位,它表达的变化也间接体现了E-钙粘附素/β-连环素复合体的变化。剩余的继续培养,保持传代不分化,传代4⁶代,即2周左右,再一次重复前面的操作,统计前后的结果有无差别。[结果]原代及传代培养形成的克隆球进行神经干细胞特异性抗体巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色时发绿色荧光,呈阳性反应。应用实时定量PCR技术发现神经干细胞传46代,即2周左右,再一次重复前面的操作,统计前后的结果有无差别。[结果]原代及传代培养形成的克隆球进行神经干细胞特异性抗体巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色时发绿色荧光,呈阳性反应。应用实时定量PCR技术发现神经干细胞传4⁶代后,E-钙粘附素和β-连环素的含量明显增多,且差别具有统计学意义(P<0.05);相应的流式细胞技术测量β-cat的含量变化,发现β-连环素的含量也明显增多,且差别同样具有统计学意义(P<0.01)。[结论]试验中神经干细胞在传代的过程中,不论是在RNA层面还是在蛋白层面,粘附分子的表达均有提高,作者认为E-钙粘附素/β-连环素复合体的含量变化对神经干细跑传代中保持神经干细胞的稳定性起着一定作用,为进一步研究神经干细胞粘附分子对神经干细胞的迁移、增殖、分化、归巢和成熟的研究以及后续的临床应用提供了实验数据。     

虫草素通过下调TGF-β抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化

目的：探讨虫草素对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞株）,分为正常对照组（葡萄糖5.5 mmol/L,NG组）、高糖组（葡萄糖30 mmol/L,HG组）、高糖＋虫草素组（葡萄糖30 mmol/L＋虫草素10μg/ml,HG＋C组）。分别于刺激12 h,24 h,48 h后收集细胞。应用定量RT-PCR测定NRK52E TGF-β,E-cadherin,α-SMA mRNA的表达;Western印迹方法检测TGF-β、E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果：高糖刺激后NRK52E细胞的TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达明显高于正常糖组（P〈0.01）,而虫草素组TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达显著低于高糖组（P〈0.05）;高糖诱导的NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平明显降低（P〈0.01）;而虫草素组NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平显著高于高糖组（P〈0.05）。结论：虫草素可以明显抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化,其机制可能是通过下调TGF-β实现。     

Twist、E-钙黏蛋白和β-连环蛋白在结直肠癌组织中的表达及其研究

目的探讨Twist、E-钙黏蛋白和β-连环蛋白在结直肠癌组织中的表达与患者临床病理指标的关系。方法采用免疫组织化学检测60例结直肠癌和20例同期癌旁正常肠黏膜组织中Twist、E-钙黏蛋白和β-连环蛋白的表达。结果 Twist在结直肠癌组织中的阳性率53.3%显著高于癌旁正常黏膜组织0%;E-钙黏蛋白在结直肠癌组织中的阳性率35.0%显著低于癌旁正常黏膜组织100%;β-连环蛋白在结直肠癌组织中的阳性率18.3%显著低于癌旁正常黏膜组织100%。Twist、E-钙黏蛋白、β-连环蛋白在结直肠癌组织异常表达均与分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有关,与年龄、性别及肿瘤大小无关。Twist与E-钙黏蛋白和β-连环蛋白呈显著负相关。结论 Twist、E-钙黏蛋白和β-连环蛋白可能协同参与了结直肠癌的早期转移等过程,可能作为反映结直肠癌早期转移的重要生物学指标,Twist将来可能成为结直肠癌靶向治疗的一个新靶点。     

高糖通过转化生长因子β1-Smad信号传递途径诱导肾小管上皮细胞转分化

目的 通过观察高糖对肾小管上皮细胞转分化(EMT)的作用，探讨其与转化生长因子β1 (TGF-β1)的关系及糖尿病肾病肾小管间质纤维化的发病机制。 方法 以人肾小管上皮细胞株HKC细胞和高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株为研究对象。蛋白印迹法检测高糖(葡萄糖浓度分别为25和50 mmol/L)对α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白 (E-cadherin)和纤连蛋白(FN)表达的影响。酶联免疫吸附(ELISA)法检测TGF-β1的水平。Boyden小室检测HKC细胞的迁移能力。抗TGF-β1抗体中和实验分析高糖对肾小管EMT作用及与TGF-β1的关系。 结果 持续的高糖作用(96 h)能够导致HKC表达α-SMA蛋白，其中25和50 mmol/L的葡萄糖分别增加表达α-SMA 2.8倍和8.2倍；降低E-cadherin的表达；刺激合成FN。25和50 mmol/L的葡萄糖刺激HKC 12 h后，细胞培养上清液中TGF-β1浓度分别为(408.5±198.6)和(939.3±311.8) ng/L，呈剂量依赖性。抗TGF-β1抗体能够显著抑制高糖导致的HKC高表达α-SMA蛋白和FN及降低E-cadherin表达的作用。高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株在高糖的持续作用下，不能表达α-SMA和FN蛋白，E-cadherin也未见降低。细胞迁移实验表明，25和50 mmol/L高糖能够增加HKC迁移至Boyden小室膜下侧面的细胞数[(12.4±3.7)和（18.6±4.4)细胞/HP）]，与正常对照组[(3.0±0.8)细胞/HP]差异有统计学意义(P < 0.01)。抗TGF-β1多克隆抗体能够部分抑制高糖(50 mmol/L)造成的HKC细胞向Boyden小室膜下侧面的迁移[(11.9±5.2)细胞/HP]。高表达Smad7蛋白的HKC转染细胞株在高糖培养条件下迁移至Boyden小室膜下侧面的细胞数[（4.3±1.2）细胞/HP]与正常对照组差异无统计学意义。 结论 高糖能够诱导肾小管EMT，此作用与高糖刺激该细胞合成TGF-β1有关，阻止Smad信号途径能够拮抗TGF-β1介导的肾小管EMT的作用。