hNIS基因的靶向性转染介导肝癌131I治疗

目的探讨鼠白蛋白基因启动子／增强子（mAlb）调控下人钠／碘同向转运体（hNIS）基因的组织特异性表达介导^131 I治疗肝癌的可行性。方法构建mAlb调控下萤光素酶表达载体和mAlb引导下hNIS/潮酶素共表达的重组逆转录病毒载体，后者用脂质体法转染包装细胞获取重组逆转录病毒颗粒感染鼠肝癌细胞MH3924A，建立稳定表达细胞系，并在体内和体外水平评价重组肝癌细胞对^125 I的摄取和流出，以及”。I对转染后肝癌细胞的杀伤作用及在移植瘤模型中的生物分布。结果体外培养条件下，hNIS基因稳定转染细胞系摄取^125 I高出野生型肝癌细胞240倍，该摄取过程可被Na^＋／K^＋-ATP酶抑制剂哇巴因（Ouabain）和NIS特异性阻断剂NaCIO4阻断。在含3．7MBq/ml^131 I的培养液中培养7h后，重组肝癌细胞和野生型肝癌细胞存活率分别下降了86％和8％。静脉注射^131I后，重组肝癌细胞移植瘤摄取量较对照高出19．2倍，静脉注射治疗剂量的^131 I后重组肝癌细胞移植瘤的生长明显受抑制。结论证实mAlb引导下hNIS基因的组织特异性表达介导^131I治疗肝癌的可能性，但疗效有待进一步提高。     

hTPO和hNIS共转染胶质瘤细胞U251介导放射性碘摄取的研究

目的 将人甲状腺过氧化物酶（hTPO）基因及人钠/碘同向转运体（hNIS）基因共转入胶质瘤细胞系U251后,研究其摄碘能力的变化.方法 克隆、重组、包装并扩增纯化得到重组腺病毒（AdTPO）,测定病毒滴度,Western-Blotting检测重组腺病毒的表达.使用脂质体转染法将hNIS基因转染入人胶质瘤细胞系U251中,经过G418硫酸盐筛选获得稳定表达hNIS的细胞系（hNIS-U251）,为hNIS-U251组;使用重组腺病毒将hTPO基因转导入hNIS-U251中,使胶质瘤细胞获得hTPO基因（AdTPO-hNIS-U251）,为AdTPO-hNIS-U251组;未转入hTPO和hNIS的细胞为对照组（U251）.然后进行3组稳定表达细胞系体外摄125I实验及体外125I外流实验.3组间两两比较用q检验（Newman-Keuls法）.结果 AdTPO-hNIS-U251细胞、hNIS-U251细胞和U251细胞所摄取125I分别为（74 647.53±3605.88）、（55 769.96±4353.26）和（507.67±57.69）计数/min,3组间差异有统计学意义（F=836.17,P＜0.01）.AdTPO-hNIS-U251组较对照组（U251）摄125I能力增高约147倍（q=55.64,P＜0.01）,hNIS-U251组较对照组（U251）摄碘能力增高约110倍（q=41.47,P＜0.01）.AdTPO-hNIS-U251组较hNIS-U251组高约1.3倍（q=14.17,P＜0.01）.在体外125I外流实验中证实AdTPO-hNIS-U251组125I外流减慢,其有效半衰期延长至13 min.结论 将hTPO和hNIS基因共转染至胶质瘤细胞系U251后,能有效提高U251的摄碘能力.     

人钠/碘同向转运体基因转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究

目的 在体外细胞实验中证明转染人钠/碘同向转运体(hNIS)基因介导放射性碘治疗胶质瘤是有效的.方法 以脂质体转染法、用重组质粒将hNIS基因转染至人胶质瘤细胞株U251中.经过G418硫酸盐筛选获得稳定表达hNIS的细胞株(hNIS-U251),然后进行体外摄125I实验、NaClO4抑制实验、体外125I外流和内流实验,并绘制时间-放射性曲线.对经3700 MBq/L 131I处理的hNIS-U251细胞进行四甲基偶氮唑蓝(MTY)分析和流式细胞仪测定分析.两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析(LSD法).结果 hNIS-U251细胞株可以摄取碘,其摄碘能力较U251细胞提高117倍左右[2种细胞所摄取125I分别为(50 469.88±997.29)和(432.92±89.28)计数·min-1].经131I处理后,hNIS-U251细胞株的细胞增殖活性低于U251细胞株,两者S期细胞比率(SPF)差异有统计学意义(t=35.5,P＜0.001);增殖指数(PI)差异有统计学意义(t=6.33,P＜0.05).结论 131I可以被hNIS-U251细胞摄取,而且可以有效地杀伤胶质瘤细胞.     

hNIS基因转染介导Hela细胞移植瘤放射性核素显像和治疗的实验研究

Objective To explore the feasibility of imaging and treatment of cervical cancer xenograft model using 131I mediated by hNIS gene transfection. Methods The cervical cancer xenograft models were established with Hela-NIS( +) cells and Hela cells, respectively. Five Hela-NIS( +) xenograft models and five Hela xenograft models were dynamically imaged at 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 and 20 h postinjection of 131I(7.4 MBq). Five Hela-NIS( +) xenograft models were imaged at 0. 5,1,2,4,8,16, 20 and 25 h postinjection of 99TcmO4-(11.1 MBq). Twenty Hela-NIS( +) cervical cancer xenograft models were randomly divided into four groups: Three 131I treating groups and one control group. The therapeutic effects of 131I at threelevels (74,111,148 MBq) were investigated following intraperitoneal injection. Results Hela-NIS( +)human cervical cancer xenografts were established successfully in nude mice. The Hela-NIS( +) xenografts significantly accumulated radioactivity after intraperitoneal injection of 131I, and the radioactivity was persistently present until 20 h postinjection, but Hela xenografts had no radioactive accumulation. The T/B value of the Hela-NIS( +) xenografts reached 17.34 at 8 h postinjection. The imaging with 99TcmO4- showed that the radioactivity was persistently present in Hela-NIS( +) xenografts for almost 25 h. The Hela-NIS( +)xenografts shrinked after 131I treatment. The inhibition ratios of tumor growth in 111 MBq and 148 MBq groups were both significantly higher than that of 74 MBq group (t: 2.74-5.75, P ＜0.05). Conclusions Hela-NIS( +) cervical cancer xenografts in nude mice could persistently accumulate 131I and 99TcmO4- and could be treated successfully with 131 I. 131 I treatment mediated by hNIS gene transfection could be a promising cancer treatment method.     

hNIS基因转染介导Hela细胞移植瘤放射性核素显像和治疗的实验研究

目的 利用131I对转染hNIS基因的宫颈癌Hela-NIS（＋）细胞移植瘤进行显像及治疗实验研究,评价hNIS基因转染介导131I治疗宫颈癌的可行性.方法 （1）利用Hela-NIS（＋）细胞和未转染hNIS的Hela细胞分别建立荷宫颈癌裸鼠模型,进行131I及99TcmO4-显像,观察移植瘤的显影情况,并计算移植瘤部位与对侧相同部位的T/B比值.（2）通过腹腔注射法观察比较74,111和148 MBq131I对荷Hela-NIS（＋）宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用,另设不行任何治疗的对照组.用SPSS 13.0软件,样本均数间差异行t检验.结果 （1）成功构建荷Hela-NIS（＋）裸鼠移植瘤与荷Hela裸鼠移植瘤模型.131I显像示荷Hela-NIS（＋）裸鼠移植瘤部位明显放射性浓聚,注射后8 h T/B比值最高达17.34,而未转染hNIS基因的荷Hela裸鼠移植瘤部位始终未见明显的放射性浓聚.99TcmO4-显像示荷Hela-NIS（＋）裸鼠移植瘤部位在注射后25 h内持续放射性浓聚.（2）经不同剂量的131I治疗后2～3周起,各治疗组荷Hela-NIS（＋）裸鼠移植瘤生长开始受到抑制,移植瘤体积有不同程度缩小.111MBq组和148 MBq组的移植瘤抑制率差异无统计学意义（t=0.13～2.17,P＞0.05）,但二者均明显高于74 MBq组的移植瘤抑制率（t=2.74～5.75,P＜0.05）.对照组荷Hela-NIS（＋）裸鼠移植瘤持续生长.结论 荷Hela-NIS（＋）宫颈癌裸鼠移植瘤可明显聚集131I及99TcmO4-,且在较长时间内持续清晰显影;131I体内治疗效果显著.     

杆状病毒介导NIS基因放射治疗甲状腺癌的实验研究

目的探讨重组钠／碘同向转运体(NIS)基因杆状病毒介导甲状腺癌细胞放射性碘治疗的可行性。方法构建杆状病毒载体质粒(pFBNIS)并制备重组NIS杆状病毒(BacNIS)，体外感染甲状腺癌细胞，通过免疫荧光检测NIS蛋白的表达，通过动态摄碘及NaC104摄碘抑制实验观察表达蛋白的功能和特性；进行^131I杀伤细胞的克隆形成实验。结果成功构建了重组NIS杆状病毒，受巨细胞病毒(CMV)极早期基因启动子调控；BacNIS体外感染的甲状腺癌细胞表达的NIS蛋白具有摄碘功能和NaC104抑制的特性；BacNIs感染的肿瘤细胞可被^131I有效杀伤。结论BacNIS是介导肿瘤细胞摄碘的有效方法，为杆状病毒介导NIS基因治疗失分化甲状腺癌转移灶提供依据。     

hNIS基因介导碘摄取测量microRNA let-7在肺腺癌A549细胞中的表达

目的 拟建立用放射性核素测量mieroRNA(即miRNA)在肿瘤细胞中表达的新方法 ,探讨miRNA与肿瘤的关系.方法 分别克隆人钠/碘同向转运体(hNIS)及可与let-7互补结合的ras 基因的3'非翻译区(3'-UTR),即RU序列;以hNIS作为报告基因,将ras基因的3'-UTR与hNIS连接构建融合基因(hNIS-RU),使Hnis的表达受let-7的调控;同时克隆前体let-7(pri-let-7)及前体mir143(pri-mir143),转入细胞后加工形成成熟的let-7及mir143.将hNIS及hNIS-Ru分别转染肺腺癌A549细胞,转染24 h后,于培养液中分别加入37 kBq ~(125)I,1h后收集细胞并测量~(125)I计数;将hNIS-Ru分别与不同量的pri-let-7或pri-mir143共转染A549细胞,转染细胞24 h后分别测量其对Na~(125)I的摄取.结果 转染hNIS的A549细胞~(125)I摄取明显增高,是未转染A549细胞的12倍;转染hNIS-RU的A549细胞~(125)I的摄取减低,为转染hNIS A549细胞的70%,是未转染A549细胞的8倍;hNIS-Ru及pri-let-7共转染A549细胞的放射性计数进一步降低,为转染hNIS A549细胞的50%;转染hNIS-Ru不变,增加pri-let-7的转染量,~(125)I的摄取随pri-let-7的增加而降低;转染hNIS-Ru不变,共转染不同浓度的pri-mir143,A549细胞对~(125)I的摄取基本不变.结论 构建了hNIS-Ru融合基因,hNIS在细胞中的表达受let-7的调节,二者呈反比关系.初步建立了以hNIS为报告基因测量miRNA在细胞中表达的高灵敏度放射性核素新方法.     

hNIS基因的组织特异性表达介导肝癌细胞摄取99Tcm

目的探讨人钠／碘同向转运体（hNIS）基因在肝癌细胞中的组织特异性表达介导^99Tc^m摄取的可行性。方法构建鼠白蛋白基因启动子／增强子（mAlb）引导下hNIS和潮酶素共同表达的逆转录病毒载体，该重组逆转录病毒感染大鼠肝癌细胞MH3924A建立稳定表达细胞系，用^125I摄取实验证实hNIS基因的功能表达。建立肝癌移植瘤大鼠模型。在体内和体外水平评价重组肝癌细胞对^99Tc^m的摄取和流出。绘制时间-放射性曲线和体内外放射性分布图。结果重组质粒构建成功。体外培养条件下，hNIS基因稳定转染细胞系摄取^99Tc^m高出野生型肝癌细胞254倍。50μmol／L NaClO3和500μmol／L哇巴因（Ouabain）可分别使MHm AlbhNIS6细胞摄取^99Tc^m降低97．56％和88．20％（P均〈0．01）。而^99Tc^m流出迅速，有效半减期不足2min，应用^99Tc^m／γ相机系统获得了转染肿瘤的清晰图像及定量数据，注射^99Tc^m O4^-后30min，MHmAlbhNIS6细胞形成的移植瘤摄取^99Tc^m比对照组高4倍。结论证实hNIS基因在肝癌细胞中的组织特异性表达介导^99Tc^m摄取；利用^99Tc^m／γ相机系统可无创、简单、定量检测hNIS基因的表达。     

双启动子杆状病毒介导131I肿瘤靶向治疗的实验研究

目的构建由人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的N1S基因以及由早期生长应答因子1（Egr1）启动子调控的人纤溶酶原Kringle5（K5）基因的双启动子重组杆状病毒载体,探讨同时靶向肿瘤细胞与血管内皮细胞的基因治疗模式的可行性。方法将hTERT启动子和N1S基因片段以及Egr1启动子和麟基因片段分别亚克隆至杆状病毒载体,经草地贪夜蛾卵巢细胞（Sf9）包装并扩增得到重组杆状病毒（Bac—hTERT-N1S—Egr1-K5）,同时将CMV启动子调控的重组杆状病毒（Bac—CMV-NIS—Egr1-K5）以及不含NIS基因或不含硒基因的重组杆状病毒（Bac—hTERT-O—Egrl-K5、Bac-hTERT-NIS—Egr1-0）作为对照组。采用荧光定量PCR及Westernblot分析NISmRNA和蛋白在人宫颈癌细胞HeLa中的靶向表达,以及131I辐射对K5mRNA和蛋白的表达调控。通过摄碘实验、NaClO4抑制实验以及细胞增殖抑制实验验证NIS蛋白的功能及由其介导的131I抑瘤作用。通过细胞凋亡实验评估K5蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的促凋亡作用。统计学检验采用方差分析。结果成功构建重组杆状病毒Bac—hTERT-NIS—Egr1-K5。荧光定量PCR及Westernblot显示肿瘤特异性启动子hTERT介导的NIS基因仅在HeLa细胞中有表达,而在正常肺纤维细胞MRC5中无表达。131I可以调控辐射敏感启动子Egr1下游您基因的转录和翻译。细胞摄碘实验显示Bac-hTERT-NIS—Egr1-K5感染的HeLa细胞摄碘增加了5．6倍,与未加NaClO4组比,其摄碘能被NaClO4显著抑制（F=199．296,P〈0．05）。131I对Bac—hTERT-NIS—Egr1-K5感染的HeLa细胞的抑制效果明显,细胞存活率仅为38．3％。Bac—hTERT-NIS—Egrl一K5感染的HUVEC细胞在131I照射下的凋亡率（30．8％）显著高于Bac．hTERT-NIS—Egr1-0组和未加病毒组（11．2％和10．9％,F=19．926、45．409,均P〈0．05）。结论重组杆状病毒Bac-hTERT-NIS—Egrl．K5可使NIS基因在肿瘤细胞?     

钠碘转运体基因介导的肿瘤放射性核素治疗研究

钠碘转运体(NKS)是一种跨膜糖蛋白,介导碘的主动摄取,使得放射性碘用于治疗不摄碘的肿瘤成为可能。目前NIS基因已被成功转入多种肿瘤并表达出有功能的NIS蛋白,但治疗的效果并不令人满意。为此,研究者们应用不同的方法进行了改进,并收到较好的效果。     

钠碘同向转运体基因介导放射性碘治疗肿瘤的研究进展

钠碘同向转运体(NIS)作为一种细胞膜蛋白,主要存在于甲状腺滤泡细胞基底膜并介导细胞的碘转运,在甲状腺癌及非甲状腺癌的放射性碘治疗研究中备受关注.部分甲状腺癌的NIS表达水平降低或者膜蛋白定位不好,通过导入NIS基因进行膜表达,介导核素滞留于细胞内,是肿瘤治疗的新途径.但目前主要存在核素在细胞内滞留时间短而影响疗效的问题.对此,在导入NIS基因后,可通过各种方法刺激肿瘤细胞增加NIS的功能性表达而增加核素的摄取,也可通过减少核素的流出来提高其滞留,扩展NIS基因治疗的应用范围,优化肿瘤治疗.该文主要综述了NIS基因介导的肿瘤治疗研究进展.     

hNIS基因转导黑色素瘤细胞介导125I摄取的实验研究

目的 探讨克隆的人钠／碘同向转运体(hNIS)基因cDNA的生物学性能及其用于黑色素瘤放射治疗的可能性。方法 用反转录—聚合酶链反应(RT—PCR)从人甲状腺组织总RNA中扩增出hNIS基因cDNA序列，将其克隆至pUCm—T载体并亚克隆至真核载体pcDNA3中，电击法将重组质粒导入黑色素瘤细胞(B16)建立新细胞系(B16-A)，在体外培养条件下研究其对放射性碘的摄取及外流情况。结果 成功克隆了hNIS基因，建立了能稳定表达hNIS基因的新型细胞系B16—A和单转空质粒pcDNA3的细胞系B16—B。B16—A细胞的摄碘能力较趴6细胞高17倍，较单转空质粒pcDNA3细胞系B16-B高19倍。碘的外流过程十分迅速，有效半衰期(T1/2)仅10min。结论 体外培养条件下，hNIS基因转导黑色素瘤细胞其本身足以介导碘的摄取，但有效半衰期较短，有待进一步研究如何增加放射性碘的摄取量及延长其细胞内滞留时间，从而提高放射生物学效应。     

^131I对分化型甲状腺癌细胞核因子KB表达和功能的影响

目的探讨^131I对DTC细胞核因子KB（NF-KB）表达和功能的影响,以及^131I和NF-KB抑制剂Bay11-7082联合治疗的可行性。方法用不同放射性浓度^131I和不同浓度Bay11-7082处理DTC细胞,加入四氮唑盐显色,测定450nm的吸光度（A）值,用公式（A药物处理组-A空白）／（A对照组-A空白）×100％计算癌细胞存活率（A空白为空白孔的吸光度,A对照组为单纯细胞孔的吸光度）;选择癌细胞存活率约60％左右的^131I和Bay11-7082浓度进行联合实验。将^131I和Bay11-7082作用于DTC细胞6、24和48h后,提取核蛋白,分别与NF-KB结合序列探针相结合,测定450nm的A值,NF-KB的DNA结合率=（A药物处理组-A空白）／（A对照组-A空白）×100％。用Westernblot鉴定单用^131I、Bay11-7082和联合用药6h后NF-KB核蛋白相对表达水平的变化,并以B-actin作为内参对照进行半定量分析。用配对t检验、F检验和q检验进行统计分析。结果细胞存活分析发现不同放射性浓度^131I和不同浓度Bay11-7082处理后癌细胞的存活率不同（F=281．07和173．84,P均〈0．01）;单用^131I组、单用Bay11-7082组与联合用药组癌细胞的存活率分别为（67．33±5．65）％、（61．83±6．68）％和（36．67±5．35）％,差异有统计学意义（F=45．79,P〈0．01）,其中前2组分别与联合处理组相比q=8．20和8．35,P均〈0．01。DNA结合实验证实”。I可以诱导癌细胞内NF-KB结合率增高,24h为（255．33±29．86）％（最高）;而联合使用Bay11-7082后,在6、24和48h时间点能够抑制到相应刺激状态下NF-KB功能的22．10％、39．75％和43．18％,联合处理组与单用^131I组比较,3个时间点差异均有统计学意义（t：24．58、26．29和8．20,P均〈0．01）;6h时NF-KBp65功能受抑程度最明显,DNA结合率仅为（35．33±8．21）％,与对照组相比差异有统计学意义（t=28．98,P〈0．01）。半定量分析：^131I作用6h后p65和pSO相对表达水平均升高,Bay11-7082联合^131I作用6h后两者的表达水平均受到明显抑制;不同给药方式作用后p65和p50的相对表达水平差异均有统计学意义（F=100．93和193．55,P均〈0．01）,^131I组和对照组两两比较,q=4．75和8．22,P均〈0．05,联合处理组与对照组两两比较,q=30．80和22．83,P均〈0．01。结论^131I会导致DTC细胞NF-KB表达增加、功能增强,联合使用NF-（B抑制剂可以抑制这种改变,获得协同疗效。     

重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基因表达的影响

目的 探讨重组真核表达质粒pcDNA3.1/人TSH受体（hTSHR）体外转染TSHR表达下降的低分化滤泡状甲状腺癌细胞株后,细胞摄取放射性碘功能以及甲状腺癌相关基因mRNA表达 的变化.方法 pcDNA3.1/hTSHR转化DH5a感受态菌,进行扩增、酶切,再以核苷酸测序方法鉴定.体外转染pcDNA3.1/hTSHR,通过免疫荧光检测TSHR表达产物,井型γ计数仪检测摄碘率,相对定量实时荧光PCR验证其表达的TSHR蛋白功能和特性.采用SPSS 13.0软件,对计量资料行t检验.结果pcDNA3.1/hTSHR经PCR扩增hTSHR-cDNA片段约113 kb,Kpn Ⅰ和Xha Ⅰ双酶切：hTSHR-cDNA的片段约2.3 kb,pcDNA3.1（＋）的片段约5.5 kb,均同预期片段大小相符;核苷酸测序方法鉴定测序结果与GenBank中收录的hTSHR全长序列一致,表明真核表达质粒构建正确.在hTSH刺激下,转染pcDNA3.1/hTSHR细胞与转染pcDNA3.1（＋）细胞比较：（1）在甲状腺肿瘤细胞胞质、胞膜有增强的绿色荧光,（2）前者125 I摄取率是后者的2.9倍（t=28.63,P＜0.01）,（3）甲状腺碘摄取相关基因TSHR、钠碘转运体（NIS）、甲状腺过氧化物酶（TPO）、Tg的mRNA的表达分别升高1.74倍（t=5.959,P＜0.01）、7.2倍（t=3.807,P＜0.05）、2.88倍（t=4.769,P＜0.01）和2.67倍（t=6.388,P＜0.01）.结论 pcDNA3.1/hTSHR体外转染甲状腺癌肿瘤细胞后,可有效提高碘的摄取;这可为放射性碘治疗失分化甲状腺癌提供新的实验依据.     

重组NIS基因腺相关病毒的制备及其在甲状腺癌细胞系表达

目的探讨钠碘同向转运体（NIS）基因介导的甲状腺癌基因治疗的可行性。方法构建腺相关病毒载体质粒pGA—NIS，并采用磷酸钙沉淀法制备重组NIS基因的腺相关病毒rAAV—NIS，体外感染甲状腺癌细胞系FTC-133、8505C后，通过免疫荧光检测被感染细胞的NIS蛋白表达，并通过摄碘实验及NaClO4摄碘抑制实验验证其表达的NIS蛋白功能和特性。结果成功制备了重组NIS基因的rAAV—NIS，其感染肿瘤细胞所表达的NIS蛋白位于细胞膜上，且具有介导碘摄取的功能，以及被NaClO4抑制的特性，表明与正常甲状腺细胞的NIS具有相同的功能和特性。感染细胞的碘摄取较未感染细胞明显增高。结论rAAV—NIS能介导甲状腺癌细胞的碘摄取，为甲状腺癌NIS基因介导的基因治疗提供了实验依据。