核酶抗病毒、抗肿瘤作用的研究进展

核酶 ( Ribozyme)是一类独特的 RNA分子 ,具有自我剪切和催化性质 ,人们已成功地设计、合成了核酶 ,将其应用于抗病毒、抗肿瘤研究 ,并取得了很大的进展。现将核酶在这一方面的研究应用作一简要概述。核酶在肿瘤治疗中的作用1　核酶与癌基因　核酶独特的切割目的基因的方式有可能阻断癌基因的表达 ,从而逆转肿瘤细胞恶性增殖 ,并诱导其分化和凋亡。早在 1 992年 ,Kashami等采用核酶技术应用于人膀胱癌细胞系中 ,发现该肿瘤细胞的致病性和转移性均降低[1 ] 。近几年 ,国内一些机构也先后开展了这方面的工作。范毓东等研究发现切割 bcl-2m …     

核酶与抗病毒基因治疗

<正>核酶是1981年由Cech和Alfman在研究四膜虫mRNA前体的剪接中首先发现的。此二人由此获得1989年的诺贝尔奖。核酶是一类具有酶催化活性的RNA分子,它可与相应的特异序列的RNA底物结合,行使其切割功能。核酶切割RNA不仅是其自身的主要功能特点,也是其用于阻断基因表达和抗病毒治疗的主要依据。目前,研究人员多以人工手段合成具有催化     

乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响

惭型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。方法 利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶构建Ｒｚ１核酶自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１）,观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。结果 核酶自剪切转录载体体２上转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪     

核酶在肿瘤基因治疗中的应用

核酶(ribozyme)是一类具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地与靶RNA序列结合并加以切割，人工设计合适的核酶可实现对失控基因或有害基因表达的有效阻断，从而对疾病进行基因治疗。本文对核酶的结构与作用原理及核酶在肿瘤基因治疗中的应用作一综述。     

脱氧核酶的研究进展

自发现groupⅠ内含子的自我切割和连接活性以来,已进行了大量关于核酸催化活性的研究.通过体外筛选技术又发现一些短的单链DNA具有化学催化活性,这些人工合成的DNA核酶,或称脱氧核酶,具有高效的催化活性和结构识别能力.迄今为止已发现了几十种脱氧核酶,至少能催化7种化学反应.其中最特别的是一种能特异切割RNA的高效通用的脱氧核酶--10-23 DNA核酶.它包括一个催化结构域和两翼的识别结构域.迄今为止在脱氧核酶的应用方面,特别是作为基因表达抑制剂在基因治疗方面,取得了较大的进展.     

抗HPV16E6核酶和抗HPV18E6核酶的设计与表达

以核酶的锤头结构为模型，采用计算机软件针对ＨＰＶ１６Ｒ６、ＨＰＶ１６Ｅ６基因，设计了相应的ｒｉｂｏｚｙｍｅ。体外合成ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因后，克隆于带自身修剪功能的原核质粒ＰＲＧ５２４中，构建成质粒ｐＲＧ１６ＨＲ、ｐＧＲ１８ＨＲ，为下一步研究抗１６ＨＲ，抗１８ＨＲ的体外活性效应，从而为探索以ｒｉｂｏｚｙｍｅ治疗ＨＰＶ相关性肿瘤的途径打下基础。     

核酶在抗病毒基因治疗中的设计策略

核酶 (ribozyme)是一类具有催化活性的RNA分子 ,可通过碱基配对特异地与相应的RNA底物结合 ,并在特定的位点切割底物RNA分子。自美国科学家Cech和Altman等发现核酶至今的 2 0多年来 ,人们利用核酶可以特异性地切割靶RNA序列的特点 ,通过设计合适的核酶阻断特定基因的表达 ,已相     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗的影响

目的：研究抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗敏感性的影响。方法：以脂质体法将抗HPV16E6－Ribozyme，空载体质粒分别导入CaSKi细胞，命名为CaSKi-R,CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在我的表达，Northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达。用克隆形成试验控制3种细胞对化疗的敏感性，Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率。结果：点杂交证实核酶能在CaSKi－R细胞中稳定表达，Northern杂交证实CaSKi－R中表达E6较CaSKi－P，CaSKi明显降低。CaSKi－R细胞的生长速率较CaSKi－P，CaSKi明显减慢，泰索作用后相对克隆形成率和凋亡率在3种细胞间亦无差异（P＞0．05）；顺铂作用后CaSKi－R细胞的相对克隆形成率较CaSKi－P，CaSKi明显下降（P＜0．01），而凋亡率明显增加（P＜0．01）。结论：转染抗HPV16E6－ribozyme的CaSKi－R细胞出现一定程度的生长抑制，且对顺铂的敏感性增加，而对泰素的敏感性没有发生改变。     

脱氧核酶对伯基特淋巴瘤细胞P3HR-1增殖和凋亡的影响

目的:探讨EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1,LMP1)基因特异性的脱氧核梅(DNAzyme)对伯基特淋巴瘤细胞P3HR-1的增殖和凋亡的影响。方法:设计合成针对EBV-LMP1基因的DNAzyme(DZ1),在P3HR-1细胞上观察其对细胞增殖活性、细胞周期和细胞凋亡的影响。结果:脱氧核酶DZ1作用于P3HR-1细胞后,可显著抑制EBV-LMP1基因的表达,并呈剂量依赖性。将脱氧核酶DZ1抑制LMP1的表达,进而下调抗凋亡蛋白Bc1-2的表达,诱导细胞色素c释放,从而诱导细胞凋亡。结论:在P3HR-1细胞中,靶向LMP1可能成为潜在的基因治疗的分子靶,靶向LMP1的脱氧核酶可能成为EB病毒相关肿瘤基因治疗实验研究的新的工具。     

抗肿瘤核酶的研究进展

20世纪 8 0年代初 ,由美国科学家Ｃｅｃｈ和Ａｌｔ ｍａｎ发现了核酶 (Ｒｉｂｏｚｙｍｅ) ,它是一类具有生物催化活性的ＲＮＡ分子 ,可通过碱基配对特异性地与靶ＲＮＡ底物结合 ,定点切割ｍＲＮＡ靶分子 ,是一类很有希望的基因功能阻断剂 ,被形象地称为“分子剪刀”。它在抗病毒、抗肿瘤等领域的应用研究是目前基因治疗中的一个热点。本文简述核酶在抗肿瘤应用中的研究进展。1　核酶抗ｒａｓ基因ｒａｓ癌基因在细胞发育和肿瘤发生中起重要作用。ｒａｓ基因家族有Ｈ -ｒａｓ、Ｎ -ｒａｓ和Ｋ -ｒａｓ ,它们编码的蛋白质参与信号传导途径。肿…     

抗人乳头瘤病毒16型E6基因核酶对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响

目的研究抗HPV16E6核酶(Ribozyme)对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响.方法以脂质体法将抗HPv16E6-Ribozyne、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R和CaSKi-P细胞.点杂交检测核酶在细胞中的表达,northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达;细胞生长曲线检测细胞生长的改变;TRAP-Elisa法检测端粒酶活性.结果点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P和CaSKi明显降低.CaSKi-R细胞生长速度较CaSKi-P和CaSKi明显减慢(P＜0.01);CaSKi,CaSKi-P和CaSKi-R三种细胞的端粒酶活性分别为0.89±0.14,0.90±0.11,0.36±0.06,转染了抗HPV16E6核酶的CaSKi-R的端粒酶活性的抑制率为59.55%.经统计学处理,CaSKi-R的端粒酶活性较CaSKi和CaSKi-P细胞明显下降(P＜0.01).结论转染抗HPV16E6-Ribozyme的CaSKi-R细胞出现一定程度的生长抑制,端粒酶活性较前明显下降.     

抗HPV_(16)E_6核酶和抗HPV_(18)E_6核酶的设计与表达

以核酶（ribozyme）的锤头结构为模型，采用计算机软件针对HPV16R6、HPV18E6基因，设计了相应的ribozyme（简称抗16HR、抗18HR）。体外合成ribozyme基因后，克隆于带自身修剪功能的原核表达质粒pRG523中，构建成质粒pRG16HR、pGR18HR，为下一步研究抗16HR、抗18HR的体外活性和内效应，从而为探索以ribozyme治疗HPV相关性肿瘤的途经打下基础。     

EB病毒核抗原-1特异性核酶对成淋巴细胞系肿瘤形成能力的影响

目的 探讨腺病毒载体介导的ＥＢ病毒核抗原－１（ＥＢＮＡ－１）特异性核酶对成淋巴细胞系（ＬＣＬｓ）在严重的联合免疫缺陷（ＳＣＩＤ）小鼠体内致瘤性的影响,方法 用分子克隆技术构建ＥＢＮＡ－１核酶（ＲＺ１）及其无活性诱变体（ＲＺ１ ｍｕｔ）的重组腺病毒表达载体（Ａｄ．ＲＺ１和Ａｄ．ＲＺ１ｍｕｔ）。通过同源重组方式在２９３细胞生成腺病毒,并通过噬斑形成进行分离建立ＬＣＬ。将感染重组腺病毒的ＬＣＬ细胞注射于     

特异性脱氧核酶对小鼠呼吸道合胞病毒感染的抑制作用

目的 研究特异性抑制呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)N基因的脱氧核酶DZ1133在小鼠体内对病毒复制和气道炎症的影响.方法 RSV感染BALB/c小鼠滴鼻给予DZ1133及其变异体、反义寡核苷酸AS1133,空斑形成实验检测肺组织病毒滴度,RT-PCR检测病毒mRNA表达,支气管肺泡灌洗液白细胞计数,ELISA检测TNF-α、IL-12、IFN-γ和IL-10水平,肺组织病理学分析炎症情况.结果 0.2、0.4 mg和0.8 mg DZ1133治疗组小鼠肺组织病毒滴度分别为(2.75±0.21)×105、(1.86±0.20)×105PFU/g和(1.02±0.22)×103PFU/g,与感染对照组小鼠(7.94±0.42)×105PFU/g比较明显下降(P<0.01),上述各剂量治疗组小鼠肺组织病毒mRNA表达与感染对照组比较分别下降30.51%、47.38%(P<0.05)和53.97%(P<0.01).0.4 mg DZ1133治疗降低RSV感染小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞总数,改善肺组织病理学损伤(P<0.05),对TNF-α、IL-12、IFN-γ和IL-10水平无显著性影响(P>0.05).结论 特异性脱氧核酶DZ1133在小鼠体内有效抑制RSV复制、减轻气道炎症,是有效的抗RSV途径.     

抗乙型肝炎病毒特异联合型核酶的体外切割作用

目的：探讨单一及多位点核酶对乙型肝炎病毒靶ＲＮＡ的切割作用。方法：利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶及特异联合型核酶,构建三个核酶各自及三个核酶串联的自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１２３）观察单一及串联核酶（Ｒｚ１２３）对靶ＲＮＡ的切割作用。结果：构建的串联核酶自剪切转录载体体外转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪切靶ＲＮＡ,串联     

核酶及突变核酶在体外对HBV mRNA的切割作用

目的：探讨多位点核酶对乙型肝炎病毒（HBV）信使核糖核酸（mRNA)的切割作用，以及保守碱基突变后对切割活性的影响。方法：利用计算机辅助设计针对HBV C区基因的多位点核酶及保守碱基突变的双位点核酶，构建多位点核酶及双位点突变核酶的自剪切载体（pGEMRz123,pGEMmRz12)，观察核酶及突变核酶对RNA的切割作用。结果：构建后的多位点串联核酶及突变核酶的自剪切转录载体在体外转录后，其顺式核酶可发生自剪切，并可将目的的核酶释放出来。多位点核酶对HBV mRNA有明确的切割作用，而保守碱基突变后对HBV mRNA则无切割作用。结果 ：抗HBV多位点酶在体外可明确切割HBV靶RNA，突变后的核酶无切割活性，保守碱基为核酶保持活性所必需。     

中药抗病毒作用研究进展

许多病毒感染性疾病不仅传染性强,而且病死率高。目前尚缺乏理想的抗病毒西药,而有些中草药对病毒有一定的抑制作用,成为近年来医学研究的热点。本文综述中药抗呼吸道、消化道、肝炎、单纯疱疹病毒作用的研究进展,认为具有抗病毒作用的某些中药在抑制病毒复制的同时,还可以延缓细胞病变,且可以提高机体诱生干扰素的能力。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗的影响

目的研究抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗敏感性的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6-Ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R、CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达,Northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达。用克隆形成试验检测3种细胞对化疗的敏感性,Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率。结果点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,Northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P、CaSKi明显降低。CaSKi-R细胞的生长速率较CaSKi-P、CaSKi明显减慢,泰素作用后相对克隆形成率和凋亡率在3种细胞间亦无差异(P>0.05);顺铂作用后CaSKi-R细胞的相对克隆形成率较CaSKi-P、CaSKi明显下降(P<0.01),而凋亡率明显增加(P<0.01)。结论转染抗HPV16E6-ribozyme的CaSKi-R细胞出现一定程度的生长抑制,且对顺铂的敏感性增加,而对泰素的敏感性没有发生改变。     

抗肿瘤多药抗性核酶转录质粒的构建及其体外切割研究

目的 探讨体外核酶对肿瘤多药抗性相关基因ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ的锤头状核酶（ｒｉｂｏｚｙｍｅ），并构建抗ｍｄｒｌ－ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶分子的体外转录质粒，进行体外切割实验。结果 发现抗ｍｄｒ１－ｒｉｂｏｚｙｍｅ能较好地切割ｍｄｒｌ－ｍＲＮＡ。结论 抗肿瘤多药性核酶的体外研究为基体内应用提供了参考，ｒｉｂｏｚｙｍｅ有可能成为逆转肿瘤多药抗性的新药物。     

重组HDV核酶逆转录病毒的生产及对HBV抑制效率的测定

目的:构建含HDV核酶基因的重组逆转录病毒载体,包装出逆转录病毒实现其在HepG2215细胞中稳定表达,并研究其是否抑制HBV的复制。方法:应用PCR方法扩增HDV核酶基因,克隆入逆转录病毒载体pMSCV/U6中,用脂质体法转染逆转录病毒载体包装细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,用PCR和药物抗性水平传播分析检测野生型辅助病毒。收获的病毒感染HepG2215细胞,用酶联免疫实验测定对HBV的抑制率。结果:重组逆转录病毒载体的酶切鉴定片段约为73bp,与预期值一致。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×10⁶ CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒,对HBV的抑制率最高可达61.56 %。结论:成功构建重组逆转录病毒载体,在包装细胞系中能生产出高滴度的逆转录病毒,能有效的抑制HepG2215细胞内HBV的复制,为HBV的基因治疗提供了实验数据。