甲氨蝶呤对脂多糖诱导的大鼠脊髓神经胶质细胞pIκBα-NF-κBp65-炎性因子通路的影响

目的 观察甲氨蝶呤对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的大鼠脊髓神经胶质细胞pIκBα-NF-κBp65-炎性因子通路的影响。方法 脊髓组织块法培养神经胶质细胞。将分离的神经胶质细胞接种于多孔板培养48 h后,分为空白对照组、LPS组、LPS+pIκBα抑制剂组、LPS+甲氨喋呤组。随后应用免疫印迹法测定各组分的pIκBα与胞核及胞浆NF-κBp65水平变化,酶免疫法（ELISA）测定炎性因子TNF-α、IL^-1β、IL-6含量。结果 神经胶质细胞经LPS诱导后,pIκBα、胞核NF-κBp65和细胞上清液炎性因子TNF-α、IL^-1β、IL-6水平均显著增加（P<0.05或P<0.01）。甲氨喋呤可明显抑制经LPS诱导的神经胶质细胞pIκBα水平,显著降低胞核NF-κBp65水平和细胞上清液炎性因子TNF-α、IL^-1β、IL-6的含量（P<0.05）。结论 甲氨喋呤对LPS诱导的脊髓神经胶质细胞pIκBα-NF-κBp65-炎性因子通路有显著的抑制作用。     

柚皮苷通过P38 MAPK/NF-κB通路抑制脂多糖致HaCaT细胞炎症反应

目的 探讨柚皮苷通过P38 MAPK/NF-κB通路对脂多糖（LPS）致HaCaT细胞炎症损伤的抑制作用。方法 LPS（0、0.1、1.0、10.0、20.0 μg/mL）孵育24 h刺激人永生化角质细胞HaCaT,模拟银屑病模型,MTT法观察细胞存活率变化,Western bloting法检测白介素（IL）-6和NF-κB蛋白表达;MTT法观察柚皮苷（0、5、10、20、40、80、160、320μmol/L）作用24 h对HaCaT存活率的影响;选择LPS、柚皮苷最佳作用浓度。柚皮苷（20和40 μmol/L）作用银屑病模型HaCaT细胞24 h,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测IL-6、IL-1β、IL-17和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA表达水平变化;Western blotting法检测细胞核内转录因子NF-κB p65、P38 MAPK磷酸化蛋白水平以及炎症因子IL-6蛋白水平。结果 LPS增加HaCaT细胞存活率,并上调NF-κB p65和IL-6蛋白表达,呈剂量相关性,炎症反应在20 μg/mL达到高峰;5~160 μmol/L柚皮苷对HaCaT细胞无明显毒性作用。与模型组比较,柚皮苷能够显著抑制炎症因子IL-6、IL-1β、IL-17和TNF-α的转录水平（P<0.05）;同时能够显著抑制LPS诱导的NF-κB p65和P38 MAPK磷酸化蛋白水平、抑制IL-6蛋白的表达（P<0.05）。结论 柚皮苷抑制脂多糖致HaCaT细胞炎症反应,发挥改善银屑病的作用,机制可能与抑制P38 MAPK/NF-κB信号通路有关。     

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路研究三叶香茶菜含药血清对枯否细胞活化的影响

目的 研究三叶香茶菜含药血清(isodon ternifolius-containing serum，ITS)通过Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的大鼠原代肝枯否细胞(Kupffer cell，KC)活化的影响。方法 分离培养大鼠原代KC，将LPS诱导的大鼠原代KC分为空白对照组、模型对照组、空白血清组、阳性对照组(秋水仙碱含药血清组)、ITS组、TLR4阻断剂组、TLR4阻断剂+ITS组。MTT法检测不同浓度ITS对KC增殖活性的影响；ELISA法检测KC细胞上清液白介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)含量；荧光定量聚合应(PCR)、Western blotting和免疫荧光检测KC中TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路中TLR4、核因子κB抑制蛋白α(IκBα)、半胱肽氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、NLRP3 mRNA和TLR4、IκBα、磷酸化IκBα(p-IκBα)、Caspase-1、NLRP3、NF-κBp65蛋白表达情况。结果 与模型对照组相比，各药物组KC上清液中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6含量，以及细胞中TLR4、IκBα、Caspase-1、NLRP3 mRNA和TLR4、IκBα、p-IκBα、Caspase-1、NLRP3、NF-κBp65蛋白的表达均下调或降低(P<0.05或P<0.01)；与TLR4阻断剂组比较，TLR4阻断剂+ITS组上述多数指标的改善更加明显。结论 三叶香茶菜可能通过下调TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路抑制KC活化，减少炎性因子的表达和释放，从而减轻肝脏炎症损伤。     

仙茅苷对脂多糖诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移及表型转化的影响

目的 观察仙茅苷（curculigoside,Cur）对脂多糖（LPS）诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）发生细胞增殖、迁移以及促进其表型转化的影响,并对其机制进行初步探讨。方法 体外分离培养大鼠血管平滑肌细胞,将血管平滑肌细胞 随机分为对照组、脂多糖组、脂多糖+不同浓度仙茅苷组及仙茅苷组。采用噻唑蓝(MTT)比色法观察并计算各组细胞增殖率;采用细胞划痕实验观察并计算细胞迁移率。应用 Western blot法检测各组细胞内α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）及核转录因子κB（NF-κB）信号通路相关蛋白表达情况。结果 与对照组相比,脂多糖组细胞增殖率、迁移率及细胞内核转录因子κB及基质金属蛋白酶9蛋白表达水平明显提高（P<0.001）,而α-平滑肌肌动蛋白表达明显降低（P<0.001）;与脂多糖组相比,脂多糖+仙茅苷组细胞增殖率、迁移率以及细胞内基质金属蛋白酶9、核转录因子κB蛋白表达水平明显下降（P<0.001）,α-平滑肌肌动蛋白表达水平明显上升（P<0.001）。结论 仙茅苷可明显抑制由脂多糖诱导的血管平滑肌细胞表型自收缩表型向合成表型转化,进而抑制血管平滑肌细胞的增殖与迁移能力。其作用机制可能与核转录因子κB信号通路相关。     

甘草酸苷通过MAPK p38/NF-κB通路对炎症后色素沉着的抑制作用

目的 探讨甘草酸苷对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激后角质形成细胞分泌COX-2/PGE₂和对共培养黑素细胞合成黑素的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 以人表皮角质形成细胞为对象,分为对照组、LPS组、甘草酸苷组（2,5,10 μmol·L^-1）。采用ELISA法检测PGE₂的含量,Western blot检测细胞COX-2、NF-κB p-p65、p-IKKα/β和MAPKp-p38蛋白的表达,比色法检测共培养黑素细胞的黑素含量。结果 与对照组比较,LPS显著增加角质形成细胞COX-2、NF-κB p-p65、p-IKKα/β、MAPK p-p38蛋白表达（P<0.01）和PGE₂的分泌（P<0.01）,增加共培养黑素细胞黑素生成（P<0.01）。与LPS组比较,甘草酸苷呈剂量依赖性抑制COX-2、NF-κB p-p65、p-IKKα/β、MAPK p-p38蛋白表达（P<0.05）和PGE₂的分泌（P<0.05）,减少共培养黑素细胞黑素生成（P<0.05）。结论 甘草酸苷通过抑制角质形成细胞MAPK p38/NF-κB通路,从而降低COX-2/PGE₂的表达,减少共培养黑素细胞合成黑素。     

延龄草苷对脂多糖刺激的小胶质细胞炎症抑制作用

目的 探讨延龄草苷（trillin）对小胶质细胞（BV-2）的炎性激活的抑制作用。方法 不同浓度的延龄草苷孵育0.5 h,然后用脂多糖进行刺激,培养24 h后收集上清,Greiss法检测NO浓度;CCK-8检测延龄草苷对小胶质细胞活力的影响;Elisa检测肿瘤坏死因子（TNF-α）的浓度;实时定量PCR（RT-PCR）检测TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-1、COX-2基因的表达。结果 在不影响细胞活力的前提下,延龄草苷能明显抑制NO的释放,同时能抑制激活诱导细胞死亡,能明显抑制TNF-α的产生,能明显抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2 mRNA的表达,但是不能抑制COX-1 mRNA的表达。结论 延龄草苷可以抑制LPS诱导的小胶质细胞的炎性激活,抑制炎性基因的表达。     

柚皮苷通过减轻氧化应激降低急性肺损伤小鼠内皮通透性的研究

目的 研究柚皮苷对脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤模型肺微血管内皮通透性及气道炎症的改善作用。方法 将66只C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、模型组、地塞米松组及柚皮苷40、80、120 mg/kg组,每组11只。对照组小鼠正常饲养;模型组和给药组小鼠麻醉后给予LPS滴鼻,每只小鼠滴鼻50 μL。柚皮苷40、80、120 mg/kg组和地塞米松5 mg/kg组在LPS滴鼻前分别ig相应剂量的柚皮苷和地塞米松,连续给药5 d,滴鼻后继续ig相应剂量的柚皮苷和地塞米松,连续给药2 d。对照组和模型组同时间ig 0.2 mL生理盐水。苏木精–伊红（HE）染色观察肺实质病理变化;血常规分析仪检测血液及肺泡灌洗液淋巴细胞、中性粒细胞、血细胞、血小板数量;ELISA检测肺泡灌洗液白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量和血清内皮素-1（ET-1）水平;肺组织伊文思蓝成像分析肺泡–血管通透性,qPCR检测紧密连接蛋白紧密连接蛋白-1（ZO-1）、密封蛋白（OCLN）、血管内皮钙黏素（VE-cadherin）、β-连环蛋白（β-catenin）和水通道蛋白AQP1、AQP5的mRNA表达水平;化学分析法检测血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）水平。结果 与模型组相比,柚皮苷120 mg/kg组能够显著改善LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺水肿及肺组织炎症浸润的病理状态,减少肺泡内炎症细胞数量、炎症因子和总蛋白含量,以及肺组织伊文思蓝渗入量;增强紧密连接蛋白和水通道蛋白表达;减缓血液炎症细胞流失,降低血管氧化应激水平（P＜0.05）。结论 柚皮苷能够减轻LPS诱导的气道炎症,并可能通过降低血管氧化应激水平减少对紧密链接蛋白和水通道蛋白的损害作用从而改善肺内皮高通透性。     

二氯乙酸钠对氧糖剥夺损伤的BV2细胞的保护作用及其机制研究

目的 研究二氯乙酸钠（dichloroacetate,DCA）对氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）损伤模型中小鼠小胶质细胞（BV2细胞）的保护作用,并探讨其作用机制。方法 将BV2细胞分为3组：对照组、OGD组、DCA治疗组,通过OGD 4 h建立损伤模型。CCK-8和流式细胞仪检测细胞凋亡及ROS和NO的表达,Western blot检测NF-κB通路相关蛋白表达水平。结果 CCK-8及流式细胞检测结果表明,DCA可显著降低OGD诱导的BV2细胞凋亡,并且减少OGD后细胞中活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）的表达（P<0.05）。Western blot结果显示,DCA可显著影响OGD损伤介导的BV2细胞JNK、I-κB和NF-κB蛋白表达水平（P<0.05）。结论 DCA对OGD损伤的BV2细胞具有保护作用,其机制与抗凋亡、抗氧化和抗炎作用有关。     

双氢青蒿素通过抑制炎症反应在血管重塑中的作用机制研究

目的 探究双氢青蒿素通过抑制炎症反应对血管重塑的抑制作用。方法 采用贴块法培养小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)，以TNF-α诱导建立体外平滑肌细胞增殖模型，通过手术剥夺动脉方式建立小鼠股动脉损伤模型，并采用双氢青蒿素干预细胞及股动脉损伤小鼠。采用CCK-8法检测细胞增殖；H&E染色评价股动脉组织病理变化情况并测量中膜厚度；ELISA法检测细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6、CCR8及小鼠股动脉组织中IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β1的含量；免疫组织化学法检测股动脉组织NF-κB p65、CCR8表达；qRT-PCR分析细胞及股动脉组织中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、CCR8、NF-κB p65、TGF-β1、MCP-1 mRNA表达；Western blotting分析细胞及股动脉组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、p-NF-κB p65、NF-κB p65、CCR8、TGF-β1、MCP-1蛋白表达。结果 在TNF-α诱导的VSMCs增殖及股动脉损伤小鼠模型中，VSMCs增殖及TNF-α、IL-6含量明显升高，IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA表达明显升高，IL-6、CCR8、NF-κB p65蛋白表达明显升高(P<0.05或P<0.01)；双氢青蒿素可明显降低TNF-α诱导的VSMCs中IL-1β、IL-8 mRNA及股动脉损伤小鼠IL-1β mRNA表达和IL-1β、p-NF-κB p65蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论 双氢青蒿素能降低血管炎症，延缓损伤血管的重塑，表明其为经皮冠状动脉介入治疗(如支架植入)的潜在治疗药物。     

基于Keap1/Nrf2/HO-1通路汉黄芩素7-O-β-D-乙基葡萄糖醛酸苷体外抗氧化应激作用研究

目的 探讨汉黄芩素 7-O-β-D-乙基葡萄糖醛酸苷（WODE）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）的抗氧化应激作用及机制。方法 MTS法检测WODE（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol·L^-1）对RAW264.7细胞活力的影响；体外培养RAW264.7细胞，WODE（10、20、40 μmol·L^-1）或地塞米松（1 μmol·L^-1，阳性药）预处理1 h，再给予LPS刺激24 h（造模过程不再加药），对照组不加 LPS 和受试物，模型组只给予 LPS 刺激；荧光探针检测胞内活性氧（ROS）水平；Griess反应测定细胞上清液中 NO 生成量；ELISA 检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的分泌；实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）法检测细胞内诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、环氧化酶-2（COX-2）、白细胞介素-1β（IL-1β）、醌氧化还原酶1（NQO-1）、超氧化物歧化酶-1（SOD-1）的mRNA表达水平；Western blotting法检测细胞核因子E2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶-（1 HO-1）蛋白表达水平；免疫荧光染色法检测细胞内Kelch ECH相关蛋白（1 Keap1）表达水平。结果 与对照组比较，WODE浓度小于40 μmol·L^-1时，细胞存活率没有明显变化；浓度大于80 μmol·L^-1时，细胞存活率下降，但未见统计学差异。与模型组比较，WODE 10、20、40 μmol·L^-1组 ROS水平显著降低（P＜0.01）；20、40 μmol·L^-1 组 NO 释放显著降低（P＜0.05、0.01）；40 μmol·L^-1 组 iNOS mRNA 表 达 水 平 显 著 降 低（P＜0.01）；10、20、40 μmol·L^-1 组 COX-2 和20、40 μmol·L^-1组IL-1β mRNA表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；10、20、40 μmol·L^-1组TNF-α和IL-6的释放受到显著抑制（P＜0.01）；10、20、40 μmol·L^-1组NQO-1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），40 μmol·L^-1组SOD-1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；10、20、40 μmol·L^-1组Keap1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；10、20、40 μmol·L^-1组HO-1蛋白和mRNA表达水平显著提高（P＜0.05、0.01）；20、40 μmol·L^-1 组 Nrf2 蛋白和 40 μmol·L^-1 组 Nrf2 mRNA 表达水平显著增加（P＜0.01）。结论 WODE 对 LPS 诱导的RAW264.7细胞的氧化应激具有抑制作用，其作用机制可能与调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路相关。