基于DNA条形码的金槐系统发育和变异位点分析

目的：对来自不同居群的金槐资源的核糖体内转录间隔区2(ITS2)和叶绿体基因片段psbA-trnH、rbcL、matK进行系统发育分析,探索不同地理来源的金槐资源的遗传多样性。方法：用聚合酶链式反应（PCR）扩增获得金槐ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK的核酸序列,用邻接法（NJ）构建系统发育树,用Kimura 2-Parameter(K2P)模型分析遗传距离,用MEGA和BIOEDIT软件进行多重比对分析。结果：ITS2序列为278～279 bp;psbA-trnH为289 bp;rbcL为673 bp;matK为786～792 bp。ITS2和psbA-trnH都存在3个变异位点,rbcL没有变异位点,matK有13个变异位点。采用ITS2序列构建的系统发育树将金槐样品资源分为2个大类群,百宝实生树聚为一类,其余25份资源聚为一类。对于psbA-trnH序列,28份金槐资源的PCR扩增成功率为100%。psbA-trnH序列聚类结果显示,28份金槐资源可分为3个大的类群。庙头嫁接/实生树、枧塘嫁接树、文桥嫁接树、咸水实生树和大圩嫁接树组成一个类群;绍水实生树单独组成一...     

基于ITS2和psbA-trnH序列鉴别金线兰及其近缘种

目的 应用ITS2和psbA-trnH条形码鉴定金线兰Anoectochilus roxburghii及其近缘种。方法 提取金线兰及其近缘种的DNA,对ITS2和psbA-trnH序列进行扩增和测序,计算物种种内、种间遗传距离,构建邻接法（neighbor-joining,NJ）系统聚类树直观反映鉴定结果。结果 经PCR扩增后测序,金线兰及其近缘种ITS2序列长度为250～254 bp,GC含量为48.2%～51.6%;psbA-trnH序列长度为636～704 bp,GC含量为31.8%～32.0%。根据K2P遗传距离计算,金线兰的种内遗传距离明显小于种间遗传距离。基于ITS2序列构建的NJ树结果显示,除长片金线兰A.longilobus外,金线兰与其余混伪品可以明显区分。基于psb A-trnH序列构建的NJ树结果显示,除长片金线兰和丽蕾金线兰A.lylei外,金线兰与其余金线兰属近缘种可以明显区分。结论 ITS2和psb A-trnH序列可以鉴别金线兰与其遗传距离较远的近缘种。     

ITS2和psbA-trnH序列鉴别马鞭草科药用植物

目的:评价几条热点DNA条形码候选序列对马鞭草科药用植物的鉴别能力。方法:选择psbA-trnH,rbcL,matK,ITS2和ITS序列进行评价,使用各序列的通用引物进行扩增和测序,用扩增及测序成功率,种内种间差异,barcod-ing gap,基于BLAST 1和Nearest Distance方法的鉴定成功率等指标来评价各序列的鉴定能力。结果:对马鞭草科32个种55个样本的序列分析发现,matK的扩增成功率太低,未纳入后续分析;ITS,ITS2,psbA-trnH以及rbcL的扩增及测序成功率分别为83.6%,83.6%,96.4%,98.2%,其鉴定成功率除rbcL为77.8%,75.9%外都为100%,但ITS2序列的种间,种内差异,barcoding gap较psbA-trnH,ITS有明显优势。ITS2序列进一步纳入网上163个样品的数据后其鉴定成功率依然可以达到89.5%,87.6%。结论:考虑到psbA-trnH较高的测序成功率,ITS2和psbA-trnH是适合马鞭草科植物鉴别的一个较好DNA条形码序列组合。     

黄精属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的：评价DNA条形码候选序列对黄精属药用植物的鉴定能力。方法：对44份黄精属样品应用通用引物扩增其叶绿体rbcL、matK、psbA-trnH及核ITS2和ITS序列,分析其种内种间变异和barcoding gap,应用BLAST和Nearest Distance方法计算物种鉴定效率。结果：ITS2和ITS序列通用引物扩增效率低,叶绿体matK序列获得率最低,rbcL最高,三条序列种内与种间变异均较小,无明显的barcoding gap。基于BLAST和Nearest Distance方法计算,三条叶绿体序列对黄精属药用植物的鉴定效率均较低。结论：DNA条形码候选序列psbA-trnH、matK及rbcL不适用于黄精属药用植物的鉴定,叶绿体全序列或通过叶绿体全序列筛选合适的DNA片段可能是该属药用植物分子鉴定的方向。     

鸡血藤及其混伪品的DNA条形码分子鉴定研究

目的采用分子生物学鉴定技术,筛选合适的DNA条形码序列,建立快速、准确鉴定鸡血藤的方法。方法采集72份鸡血藤及其混伪品的样本,分别提取样品DNA,对ITS2、matK、psbA-trnH、ITS和rbcL序列扩增、测序;计算各序列扩增成功率和测序成功率,利用MEGA7.0分析比对序列特征;基于Kimura-2-Parameter(K2P)双参数模型计算种内、种间的遗传距离评估Barcoding gap;利用Phylosuite软件构建ITS2、matK和psbA-trnH和多基因(I-M-P)联合系统发育树。结果 ITS2的扩增成功率和测序成功率最高,均为100%,matK和psbA-trnH的测序成功率亦有94.4%、91.7%,而rbcL和ITS仅为69.4%和61.1%;ITS2较其他条形码序列具有明显的Barcoding gap,且种内、种间重叠少;系统发育树显示,ITS2和psbA-trnH可将鸡血藤及其混伪品明显聚为不同分支,matK不能把滇鸡血藤和南五味子分开;I-M-P系统发育树同ITS2和psbA-trnH结果相同。结论以ITS2为主、psbA-trnH序列为辅的鉴定方法能够对鸡血藤及其混伪品进行快速、准确的鉴定,为鸡血藤临床用药的安全性和合理使用的准确性提供依据。     

基于DNA条形码及SSR技术鉴定风藤和山蒟

目的 研究海风藤原植物风藤和山蒟的分子鉴定方法。方法 提取31份来自全国各地药材植物及不同医药企业生产饮片的基因组,对psbA-trnH、matK、petA-psbJ等叶绿体基因片段以及核糖体间隔序列ITS进行PCR扩增测序及进化树构建。从叶绿体基因组的简单重复序列中筛选4对特异性引物,对其扩增产物进行毛细管电泳分析。结果 所有样品的psbA-trnH序列高度一致,其它DNA条形码的序列均有一定差异。进化树的聚类分析结果 matK和petA-psbJ片段相近,且与SSR分子标记结果一致,但与ITS聚类结果有差异。结论 matK和petA-psbJ片段对风藤和山蒟的鉴别能力优于ITS和psbA-trnH,DNA条形码和SSR分子标记法均可为中药材海风藤的种质资源鉴定提供分子依据。     

基于DNA条形码鉴别缘毛紫菀及狭苞紫菀

目的 基于ITS2和rbcL序列对来自不同地理环境的缘毛紫菀Aster souliei及狭苞紫菀A. farreri进行分子鉴定。方法 以ITS2和rbcL的特异性引物,扩增缘毛紫菀及狭苞紫菀的ITS2和rbcL的序列并测定,运用MEGA7.0软件进行多重比对分析和种间种内遗传距离分析,构建邻接法(neigbor-joining,NJ)系统发育树。结果 ITS2序列在缘毛紫菀及狭苞紫菀的变异位点较rbcL序列丰富,且种间与种内的变异位点数无交叉;ITS2序列的NJ树可将缘毛紫菀及狭苞紫菀样品进行有效区分,而rbcL序列构建的系统发育树无法使缘毛紫菀及狭苞紫菀样品得到有效的区分;ITS2及rbcL序列的遗传距离结果显示缘毛紫菀之间的遗传距离很近,而狭苞紫菀之间的遗传距离较远。结论 ITS2较rbcL序列更适合用于不同产地的缘毛紫菀及狭苞紫菀样品的鉴定;狭苞紫菀的种内差异较大。     

DNA条形码序列对9种蒿属药用植物的鉴定

目的采用DNA条形码序列对9种常见的蒿属药用植物进行鉴定,为常见蒿属药用植物的鉴定提供分子依据。方法对9种常见蒿属药用植物的4条候选DNA条形码序列(ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH)进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增和测序效率,应用BLAST1、Distance方法来评估各序列的鉴定效率。此外,基于MEGA5分析9种常见蒿属药用植物ITS2序列种间K2P遗传距离并构建NJ树。结果除matK外,其余3条片段的PCR扩增和测序效率均为100%,ITS2序列对9种蒿属药用植物的物种水平鉴定成功率最高,为100%,而psbA-trnH、rbcL、matK、matK+rbcL的鉴定成功率(BLAST1法)分别为83.3%、66.7%、54.5%、75%。通过ITS2序列的种间K2P遗传距离及NJ树均能将不同物种全部区分。结论 ITS2序列可以作为鉴定蒿属药用植物的潜在条形码。     

多基原民族药岩陀DNA条形码鉴定

目的:采用ITS,ITS2,rbcL,matK和psbA-trnH这5种热门DNA条形码序列对多基原民族药岩陀的鉴别能力进行评价,筛选出适合该物种鉴定的DNA条形码。方法:通过比较各序列聚合酶链式反应(PCR)扩增成功率及测序成功率,计算种内种间遗传距离,运用Wilcoxon非参数秩和检验进行遗传差异分析,邻接(NJ)法构建系统发育树以及采用Blast 1和NJ建树方法评价不同序列对物种的鉴定成功率等策略的实施,综合评价上述5种DNA候选条形码在多基原岩陀植物中的鉴别效果。结果:ITS序列扩增成功率及测序成功率分别为100%和96.61%;ITS2序列扩增成功率及测序成功率分别为100%和98.31%;psbA-trnH序列扩增成功率及测序成功率均为100%;rbcL序列扩增成功率及测序成功率均为100%,matK扩增成功率及测序成功率均为98.31%。psbA-trnH序列拥有最高的种内及种间遗传变异,且种内最大变异的平均值小于种间最小变异的平均值。系统发育树构建结果显示,psbA-trnH序列能区分3种不同来源的岩陀药用植物,而ITS,ITS2,rbcL和matK序列聚类效果较差。psbA-trnH序列鉴定成功率均为100%,而ITS,ITS2,matK和rbcL序列对物种鉴定成功率均低于50%。结论:psbA-trnH较其他序列有明显优势,因此推荐psbA-trnH序列作为理想的DNA条形码,用于多基原民族药岩陀的鉴定研究。     

基于DNA条形码的芦荟属6种植物的分子鉴定

目的筛选出适合芦荟属6种植物的DNA条形码序列。方法采用试剂盒法提取芦荟属6个品种基原植物的18份样本基因组DNA,应用通用引物扩增其核基因ITS2序列和叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK基因序列并进行双向测序,采用Sequencher 4.1.4软件对测序峰图进行校对拼接,应用MEGA 5.0软件分析不同候选序列的特征,计算物种的种内、种间Kimura 2-Parameter(K2P)遗传距离,比较其种内、种间变异的大小,评估序列的条形码间距(barcoding gap),采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统聚类树。结果共获得72条序列,ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK基因序列各18条,测序成功率均为100%。比对后序列长度为255~723 bp,GC量范围为30.6%~68.2%。psbA-trnH基因序列的最大种内遗传距离均小于最小种间遗传距离,有明显的barcoding gap,ITS2、rbcL、matK序列的种内变异和种间变异有一些重叠,没有明显的barcoding gap。基于psbA-trnH序列的发育树能将芦荟属6个品种完全区分,而其他3个序列在区分这些芦荟属品种时存在模糊鉴定。结论 DNA条形码技术可以准确鉴别芦荟属植物,psbA-trnH序列可以作为鉴别芦荟属植物的优选序列。     

草果叶绿体基因组特征及系统发育分析

目的明确草果Amomumtsao-ko叶绿体基因组结构特征及其在姜科的进化地位。方法利用IlluminaHiseq4000测序平台对草果叶绿体基因组进行测序,通过生物信息学分析方法进行序列组装、注释和特征分析,并以绿苞闭鞘姜为外类群,通过MEGA6软件构建ML系统发育树,分析姜科物种间系统发育关系。结果草果叶绿体基因组全长163 648 bp,鸟嘌呤和胞嘧啶含量(guanine-cytosine content,GC)为36.0%,包括一对29 776 bp的反向重复区(IRs)、一个大单拷贝区(LSC,88 741 bp)和一个小单拷贝区(SSC,15 355 bp);共注释得到113个基因,包括4个rRNA基因、30个t RNA基因和79个蛋白编码基因;在草果叶绿体基因组中共检测到123个SSR位点,大部分SSR均由A和T组成;豆蔻属物种叶绿体基因组大小和结构相似,IR边界高度保守;聚类分析显示草果与豆蔻属的海南砂A.longiligulare、阳春砂A.villosum、绿壳砂A.villosum var. xanthioides、爪哇白豆蔻A. compactum和白豆蔻A. kravanh亲缘关系最近;适应性进化分析发现rpl20、rps11、ccsA、clpP、ycf1和ycf2 6个基因在进化过程中被正向选择。结论获得了完整的草果叶绿体基因组序列,明确了姜科物种间的亲缘关系,为研究豆蔻属植物的系统进化及物种鉴定提供科学依据。     

钩藤属植物分子鉴定的DNA条形码筛选

目的 应用分子生物学鉴定技术,筛选出应用于鉴定钩藤属物种的最佳DNA条形码,建立快速、准确、便捷的钩藤属植物鉴定方法.方法 从广东、广西等地收集了8个钩藤属物种的叶片、茎枝作为材料,共计44份样品.提取样品总DNA,分别对条形码ITS、matK、psbA-trnH、rbcL、trnL-trnF序列进行扩增、测序、拼接、...     

地黄属植物DNA条形码鉴定及地黄栽培起源研究

目的评价DNA条形码通用序列对地黄属植物Rehmannia Libosch.ex Fisch.et Mey.的鉴定作用,探讨中药地黄R.glutinosa的栽培起源。方法对地黄属物种的ITS、psb A-trn H、rbc L和mat K序列扩增和测序,比较各序列在种内和种间变异。采用最近距离法、相似性搜索法、构建Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树等方法进行鉴定分析。结果对比地黄属各种的rbc L和mat K序列,结果显示rbc L序列完全一致,mat K序列同源性为99.9%~100%。ITS和psb A-trn H序列的平均种间变异均大于平均种内变异,且2条序列的种间最小变异均大于种内最大变异。在ITS系统树上,地黄的所有样品与茄叶地黄聚在一支,支持率为96%;psb A-trn H和联合树上,地黄的所有样品聚为一单系分支(支持率为55%和58%)。地黄与茄叶地黄聚在的这一分支分别与裂叶地黄和高地黄聚在一支(在ITS和联合树上支持率为55%和68%),与裂叶地黄和天目地黄聚在一支(在psb A-trn H树上支持率为80%)。ITS和联合树支持栽培地黄的3个品种与来源于河南温县、郑州、南阳和北京野生地黄居群聚在一支,支持率为51%和69%。结论叶绿体基因rbc L和mat K不适合作为条形码对地黄属进行鉴定,ITS和psb A-trn H序列可以作为中药材地黄与同属近缘种进行鉴定的条形码序列。裂叶地黄和天目地黄可能是四倍体地黄的2个亲本来源,栽培的地黄品种可能起源于河南温县区域的野生群体。     

川芎种质鉴定标记开发和系统发育研究

目的基于藁本属Ligusticum叶绿体基因组高频插入缺失区域开发InDel标记,同时结合通用条形码对道地川芎及其常用混伪品进行种质鉴定和系统发育研究。方法通过8个DNA通用条形码ycf1、matK、ITS2、rpoC1、rbcL、rpoB、trnK、psbA-trnH序列片段对采集的26个川芎样品及其常用混伪品进行了扩增和测序,采用了遗传距离统计法、barcoding gap分析法和构建系统发育树法进行亲缘关系和系统发育研究。同时利用InDel分子标记,采用构建进化树法对道地川芎及其混伪品物种进行分子鉴定。结果 rbcL片段保守位点最多(97.32%),且GC含量最高(44.9%)。rbcL+rpoB片段具有最小的平均种内遗传距离(0.002 5),psbA-trnH片段具有最大的平均种间遗传距离(0.429 2)。trnK片段和rbcL+rpoB片段具有最高的种间变异,psbA-trnH片段的"barcodinggap"区重叠度最小。采用的8对DNA通用条形码无法准确地鉴定道地川芎药材与其他混伪品物种。InDel分子标记的聚类分析中,24对InDel引物中的4对引物组合能准确地鉴定出道地川芎,并将道地川芎及其混伪品物种聚类为4个分支,其中一个分支为采集的道地川产川芎药材。结论 InDel标记对道地川芎及其常用混伪品的鉴定能力高于通用条形码。对于传统的通用DNA条形码,由于遗传成分差异大,无法区分川芎及其常用混伪品。新开发出的InDel分子标记可以有效地鉴定道地川芎及其常用混伪品,从分子水平上为川芎道地性研究提供有效手段。     

云南草果种质资源的遗传多样性及亲缘关系的SSR分析

目的评价云南草果居群的遗传多样性及亲缘关系。方法运用7对微卫星引物对24个草果居群进行分析;首先应用GenALEx计算遗传多样性参数,并进行PCoA和AMOVA分析;采用NTsys软件绘制居群聚类图;最后利用Structure软件计算出最佳的K值。结果 24个草果居群的Shannon多样性指数(H)的平均值为0.49,期望杂合度(He)的平均值为0.32;遗传分化系数(Fst)为0.090,基因流(Nm)为2.930。24个草果居群的遗传分化有81%存在于居群内,仅有19%存在于居群间;黄花草果23个居群的遗传一致度(I)为0.631 8～0.982 4,遗传距离(D)的范围为0.017 7～0.459 2,而白花草果居群(MG5)与其他23个黄花草果居群一致度均较小,为0.3697～0.6090;而居群聚类分析,在遗传距离0.49处,明显地把白花草果与黄花草果分开;Structure聚类得出K=4时,209份黄花草果资源可被分为4个类群。结论云南黄花草果居群的遗传多样性水平平均偏高;遗传变异主要存在于居群内,而非居群间。根据基因型,黄花草果和白花草果被明显地划分成2类,遗传距离很远;而黄花草果大致被分为4个类群。     

基于DNA条形码的多花黄精系统发育和变异位点分析研究

目的对来自不同地域的多花黄精野生资源的核糖体内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)和psbA-trnH基因间隔区序列进行系统发育分析,探索不同地理来源的多花黄精资源的遗传多样性和亲缘关系。方法用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法扩增获得多花黄精ITS和psbA-trnH的核酸序列,与美国国家技术信息中心(NCBI)相对应的核酸序列比对获得多花黄精ITS2和psbA-trnH核酸序列。用邻接法(Neighbor joining)构建系统发育树,用Kimura two-parameter(K2-P)模型分析遗传距离,用Mega和DNAman软件进行多重比对分析。结果安徽青阳样品的ITS2序列为224bp,其余24份样品的ITS2序列均为225bp,福建泰宁的1份样品为620bp,其余24份多花黄精样品的psbA-trnH序列均为621 bp,2个序列分别存在7个和4个变异位点。采用ITS2序列构建的系统发育树将25份资源分为2个大的类群,湖南和贵州的5份资源种群聚为一类,其他20份资源聚为一类,遗传距离显示来自贵州花溪、剑河的样品和来自福建建阳的遗传距离最大;采用psbA-trnH序列构建的系统发育树则无法将不同地域多花黄精资源区分开。结论系统发育和变异位点分析为多花黄精资源的进化研究、道地性评价奠定了理论基础,变异位点的分析可用于相关资源的鉴定。