WWOX基因慢病毒载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的：构建及鉴定WWOX基因慢病毒载体,观察WWOX基因在人卵巢癌PEO1细胞株中的表达,为进一步研究WWOX基因的作用机制及其功能奠定基础。方法：采用PCR技术从克隆质粒模板中获得全长WWOX基因,将WWOX基因亚克隆到慢病毒载体PCDH—CMV—MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX,通过双酶切验证后,慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG,pPACKH1-REV,Pvsv-G共转染293T细胞,获得携带WWOX基因及EGFP基因的重组慢病毒Lenti WWOX,并转染靶细胞人卵巢癌PEO1细胞株。通过RT—PCR和Western Blot验证Lenti WWOX在PEO1细胞株中的表达。结果：测序结果显示成功构建重组慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX;表达质粒与辅助包装质粒共转染包装细胞293T后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60％,有WWOX基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论：本实验成功构建了携带WWOX基因慢病毒表达载体,包装成病毒后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。     

慢病毒介导siRNA干扰Sez6对小鼠小脑浦肯野细胞发育的影响

目的通过Sez6siRNA慢病毒感染小鼠小脑组织切片细胞,干扰Sez6基因表达后,观察浦肯野细胞生长发育变化。方法使用Sez6siRNA慢病毒感染体外培养的刚出生（P0）的小鼠小脑组织切片细胞后;免疫组化标识浦肯野细胞,观察细胞树突发育。结果Sez6基因表达下调明显,浦肯野细胞树突分支数量减少（P〈0．05）,发育延迟;浦肯野细胞胞体排列不整齐。结论Sez6的表达与浦肯野细胞树突发育相关,还可能跟浦肯野细胞迁移排列相关。     

慢病毒介导siRNA干扰MyD88表达对大鼠肺泡巨噬细胞功能的影响

目的采用RNA干扰技术,通过构建表达大鼠髓样分化因子88（MyD88）siRNA慢病毒干扰大鼠肺泡巨噬细胞MyD88g／表达,检测其对细胞功能的影响。方法针对MyD88基因,设计并构建3对siRNA表达质粒,分别与预先构建好表达MyD88N质粒共转染HEK-293T细胞,Westernblot检测MyD88的表达情况,筛选出其中1对干扰效率最高的siRNA,用Gateways方法构建慢病毒干扰载体包装成慢病毒,将慢病毒转染大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383胞并加入内毒素（LPS）诱导,未转染慢病毒的细胞作为空白对照组和LPS激活组：空白对照组加入与LPS等体积的PBS;LPS激活组加入LPS刺激。ELISA测定各组细胞因子（IL-18、IL-6）释放情况。结果成功筛选出了1对干扰效率最高的siRNA并包装成慢病毒,病毒滴度为2．0×10^6TU／ml。LPS诱导后,与对照组相比．感染慢病毒的NR8383细胞MyD88表达明显受到抑制,IL-1β、IL-6的释放均显著减少,差异有统计学意义。结论慢病毒介导RNA干扰能够有效抑制NR8383细胞MyD88基因的表达,显著减少胞因子的释放,为以抗原提呈细胞（APC）为靶向的体内实验治疗大鼠肺移植相关闭塞性细支气管炎（obliterative bronchitis,OB）的研究提供了手段。     

CD147反义核酸对卵巢癌细胞生物学行为的影响

目的：研究经CD147反义RNA表达质粒载体转染建株的卵巢癌细胞系8910的生物学行为变化。方法：用CD147反义RNA表达质粒PCDNAasCD147转染人卵巢癌细胞系8910，克隆经筛选、鉴定后进行凝胶酶谱实验、肿瘤细胞侵袭力实验及动物实验。结果：CD147反义核酸转染的8910与空载体转染组相比，刺激成纤维细胞产生基质金属蛋白酶的能力下降，细胞侵袭力下降，荷瘤裸鼠成瘤力下降（P＜0．01）。结论：CD147反义核酸能抑制卵巢癌的转移和成瘤，因而有可能成为卵巢癌的治疗的药物靶点。     

慢病毒载体介导的Nrf2表达下调对肝星状细胞生物学行为的影响

目的观察重组慢病毒载体介导Nrf2表达下调对肝星状细胞生物学行为的影响,同时探讨其可能的作用机制。方法利用重组DNA技术将特异性shRNA序列插入慢病毒表达载体pGLV3.GFP中,形成pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA,将其转染至293T细胞中,随后进行病毒包装、滴度测定、转染率计算。采用实时荧光定量、Western blot测定转染肝星状细胞株(HSC-T6细胞)Nrt2 mRNA及蛋白的表达情况,利用Tunel染色法检测HSC-T6细胞的凋亡情况,同时对HSC-T6细胞中PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax蛋白水平进行测定。结果构建的重组病毒载体LV3-H1-GFP-shRNA可有效感染293T细胞。激光共聚焦显示空白组细胞凋亡率低于A组和B组,与A组比较,B组的细胞凋亡率降低(P0.05)。实时荧光定量PCR法结果显示空白组Nrf2 mRNA水平高于A组和B组(P0.05),与A组比较,B组mRNA水平升高(P0.05)。Western blot法显示空白组Nrf2蛋白水平高于A组和B组(P0.05),与A组比较,B组蛋白水平升高(P0.05)。与空白组相比,A组和B组PI3K、p-Akt、p-bad、Bcl-2的蛋白表达量增加(P0.05),Bax蛋白减少(P0.05),其中A组PI3K、p-Akt、p-Bad、Bcl-2的蛋白水平较B组增加(P0.05),Bax蛋白水平低于B组(P0.05)。结论 Nrf2基因的shRNA慢病毒载体pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA在体外可抑制肝星状细胞活化,其作用机制可能与通过抑制PI3K-Akt通路促肝星状细胞凋亡有关。     

反义p55PIK慢病毒载体的构建及其对甲状腺癌细胞FTC236增殖的影响

目的:观察反义p55PIK慢病毒对甲状腺癌细胞FTC236的增殖是否有抑制作用?方法:构建含p55PIK反义RNA的慢病毒载体并包装成慢病毒,使之感染FTC236细胞,得到稳定的细胞系后用Western blot方法检测p55PIK蛋白的表达情况,用Real-time PCR检测p55PIK的mRNA的表达情况?同时用四甲基偶氮唑盐(MTT)法及BrdU掺入法检测各组细胞的增殖情况?结果:构建的慢病毒感染甲状腺癌细胞FTC236的效率约为95%; Western blot证明反义p55PIK病毒可以使该细胞的p55PIK蛋白水平降低,mRNA水平降为对照组的(47 ± 8)%(P < 0.01)?MTT法检测发现反义p55PIK慢病毒感染后的FTC236细胞增殖明显受到抑制,增殖率为未处理组的(59 ± 19)%(P < 0.05)?且反义p55PIK慢病毒组的平均BrdU掺入率比未处理组降低了10.64%(P < 0.02)?结论:反义p55PIK病毒可以通过抑制p55PIK蛋白的表达而抑制了FTC236细胞的增殖?     

慢病毒表达circLIFR对Hep3B肝癌细胞生物学行为的影响

目的：探讨慢病毒稳定高表达circLIFR对Hep3B肝癌细胞生物学行为的影响。方法：通过慢病毒包装circLIFR表达质粒,感染Hep3B细胞以构建稳定circLIFR高表达的肝癌细胞株。其中构建肝癌Hep3B细胞株感染circLIFR高表达序列的慢病毒为circLIFR高表达组,感染circLIFR高表达空载体序列的慢病毒为阴性对照组,无感染组为空白对照组。qPCR检测circLIFR的表达,Sanger测序鉴定其环状拼接位点。细胞增殖试剂盒检验细胞活力,Transwell鉴定侵袭能力。结果：qPCR和Sanger测序显示成功建立circLIFR稳定表达细胞株。circLIFR高表达组细胞增殖活力优于阴性对照组以及空白对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。阴性对照组、空白对照组的穿透Matrigel滤膜细胞数目依次为（270.8±18.9）个、（266.2±17.6）个,circLIFR高表达组穿透Matrigel滤膜的细胞数为（396.6±32.9）个,差异具有统计意义（P<0.05）。结论：circLIFR高表达明显提高Hep3B肝癌细胞增殖活力,促进细胞侵袭...     

慢病毒介导shRNA沉默YAP基因对人前列腺癌LNCaP细胞增殖、凋亡及其雄激素受体的影响

目的:探讨慢病毒介导sh RNA沉默Yes-相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)基因对人激素依赖性前列腺癌细胞株LNCa P细胞增殖、凋亡及其雄激素受体(androgen receptor,AR)的影响。方法:3条针对YAP基因的sh RNA慢病毒干扰载体感染LNCa P细胞,经嘌呤霉素筛选后建立稳定感染细胞系,real-time PCR、Western blot分别检测感染后各组细胞YAP、AR m RNA和蛋白水平;选取沉默效果最佳sh RNA慢病毒干扰载体组,以细胞增殖/毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)、平板克隆形成实验(colony formation)检测LNCa P细胞增殖能力;流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测LNCa P细胞凋亡改变。结果:重组慢病毒成功感染前列腺癌LNCa P细胞,经嘌呤霉素筛选后感染效率达95%以上,获得稳定沉默YAP基因LNCa P细胞系。与空白对照组和阴性对照组比较,感染sh RNA慢病毒干扰载体各组中YAP、AR m RNA及蛋白表达水平明显下调(P=0.000),细胞增殖受到明显抑制(P=0.000),细胞凋亡明显增加(P=0.000)。结论:慢病毒介导sh RNA沉默YAP基因能有效下调YAP在LNCa P细胞中表达,并抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡;YAP可能作为AR配体参与AR信号通路的调节。     

慢病毒载体介导hTERT对肝细胞生物学特性的影响

目的：研究慢病毒介导人端粒酶逆转录酶（h-TERT）基因对人张氏肝细胞（chang liver）生物学特性的影响。方法：将表达h-TERT基因的重组慢病毒感染人张氏肝细胞,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。分别采用实时荧光RT-PCR、TRAP-PCR及ELISA方法检测转染前后chang liver细胞的h-TERT-mRNA水平和端粒酶活性的变化。通过MTT法、流式细胞术（FCM）观察其形态变化及生长增殖情况。结果：转染后的chang liver细胞存在h-TERT基因过表达和端粒酶活性上调,体外培养条件下维持肝细胞原有形态,存活期显著延长,增殖能力较强。结论：外源性h-TERT基因的异位表达不仅上调chang liver细胞的端粒酶活性,而且促进其增殖。     

内质网蛋白29过表达慢病毒载体的构建及其对胃癌细胞生物学行为的影响

目的：构建内质网蛋白29（ERp29）慢病毒过表达载体,探讨ERp29过表达对胃癌MGC803和SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法：构建带有红色荧光蛋白标签的ERp29基因表达质粒的慢病毒（pCDH-ERp29）和对照质粒（pCDH-Vector）,分别感染MGC803和SGC7901细胞;荧光显微镜观察细胞感染情况;CCK-8和平板克隆实验检测稳定感染ERp29基因的胃癌MGC803和SGC7901细胞的增殖能力;Transwell小室实验分别检测稳定感染ERp29基因的胃癌MGC803和SGC7901细胞的迁移和侵袭能力;应用Real-time PCR和Western blotting技术分别检测稳定感染ERp29基因的胃癌MGC803和SGC7901细胞中ERp29 mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切鉴定显示成功构建pCDH-ERp29过表达载体,荧光显微镜下观察到成功感染胃癌细胞。CCK-8实验和平板克隆实验检测,与pCDH-Vector组比较,pCDH-ERp29组MGC803和SGC7901细胞增殖能力无明显变化（P>0.05）;Transwell小室实验,与pCDH-Vector组比较,pCDH-ERp29组MGC803和SGC7901细胞的迁移和侵袭细胞数明显减少（P<0.05）。pCDH-ERp29组细胞中ERp29 mRNA和蛋白表达水平明显高于pCDH-Vector组（P<0.05）。结论：成功构建过表达ERp29基因的慢病毒载体,过表达ERp29基因可明显抑制胃癌MGC803和SGC7901细胞的迁移和侵袭。     

RNA干扰沉默claudin-4基因表达对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响

目的:采用RNA干扰技术沉默claudin-4基因在子宫内膜癌细胞Ishikawa中的表达,探讨claudin-4表达下调对Ishikawa细胞增殖力和侵袭力的影响;比较RNA干扰前后差异表达的蛋白质,探讨claudin-4基因在子宫内膜癌发病机制中的作用。方法:设计靶向claudin-4的小干扰RNA(si RNA),转染人子宫内膜癌细胞Ishikawa。采用CCK分析法检测干扰前后细胞增殖能力的变化,Transwell小室实验检测干扰前后细胞侵袭能力的变化。应用双向凝胶电泳和质谱分析检测RNA干扰前后蛋白质表达的差异。结果:claudin-4基因沉默可以显著降低子宫内膜癌细胞的增殖能力和侵袭能力(P<0.05)。应用蛋白质组学技术比较claudin-4 si RNA干扰前后蛋白质表达的差异,共鉴定出5种差异蛋白质。结论:claudin-4基因具有促进子宫内膜癌细胞增殖和细胞侵袭的作用,这种作用可能通过改变差异蛋白的表达得以实现。     

Effect of siRNA targeted to fbxl20 on biological behavior of liver cancer SMMC-7721 cells

目的:通过沉默fbxl20基因,以观察基因沉默后对SMMC-7721细胞的增殖、迁移和周期分布的影响.方法:通过脂质体Lipofectamine2000介导转染SMMC-7721细胞,靶向fbxl20基因的siRNA片段阻低肝癌SMMC-7721细胞株fbx120 mR-NA表达.结果:siRNA能有效沉默SMMC-7721细胞fbx120 mRNA的表达,沉默效率为71.49％.MTT试验实验显示:siRNA转染SMMC-7721细胞后,细胞增殖能力显著降低.Transwell小室和划痕愈合实验表明,fbxl20基因被沉默后,SMMC-7721细胞在迁移能力明显减弱,迁移抑制率高达62.03％.流式细胞术检测细胞周期结果显示:转染48 h后,SMMC-7721实验组细胞G1/G0期比率(81.21％)显著高于阴性对照组(71.49％)和空白对照组(67.90％).结论:本实验运用RNA干扰技术成功抑制了SMMC-7721细胞中fbxl20基因的表达,并且发现fbxl20基因可能与肝癌细胞的增值和迁移相关.     

siRNA靶向沉默fbxl20基因对肝癌SMMC-7721细胞生物学行为的影响

目的:通过沉默fbxl20基因,以观察基因沉默后对SMMC-7721细胞的增殖、迁移和周期分布的影响。方法:通过脂质体Lipofectamine2000介导转染SMMC-7721细胞,靶向fbxl20基因的siRNA片段阻低肝癌SMMC-7721细胞株fbxl20 mR-NA表达。结果:siRNA能有效沉默SMMC-7721细胞fbxl20 mRNA的表达,沉默效率为71.49%。MTT试验实验显示:siRNA转染SMMC-7721细胞后,细胞增殖能力显著降低。Transwell小室和划痕愈合实验表明,fbxl20基因被沉默后,SMMC-7721细胞在迁移能力明显减弱,迁移抑制率高达62.03%。流式细胞术检测细胞周期结果显示:转染48 h后,SMMC-7721实验组细胞G1/G0期比率(81.21%)显著高于阴性对照组(71.49%)和空白对照组(67.90%)。结论:本实验运用RNA干扰技术成功抑制了SMMC-7721细胞中fbxl20基因的表达,并且发现fbxl20基因可能与肝癌细胞的增值和迁移相关。     

Effects of beta-catenin-specific siRNA interference on Jurkat and K562 cells

OBJECTIVE: To inhibit the expression of beta-catenin and investigate the effect of the beta-catenin gene on Jurkat and K562 cells. METHODS: siRNA specifically knocking down the expression of beta-catenin was used to testify the function of beta-catenin in Jurkat and K562 cells. Real time polymerase chain reaction and Western blot were performed respectively to testify the mRNA level and protein level of beta-catenin. Growth curve was determined by counting viable cells using trypan blue refusal-dyed method. The proliferation of cells was assayed by clonogenic counting and MTT method. The apoptotic cells were measured by Annexin V/PI staining. The cell cycle analysis was performed based on propidium iodide staining. RESULTS: Compared with the control group (transfected with siRNA directed against scramble gene), the survival, colonogenicity, and proliferation of the Jurkat and K562 cells were significantly decreased in experimental group transfected with beta-catenin siRNA. The colonogenicity was decreased from 31.9 +/- 5.55 (siRNA) to 25.0 +/- 5.13 (control) in Jurkat cells, and from 47.33 +/- 8.52 (siRNA) to 39.33 +/- 6.26 (control) in K562 cells (both P <0.05). The inhibition rate was (49.3 +/- 9.86)% (siRNA) and (15.1 +/- 6.55)% (control) respectively in Jurkat cells, and (39.4 +/- 7.56)% (siRNA) and (10.1 +/- 6.89)% (control) in K562 cells (both P <0.05). In addition, the apoptotic rate increased from (23.5 +/- 2.82)% (control group) to (55.9 +/- 2.22)% (experiment group) in Jurkat cells and from (14.9 +/- 8.54)% (control group) to (27.9 +/- 15.3)% (experiment group) in K562 cells. However, cell cycle analysis revealed no obvious phases change both in Jurkat and in K562 cells. CONCLUSION: Knock-down of beta-catenin gene may decrease the proliferation, survival, and clonogenicity in Jurkat cells and K562 cells.     

仑伐替尼对甲状腺癌TPC-1细胞生物学行为的影响

目的:探讨仑伐替尼对甲状腺癌TPC-1细胞生物学行为的影响.方法:TPC-1细胞分为阴性对照组(不处理)与仑伐替尼组(20μmol/L仑伐替尼处理),采用克隆形成实验和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞克隆和凋亡情况;TPC-1细胞分为阴性对照组(不处理)与仑伐替尼组(40μmol/L仑伐替尼处理),应用...     

金雀异黄素联合顺铂对SK-OV-3人卵巢腺癌细胞生物学行为影响的研究

目的 观察金雀异黄素联合顺铂对SK-OV-3人卵巢腺癌细胞生物学行为的影响,探讨其可能的作用机制.方法 培养SK-OV-3人卵巢腺癌细胞,分别给予金雀异黄素(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L、200μmol/L)、顺铂(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16...     

Survivin siRNA对大肠癌HT-29细胞生物学特性的影响

目的 将靶向Survivin基因的siRNA导入大肠癌HT-29细胞中,并研究其对HT-29细胞生物学特性的影响.方法 体外合成2条靶向人survivin基因的siRNA,并将其导入HT-29细胞,通过RT-PCR、流式细胞仪以及MTT法检测细胞内survivin mRNA的表达水平,细胞凋亡及增殖情况.结果 HT-29细胞内survivin mRNA的表达水平降低,细胞凋亡率上升且肿瘤细胞增殖能力下降.结论 靶向人survivin基因的siRNA能有效降低目的 基因mRNA在大肠癌细胞HT-29中的表达,抑制肿瘤细胞的生长.     

小RNA干扰MMP-2基因表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响

目的探讨小RNA干扰基质金属蛋白酶2（MMP-2）基因表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响。方法收集结直肠癌病人的结直肠癌组织及正常的癌旁组织,Western blotting检测MMP-2表达水平。取结直肠癌细胞SW620作为对照组,将MMP-2 siRNA、siRNA control转染至结直肠癌细胞中,Western blotting检测转染48 h后MMP-2 siRNA组、siRNA control组和对照组细胞中MMP-2水平,MTT法检测各组细胞存活情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡变化,Western blotting检测各组细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、β-连环蛋白（β-catenin）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、下游靶基因C-myc、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）水平。结直肠癌细胞与Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535作用后,测定抑制剂组和未处理组（不加抑制剂）细胞增殖、凋亡变化,同时检测细胞中Bcl-2、β-catenin、Bax、C-myc、cyclin D1蛋白变化。结果结直肠癌组织中MMP-2蛋白表达水平明显高于癌旁组织（P < 0.01）。MMP-2 siRNA组MMP-2水平均低于对照组和siRNA control组（P < 0.05）,细胞存活率低于对照组（P < 0.05）,细胞凋亡率均高于对照组和siRNA control组（P < 0.05）。Bcl-2、β-catenin、C-myc、cyclin D1水平均低于对照组和siRNA control组（P < 0.05）,Bax水平均高于对照组和siRNA control组（P < 0.05）。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂作用后,抑制剂组细胞存活率低于未处理组（P < 0.05）,细胞凋亡率高于未处理组（P < 0.05）,Bcl-2、β-catenin、C-myc、cyclin D1水平均明显低于未处理组（P < 0.01）,Bax水平明显高于未处理组（P < 0.01）,与转染MMP-2 siRNA的结直肠癌细胞一致。结论MMP-2在结直肠癌组织中表达上调,抑制MMP-2的结直肠癌细胞增殖受到抑制,凋亡增多,其作用机制与Wnt/β-catenin信号通路有关。     

纤维粘连蛋白对膀胱癌细胞生物学行为的影响

目的研究细胞外基质成分纤维粘连蛋白（ＦＮ）在膀胱肿瘤细胞生长、粘附和侵袭转移中的作用。方法利用转基因技术将ＦＮｃＤＮＡ基因导入低表达ＦＮ的膀胱癌细胞系２５３Ｊ,获得高表达ＦＮ的细胞系２５３ＦＮ,并观察转染前后细胞生长速度的变化。用氮兰四唑盐方法检测细胞与基质的粘附能力;用机械法和细胞分离试验测定细胞的同质粘附性;Ｂｏｙｄｅｎ小室法检测细胞的侵袭能力。结果２５３ＦＮ细胞体外增殖能力减弱;同质粘附能力增强,与基质的粘附能力亦增强。且细胞不易相互分离。体外侵袭实验表明,２５３ＦＮ细胞穿过基底膜的能力减弱。结论随着膀胱癌细胞ＦＮ表达水平的增高,一些恶性表型发生变化,可使其侵袭转移能力受到抑制。     

siRNA沉默GPNMB对人胶质母细胞瘤细胞系生物学特性的影响

目的探讨小干扰RNA（siRNA）干扰非转移性黑色素瘤糖蛋白B（GPNMB）表达对人胶质母细胞瘤细胞系生物学特性的影响。方法将GPNMB siRNA片段通过脂质体转染人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44,Western blot检测GPNMB蛋白表达水平;Annexin V/PI双染法检测GPNMB-siRNA对细胞凋亡的影响;MTT法检GPNMB-siRNA对细胞增殖的影响;Transwell法检测GPNMB-siRNA对细胞侵袭性的影响。结果 GPNMBsiRNA能有效抑制人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44中GPNMB的表达,与空白对照组比较,GPNMB的缺失对细胞凋亡影响不大,可显著抑制细胞的增殖和侵袭（P〈0.05）。结论 GPNMB基因敲除对人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44的凋亡无显著影响,但可显著抑制其增殖力和侵袭力,表明GPNMB在人胶质母细胞瘤的发生、发展中起着重要作用,提示GPNMB可以作为治疗人胶质母细胞瘤的潜在靶点。