穿心莲内酯对TBHP诱导的椎间盘髓核细胞凋亡的作用及机制研究

目的：探讨穿心莲内酯（andrographolide,ANDRO）对叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide,TBHP）诱导的椎间盘髓核细胞（nucleus pulposus cells,NPC）凋亡的作用及其机制。方法：用TBHP诱导NPC建立细胞模型。将NPC分为5组：对照组、模型组（100μmol/L TBHP）、ANDRO低剂量组（100μmol/L TBHP+9μmol/L ANDRO）、ANDRO中剂量组（100μmol/L TBHP+18μmol/L ANDRO）和ANDRO高剂量组（100μmol/L TBHP+36μmol/L ANDRO）。流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,ELISA试剂盒检测氧化应激相关指标超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-PX）和过氧化氢酶（catalase,CAT）水平,JC-1探针法检测线粒体膜电位,Western blot检测动力相关蛋白1(dynam...     

Mfn2通过抑制内质网应激减轻椎间盘退变大鼠髓核细胞凋亡

目的 研究Mfn2对椎间盘退变大鼠髓核细胞内质网应激及细胞凋亡的作用及机制。方法 离体培养正常大鼠NP细胞为control组,离体培养椎间盘退变大鼠NP细胞分为model组、OE-Mfn2组、OE-NC组及4-PBA组。Western blot法检测Mfn2、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、GRP78、Bcl-2、Bax、caspase-3的蛋白水平;qRT-PCR检测Mfn2、PERK、eIF2α、ATF4mRNA水平;免疫共沉淀实验验证Mfn2与PERK互作关系;MTT检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 Mfn2可特异性结合PERK;与model组比较,OE-Mfn2组Mfn2、Bcl-2水平及细胞活力增加(P＜0.05),PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、GRP78、Bax、caspase-3水平及凋亡率降低(P＜0.05)。结论 Mfn2可通过降低ERS抑制椎间盘退变大鼠NP细胞凋亡。     

柚皮苷体外抗肿瘤活性及其机制研究

目的 研究柚皮苷的体外抗肿瘤活性.方法 采用MTT法测定柚皮苷对5种不同肿瘤细胞的增殖抑制作用.采用流式细胞术检测柚皮苷对细胞凋亡、细胞活性氧水平及细胞线粒体膜电位水平的变化.采用单细胞凝胶电泳(SCGE)实验检测柚皮苷对细胞DNA的损伤.结果 MTT实验得出柚皮苷对不同的肿瘤细胞产生不同的增殖抑制现象,并且对肿瘤细胞的抑制作用呈浓度依赖性.其对PC-12细胞作用24 h后,流式细胞术检测得到柚皮苷能有效诱导PC-12细胞的凋亡,并且细胞内活性氧水平升高,线粒体膜电位下降.SCGE实验发现柚皮苷使细胞DNA断裂,形成拖尾.结论 柚皮苷通过活性氧调控的线粒体途径诱导肿瘤细胞PC-12的凋亡.     

微载体旋转立体培养对成人退变髓核细胞凋亡调控的研究

目的 采用微载体旋转立体培养法对成人退变髓核细胞进行扩增,研究细胞凋亡情况,探讨髓核细胞凋亡在椎间盘退变中的作用。方法 手术切除的退变髓核组织行原代培养,传代后随机进行单层培养和微载体旋转立体培养,采用Annexin-V-PI染色,流式细胞仪定量检测早期细胞凋亡,应用免疫组化方法检测凋亡抑制因子Bcl 2的表达,DeadEndTM比色法检测细胞晚期凋亡情况。结果 流式细胞仪定量检测可见细胞在稳定生长期时,微载体旋转立体培养法较单层培养法髓核细胞的凋亡率低（P<0.05）,在对数生长期两种培养方法无明显差别（P>0.05）。Bcl-2指标及DeathEndTM比色法检测显示在两个时期内,微载体旋转立体培养法培养的细胞凋亡率较低（P<0.05）。结论 微载体旋转立体培养法可较好地降低髓核细胞凋亡率,是一种较有前途的髓核细胞培养方法,为组织工程化椎间盘髓核种子细胞的研究奠定了基础。     

人退变髓核细胞中内质网应激水平的观察研究

目的 观察探讨退变与正常髓核组织中内质网应激水平的差异.方法 获取正常和退变髓核组织共9例(均为海军总医院骨科2016年1月至2017年6月期间住院手术患者),取组织及分离培养髓核细胞,通过透射电镜观察内质网形态、免疫组化法对髓核组织中葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达分布进行定性分析,RT-PCR及Western blot对髓核细胞中GRP78、CHOP进行mRNA和蛋白质水平的分析.结果 透射电镜结果显示退变髓核细胞的内质网扩张、肿胀,正常片状折叠结构消失;免疫组化染色及Western blot检测结果均可见退变髓核组织GRP78、CHOP的表达升高;RT-PCR提示较之于正常组,退变组GRP78[(1.076 ±0.13)vs(2.471 ±0.53)]、CHOP[(1.09 ±0.21)vs(6.873±1.4)]明显升高(P＜0.05).结论 退变髓核细胞中内质网应激水平较正常髓核细胞升高,提示内质网应激可能在髓核细胞退变过程中发挥作用.     

白细胞介素-1β诱导人椎间盘髓核细胞凋亡

目的：探讨人正常椎间盘髓核细胞的培养方法以及白细胞介素-1β（IL-1β）对人椎间盘髓核细胞凋亡的作用。方法：取特发性脊柱侧弯患者腰椎间盘髓核组织,用胰酶、胶原酶序贯消化法消化细胞,并用甲苯胺蓝、番红-O染色和Ⅱ型胶原免疫组化分别检测糖胺多糖、蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达,分别用20μg/L和200μg/L重组人IL-1β刺激髓核细胞24 h,检测其凋亡率。结果：用酶消化法可成功分离培养人椎间盘髓核细胞,检测所培养细胞可表达糖胺多糖、蛋白多糖和Ⅱ型胶原,IL-1β20μg/L组中细胞凋亡率（8.46%）和IL-1β200μg/L组（19.00%）分别为空白对照组（2.86%）的2.95倍和6.63倍（P〈0.05）,IL-1β200μg/L组是IL-1β20μg/L组的2.24倍（P〈0.05）。结论：用酶消化法可成功培养人椎间盘髓核细胞,IL-1β可以诱导椎间盘髓核细胞凋亡,并且随着浓度升高凋亡率增加,提示炎症因子IL-1β在退变椎间盘细胞凋亡中起了重要的作用。     

低氧诱导因子在髓核细胞生理功能调节中的作用机制研究进展

椎间盘退变是临床常见难题下腰痛的主要病因之一.而髓核细胞表型的改变、细胞生存时间的减少、代谢活动的降低和细胞外基质含量下降均被认为与椎间盘退变相关.椎间盘是身体内最大的无血管组织,在体内最显著的特点就是氧含量偏低.低氧诱导因子(H IF)是一种转录因子,细胞在低氧条件下诱导产生HIF从而引发一系列的细胞反应来适应低氧的外环境.HIF通过与低氧反应元件(HRE)结合以启动靶基因的转录表达.目前研究认为,HIF在椎间盘退变的病理进程中具有重要作用,可能是未来阻遏椎间盘退变进展甚至治愈这一临床难题的关键靶点.本文综述了HIF对于髓核细胞新陈代谢活动的调节作用,包括HIF在髓核细胞的表达以及HIF对于髓核细胞表型、生存、新陈代谢以及细胞外基质生成的调控.     

过表达miR-29a对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响

目的 探讨miR-29a在人椎间盘退变髓核(NP)细胞凋亡的调控作用.方法 体外培养椎间盘退变NP细胞,构建重组真核表达质粒cherry/miR-29a,脂质体Lipofectamine转染进入NP细胞,应用反转录实时定量PCR(RT-qPCR)检测NP细胞中miR-29a的表达变化,Western blot法检测凋亡相关蛋白Caspase-3前体的表达变化,流式细胞仪检测NP细胞凋亡水平变化.结果 NP细胞转染重组质粒cherry/miR-29a 48 h后,NP细胞中miR-29a的表达水平较NP细胞和转染空质粒的NP细胞中的miR-29a明显升高(P＜0.05);凋亡相关蛋白Caspase 3前体的水平则明显下降(P＜0.05);NP细胞凋亡水平明显升高(P＜0.05).结论 在椎间盘NP细胞中过表达miR 29a能促进NP细胞凋亡,其机制可能是通过Caspase3途径起作用.     

Transplantation of gene-modified nucleus pulposus cells reverses rabbit intervertebral disc degeneration

Background  Intervertebral disc degeneration is the main cause of low back pain. The purpose of this study was to explore potential methods for reversing the degeneration of lumbar intervertebral discs by transplantation of gene-modified nucleus pulposus cells into rabbit degenerative lumbar intervertebral discs after transfecting rabbit nucleus pulposus cells with adeno-associated virus 2 (AAV2)-mediated connective tissue growth factor (CTGF) and tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP1) genes in vitro.

Methods  Computer tomography (CT)-guided percutaneous annulus fibrosus injury was performed to build degenerative lumbar intervertebral disc models in 60 New Zealand white rabbits. rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1-transfected rabbit nucleus pulposus cells were transplanted into degenerative lumbar intervertebral discs (transplantation group), phosphate-buffered saline (PBS) was injected into degenerative lumbar intervertebral discs (degeneration control group) and normal lumbar intervertebral discs served as a blank control group. After 6, 10 and 14 weeks, the disc height index (DHI) and signal intensity in intervertebral discs were observed by X-ray and magnetic resonance imaging (MRI) analysis. The expression of CTGF and TIMP1 in nucleus pulposus tissue was determined by Western blotting analysis, the synthesis efficiency of proteoglycan was determined by a ³⁵S-sulfate incorporation assay, and the mRNA expression of type II collagen and proteoglycan was detected by RT-PCR.

Results  MRI confirmed that degenerative intervertebral discs appeared two weeks after percutaneous puncture. Transgenic nucleus pulposus cell transplantation could retard the rapid deterioration of the DHI. MRI indicated that degenerative intervertebral discs were relieved in the transplantation group compared with the degeneration control group. The expression of collagen II mRNA and proteoglycan mRNA was significantly higher in the transplantation group and the blank control group compared with the degeneration control group (P <0.05).

Conclusions  CT-guided percutaneous puncture can successfully build rabbit degenerative intervertebral disc models. Both CTGF and TIMP1-transfected cell transplantation helps to maintain disc height, and promotes the biosynthesis of type II collagen and proteoglycan in intervertebral discs, reversing the degeneration of intervertebral discs.

     

雌激素β受体在人椎间盘髓核细胞上的表达

目的：研究雌激素β受体（ERβ）在人椎间盘髓核细胞上的表达。方法：7例椎间盘突出症患者,手术切除之髓核组织经体外消化、细胞培养,提取总RNA,RT-PCR检测ERβ基因的表达;另外通过免疫组织化学方法检测ERβ在人椎间盘髓核细胞中的分布。结果：7例样本RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,在323 bp处有单一高亮条带;免疫组织化学方法亦证实细胞质中有ERβ的分布。结论：人椎间盘髓核细胞中存在ERβ的表达。     

髓核研究的现状难以诠释椎间盘退变之道

最近,《关节炎和风湿病》（Anhrilis Rheum）杂志上刊载的1篇题为“人退变椎间盘髓核细胞中,整合素传导通路的变化”的研究文章引起了我们的关注。我们对该文进行仔细研读后,结合我们在人髓核细胞和椎间盘退变领域的研究,就人髓核细胞的培养,椎间盘退变的分级以及正常椎间盘的界定等方面提出了我们的见解,并就相关问题进行了对比和总结。我们撰写的Letter发表在《Anhrilis Rheum》杂志上。     

平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究

目的:探讨兔髓核细胞平面和三维培养对其增殖及基质合成的影响,为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。方法:体外培养兔髓核细胞,分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组,利用倒置显微镜、扫描电镜进行髓核细胞形态学观察,MTT法测定各组髓核细胞增殖情况,HE染色、免疫组化分析髓核细胞Ⅱ型胶原的表达,阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的糖胺聚糖(GAG)含量。结果:经过两周的培养,两组髓核细胞均能够增殖;与平面培养组相比,三维培养组细胞增殖率、Ⅱ型胶原表达量、GAG合成量均增高(均P<0.01)。结论:髓核细胞能够与PLGA支架很好地黏附并增殖;PLGA支架三维培养较平面培养能促进髓核细胞增殖,提高Ⅱ型胶原和GAG的合成量,可作为椎间盘组织工程种子细胞获取的一种新方法。     

退变颈椎椎间盘髓核中磷酸化p38 MAPK的表达

目的观察不同退变程度颈椎病患者椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)的病理改变及磷酸化p38MAPK(phosphorylated p38mitogen activated protein kinase,p-p38MAPK)的表达差异,探讨颈椎椎间盘退变可能的分子机制。方法收集2008年10月至2009年5月在我院行手术治疗的35例颈椎病患者的NP组织,获取术前相应颈椎MRI(T2像正中矢状位)资料。其中男性25例,女性10例,年龄27~82岁,5例来自单间隙,18例来自两间隙,12例来自三间隙;4例为C3/4、12例为C4/5、14例为C5/6、5例为C6/7。19例NP组织用于普通病理和免疫组织化学染色,16例用于蛋白质印迹分析。采用颈椎椎间盘MRI退变分级系统评定术前NP组织标本相应MRI退变程度。观察不同退变程度时NP组织的病理改变及p-p38MAPK在NP组织中的定位;分析退变椎间盘中p-p38MAPK含量与其MRI退变程度间的关系。结果随着颈椎椎间盘退变程度加重,NP内胶原纤维逐渐增多、增粗、变性,甚至聚合成团,NP逐渐纤维化;p-p38MAPK定位于NP细胞胞核;NP细胞p-p38...     

骨形态发生蛋白9激活PI3K/Akt信号通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡

目的 研究骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)对退变髓核细胞炎症反应和凋亡的影响,并探究其与PI3 K/Akt信号通路的关系.方法 通过氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)培养建立退变髓核细胞模型;重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)将BMP9转染人人髓核细胞内(human nucleus pulposus cells,HNPCs),实验共分5组:Control组(正常培养的HNPCs)、OGD组(氧糖剥夺模型)、AAV组(氧糖剥夺模型,转染AAV空载体)、AAV-BMP9组(氧糖剥夺模型,转染AAV-BMP9),AAV-BMP9+LY294002组(AAV-BMP9组基础上添加PI3K抑制剂LY294002).免疫荧光方法检测蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原(typeⅡcollagen,Col2a1)的表达;Western blot检测p-Akt和p-mTOR的蛋白表达;酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表达;流式细胞术检测细胞的凋亡.结果 在氧糖剥夺培养模型中Aggrecan和Col2al表达明显降低;AAV-BMP9组中p-Akt和p-mTOR的表达明显高于OGD组和AAV组(P＜0.05);此外,AAV-BMP9组HNPCs分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8明显减少,细胞凋亡被显著抑制(P＜0.05);LY294002的加入能够显著逆转BMP9的上述效果.结论 BMP9能够抑制退变HNPCs的炎症反应和凋亡,并且这种作用是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的.     

Wip1联合Bmi1参与人椎间盘髓核细胞放射性损伤DNA修复

目的探讨野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(Wip1)在人椎间盘髓核细胞放射性损伤DNA修复中的可能作用,为椎间盘退行性变的临床诊治提供参考。方法取人椎间盘髓核细胞体外培养,小干扰(siRNA)技术干扰细胞Wip1表达,放射性照射(4、10、15、25Gy)髓核细胞,采用彗尾实验观察DNA损伤及损伤修复反应(DNAdamagerepair,DDR)情况,并与未干扰Wip1髓核细胞作对照;采用免疫共沉淀(Co-IP)技术检测Wip1潜在结合蛋白;根据筛选结果采用实时定量RT-PCR技术检测病变椎间盘组织Wip1及潜在结合蛋白的表达情况。结果彗尾实验表明:干扰Wip1表达后,25Gy剂量射线导致髓核细胞DNA损伤的修复并不受影响,但DDR持续激活,对照组在照射后24h已经检测不到DNA损伤修复的标识分子,但siRNA干扰Wip1表达组细胞照射后48h仍可检测到标识分子。Co-IP实验表明:放射性照射正常对照细胞后,Wip1与Bmi1在细胞核内分布重合,而且聚集在DNA损伤位点,而siRNA抑制Wip1表达后,这种结合随即消失。实时定量RT-PCR结果表明:与正常椎间盘组织相比,椎间盘退变组织Wip1、Bmi1基因表达下降,且两者呈正相关(P<0.05)。结论 Wip1通过调控DDR时限参与了人椎间盘髓核细胞放射性损伤DNA修复,Bmi1可能参与此过程。     

脂联素通过AMPK/mTOR通路抑制H2O2诱导的大鼠髓核细胞凋亡及细胞外基质退变

目的：探讨脂联素（adiponectin,APN）对氧化应激下大鼠髓核细胞凋亡和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）退变的保护作用及相关机制。方法：原代培养SD大鼠髓核细胞,CCK?8法检测细胞活力,以确定APN的最适保护浓度。将细胞分为对照组、H2O2组、APN+H2O2组及Compound C+APN+H2O2组,流式细胞术检测凋亡率,Western blot检测Bcl?2、Bax、Cleaved Caspase?3、基质金属蛋白酶?13（matrix metalloproteinase?13,MMP?13）及带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶?5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs?5,ADAMTS?5）等蛋白的表达,RT?PCR检测Ⅱ型胶原（collagen type Ⅱ alpha 1 chain,COL2A1）、蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）的mRNA水平,Western blot评估5′?单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5′?monophosphate?activated protein kinase,AMPK）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）的磷酸化水平。结果：1 μg/mL APN对200 μmol/L H2O2所致的细胞毒性起最佳拮抗作用。APN预处理显著抑制H2O2诱导的髓核细胞凋亡。相应地,Bax/Bcl?2比值及Cleaved Caspase?3 表达的增加也被APN抑制。尽管对ADAMTS?5无明显抑制作用,APN降低了H2O2诱导的MMP?13的表达。此外,H2O2对COL2A1及ACAN转录的抑制作用也被APN显著缓解。APN还促进AMPK磷酸化并抑制mTOR磷酸化,而AMPK抑制剂Compound C显著减轻了APN对mTOR磷酸化的抑制作用。APN对凋亡、分解代谢的抑制作用及其对合成代谢的促进作用也均被Compound C逆转。结论：APN通过AMPK/mTOR通路抑制H2O2诱导的大鼠髓核细胞凋亡及ECM退变。