miR-99a对乳腺癌细胞侵袭和迁移的负向调控机制研究

目的探讨miR-99a对乳腺癌细胞侵袭及迁移的影响,并初步分析其影响乳腺癌细胞侵袭及迁移的可能分子机制。方法利用荧光实时定量PCR检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中miR-99a的表达。运用脂质体介导的转染方法分别将miR-99a模拟物（miR-99amimics）、miR-99a抑制物（miR-99ainhibitors）以及相应对照miRNA转染MDA-MB-231和MCF-7细胞,通过Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭力;采用Transwell迁移实验及划痕实验检测细胞的迁移能力;利用生物信息学方法预测miR-99a的靶基因,并对靶基因进行验证。结果（1）高转移潜能的MDA-MB-231细胞中miR-99a表达明显低于低转移潜能的MCF-7细胞,划痕实验中转染miR-99amimics的与转染controlmimics的MDA-MB-231细胞比较迁移能力显著减弱（P＜0.05）,而MCF-7细胞转染miR-99ainhibitors后迁移能力明显增强（P＜0.01）。（2）Transwell的侵袭及迁移实验显示,转染miR-99amimics后MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力明显减弱（P＜0.01）;MCF-7细胞转染miR-99ainhibitors后迁移能力增强（P＜0.01）,而侵袭能力基本不变（P＞0.05）。（3）生物信息学方法预测微管相关蛋白（MTMR3）是miR-99a的靶点,实时定量PCR和3′UTR荧光素酶报告基因实验验证了该靶点。（4）干扰了MTMR3后MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力明显减弱。结论（1）miR-99a对乳腺癌细胞的侵袭及迁移发挥负向调控作用。（2）miR-99a可能通过靶向于MTMR3发挥其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的调控作用。     

SHP-1对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭的影响及机制初步探讨

目的探讨SHP-1对人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭能力的影响。方法 MCF-7细胞株分别瞬时转染SHP-1的特异性siRNA干扰序列;然后分别通过RT-PCR和Western-blot检测MCF-7细胞干扰前后SHP-1基因和蛋白表达变化,并通过RT-PCR检测干扰前后MMP-9基因变化;通过Transwell小室实验检测干扰SHP-1对细胞侵袭能力的影响。结果 RT-PCR和Western-blot证实SHP-1在人乳腺癌细胞株MCF-7中有表达以及SHP-1SiRNA的干扰效率;干扰SHP-1后,MMP-9的表达量上调;Transwell小室实验证实,与MCF-7阴性干扰对照及空白对照细胞相比,siRNA组的侵袭能力显著增强(P<0.001)。结论乳腺癌MCF-7中SHP-1的表达水平高低和该细胞侵袭能力高低呈负相关,其侵袭可能和MMP-9的表达呈正相关。     

miR-149对人乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭能力的影响

目的探讨miR-149对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响及其可能作用机制。方法应用miRanda,Tar Base v.5c靶基因预测网站分析miR-149与FOXM1 miRNA的可能结合位点,分别将miR-149模拟物(mimics),拮抗物(inhibitors)和无关序列转染到MCF-7细胞株,以空白转染组为阴性对照,用Western blot的方法比较各组细胞FOXM1蛋白的表达,用Transwell侵袭小室检测各组细胞侵袭能力的变化。结果Western blot结果显示,miR-149 mimics转染组的MCF-7细胞中FOXM1蛋白表达较其余各组显著降低(均P<0.05),Transwell侵袭小室检测结果表明,miR-149 mimics转染组的细胞侵袭细胞数明显多于其余各组(均P<0.05)。结论 miR-149能促进乳腺癌细胞侵袭和转移,其机制可能与抑制FOXM1的表达有关。     

Nanog表达上调促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖和侵袭

目的：观察Nanog高表达对乳腺癌细胞MCF-7生物学特性的影响。方法：构建重组质粒pcDNA3.1（-）-Nanog,利用免疫荧光观察Nanog高表达后,乳腺癌细胞MCF-7中Nanog的定位。利用平皿克隆分离法获得Nanog高表达的乳腺癌细胞系MCF-7。应用克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验观察Nanog高表达对乳腺癌细胞MCF-7生物学特性的影响。结果：Nanog在MCF-7细胞中定位于核,Nanog高表达后,乳腺癌细胞MCF-7的增殖、迁移和侵袭能力显著增强。结论：Nanog能够促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖、迁移和侵袭能力。     

miR-195调控人乳腺癌细胞MCF-7增殖与凋亡的作用及机制研究

目的 研究miR-195调控人乳腺癌细胞MCF-7(MCF-7)增殖与凋亡作用及机制.方法 体外培养正常乳腺上皮细胞MCF-10A(MCF-10A)和MCF-7,qRT-PCR检测miR-195表达,蛋白质免疫印迹(WB)检测蛋白磷酸酶1D(PPM1D)蛋白表达.MCF-7瞬时转染,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,...     

反义miR-18a对乳腺癌细胞侵袭迁移的影响

目的：分析miR-18a在乳腺癌组织中的表达情况;体外研究miR-18a反义寡核酸（antisense oligonucleotide,ASO）对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响。方法：运用荧光定量PCR检测108例乳腺癌组织及对应癌旁乳腺组织中miR-18a的表达;通过miR-18a ASO降低乳腺癌细胞中miR-18a的表达,采用Transwell实验和划痕实验观察miR-18a ASO对乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响,同时运用Western blot的方法检测侵袭相关蛋白的表达变化。结果：在108例乳腺癌病例中,50.93%（55/108）的乳腺癌组织miR-18a表达明显高于对应正常组织（t=28.68,P=0.000）;与空白对照组和转染随机ASO组相比,miR-18a ASO可以明显降低miR-18a的表达（F=321.67,P=0.001;F=563.28,P=0.000）;Transwell实验和划痕实验结果显示转染miR-18a ASO后,乳腺癌细胞的侵袭迁移能力明显下降（P=0.000）,同时相关侵袭蛋白基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）2和MMP9表达下降（P=0.000）。结论：miR-18a在乳腺癌组织中表达上调,降低miR-18a的表达,可有效抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。miR-18a有可能成为乳腺癌侵袭转移调控的新靶点。     

miR let-7b抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移及其机制

目的： 观察miR let-7b对乳腺癌MCF-7细胞迁移能力的影响并探讨其作用机制。方法： 合成miR let-7b并转染乳腺癌MCF-7细胞,以miR-control作参照。通过划痕实验观察转染前后细胞迁移能力的变化,运用 PCR和蛋白质印迹法检测转染miR let-7b前后MCF-7细胞内IL-6表达水平的变化。最后通过信息生物学软件及双荧光酶素报告基因方法验证miR let-7b与IL-6结合。结果： 与对照组比较,转染miR let-7b的MCF-7细胞迁移能力明显降低,而anti-miR let-7b明显促进细胞迁移。转染miR let-7b的乳腺癌MCF-7细胞中IL-6的表达水平较对照组明显降低,而转染anti-miR let-7b的细胞内IL-6的表达水平明显提高。信息生物学软件和双荧光酶素报告基因证实miR let-7b与IL-6结合。结论： miR let-7b在转录水平抑制乳腺癌MCF-7细胞IL-6的表达从而抑制MCF-7细胞的迁移。     

MicroRNA-29a 对人正常滋养细胞迁移和侵袭功能的影响及其可能的机制

目的 检测microRNA-29a（miR-29a）在子痫前期孕妇胎盘组织中的表达及其对人正常滋养细 胞系HTR8/Svneo 迁移和侵袭能力的影响及可能的作用机制。方法 收集行剖宫产分娩的30 例子痫前期孕 妇及30 例正常妊娠孕妇的胎盘组织,应用实时聚合酶链反应（real-time PCR）检测胎盘组织miR-29a 的表 达水平。应用生物信息学软件预测miR-29a 的潜在靶基因,选取ITGB 1 作为研究靶基因。将miR-29a 模拟 物（miR-29a mimics）转染人正常滋养细胞系HTR8/Svneo,real-time PCR 检测转染后HTR8/Svneo 细胞中 miR-29a 的表达变化,划痕实验和Transwell 侵袭实验检测转染后HTR8/Svneo 细胞迁移和侵袭能力的变化, Western blot 检测转染后HTR8/Svneo 细胞ITGB1 蛋白的表达变化。结果 real-time PCR 结果显示子痫前 期孕妇胎盘组织中miR-29a 表达水平均较正常妊娠孕妇增高（P <0.05）。人正常滋养细胞系HTR8/Svneo 细 胞转染miR-29a mimics 后,miR-29a 表达水平增高（P <0.05）,ITGB1 蛋白表达水平降低（P <0.05）,划痕 实验和Transwell 侵袭实验显示细胞迁移和侵袭能力降低（P <0.05）。结论 miR-29a 在子痫前期孕妇胎盘组 织中高表达,可能通过调控ITGB1 的表达参与子痫前期的发生发展。     

靶向干扰CDK2AP1对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响

目的：探讨靶向干扰细胞周期调节蛋白依赖性激酶2-关联蛋白-1（CDK2AP1）对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响。方法构建重组慢病毒 pGCLV- CDK2AP1- shRNA及重组空病毒pGCLV- GFP,分别稳定转染乳腺癌细胞系MCF-7,获得乳腺癌细胞株 MCF-7/RNAi- NC 和 MCF-7/RNAi- CDK2AP1。采用定量 PCR 法检测两组 MCF-7细胞株的CDK2AP1mRNA表达,xCELLigence/RT- CIM实时细胞电子分析系统检测细胞迁移能力,Transwel 实验检测细胞的侵袭能力。结果成功构建乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi- NC和MCF-7/RNAi- CDK2AP1,相比MCF-7/RNAi- NC细胞组,MCF-7/RNAi- CDK2AP1细胞组的CDK2AP1mRNA表达受到明显抑制,其细胞迁移和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）。结论乳腺癌细胞MCF-7中CDK2AP1低表达能有效抑制细胞的体外迁移和侵袭能力。     

Pokemon对乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响

目的 建立稳定表达pokemon乳腺癌细胞系,并观察pokemon对乳腺癌细胞系MCF-7侵袭转移能力的影响. 方法 构建表达pokemon慢病毒载体,将Pokemon表达慢病毒载体转染MCF-7细胞,通过Westernblot方法检测稳定性表达pokemon MCF-7细胞中Pokemon-GFP融合蛋白的表达情况,应用Transwell试验及划痕实验观察pokemon的高表达对MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响. 结果 成功建立稳定表达pokemon的MCF-7细胞系,pokemon可抑制MCF-7细胞侵袭能力. 结论 Pokemon可抑制MCF-7细胞侵袭能力.     

二烯丙基二硫下调p38活性抑制乳腺癌MCF-7细胞侵袭和转移

目的探讨大蒜提取物二烯丙基二硫(DADS)对乳腺癌MCF-7 细胞侵袭转移的作用及其机制。方法采用不同浓度（0, 100,200,400 μmol/L）DADS处理MCF-7人乳腺癌细胞24 h,Transwell侵袭实验检测DADS对细胞侵袭的作用,划痕愈合实验 观察DADS对细胞迁移的改变,Western blotting 检测细胞中上皮标志蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）、间质标志蛋白波形蛋白 （Vimentin）和基质金属蛋白MMP-9的表达和p38活性;TGF-β1上调p-p38表达后上述作用的变化。结果Transwell和划痕愈 合实验发现DADS呈浓度依赖性抑制MCF-7 细胞的侵袭和迁移能力,Western blotting 结果表明DADS可抑制Vimentin 和 MMP-9 的蛋白表达,上调E-cadherin 的表达而下调p38 活性;TGF-β1 可上调p-p38 和MMP-9 表达,明显抵消DADS对MCF-7 细胞的抑制效果。结论DADS可下调p38活性,抑制MCF-7细胞的侵袭转移。     

LncRNA CTD-3252C9.4抑制人胰腺癌Panc-1细胞体外侵袭迁移的机制

研究长链非编码RNA(lncRNA)CTD-3252C9.4对人胰腺癌细胞Panc-1体外迁移和侵袭的抑制作用及其机制。采用培养胰腺癌微球体的三维半固体体系中的表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激培养Panc-1细胞;采用RT-qPCR检测lncRNA CTD-3252C9.4在Panc-1中的表达量和载体转染效率;采用划痕-愈合法和Transwell小室法检测lncRNA CTD-3252C9.4及其靶基因骨形态发生蛋白7(bone morphogenetix protein 7,BMP7)对Panc-1细胞侵袭和迁移能力的影响;采用Western blot验证靶基因BMP7和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白表达量的变化。结果表明:EGF能显著抑制Panc-1中lncRNA CTD-3252C9.4的表达,且该lncRNA能够通过抑制促癌基因BMP7的转录影响细胞侵袭和迁移能力,并且抑制肿瘤的EMT过程。     

miRNA-191对人乳腺癌细胞增殖、侵袭的影响

目的探讨miR-191在人乳腺癌细胞中的表达情况,研究其对乳腺癌细胞的增殖、侵袭的影响。方法 real-time PCR检测乳腺癌细胞[MDA-MB-231(雌激素受体阴性,ER-)、MCF-7(雌激素受体阳性,ER+)]和正常乳腺上皮细胞(HBL-100)中miR-191表达水平的差异;利用Lipofectamine2000将miR-191抑制体瞬时转染乳腺癌MCF-7,并用real-time PCR检测转染效果;分别用CCK-8法检测MCF-7细胞增殖,流式细胞术检测MCF-7细胞的细胞周期,Transwell法检测MCF-7细胞的侵袭能力。结果与正常乳腺细胞相比,miR-191在乳腺癌细胞中高表达(P<0.01),且在ER(+)乳腺癌细胞MCF-7中的表达水平高于ER(-)乳腺癌细胞MDA-MB-231(P<0.01),转染miR-191抑制体后,MCF-7细胞增殖能力(0.65±0.04)较阴性对照组(1.18±0.05)明显受到抑制(F=122.238,P<0.01),侵袭能力(56.67±2.58)较阴性对照组(82.5±5.79)减弱(F=18.734,P<0.01),G0/G1期的细胞比例(73.39±1.10)%较阴性对照组(69.28±2.11)%增加(F=61.060,P<0.01),S期细胞比例(20.9±1.17)%较阴性对照组(25.48±1.19)%减少(F=46.937,P<0.01)。结论 miR-191在人乳腺癌细胞中,特别是ER(+)乳腺癌中高表达,转染miR-191抑制体后,MCF-7细胞增殖、侵袭能力明显受到抑制。     

环境类雌激素双酚A通过上调Snail蛋白表达促进MCF-7乳腺癌细胞迁移

目的:探讨外源性双酚A(BPA)调控MCF-7乳腺癌细胞迁移的分子机制?方法:通过划痕实验和Transwell实验检测MCF-7乳腺癌细胞迁移能力,并以黏附实验反向辅助验证;通过质粒转染干扰Snail蛋白表达水平,进一步研究外源性BPA调控MCF-7乳腺癌细胞迁移的分子机制?结果:外源性BPA能上调细胞中Snail的表达水平,从而下调E-cadherin的表达并促进MCF-7乳腺癌细胞迁移;siRNA干扰Snail表达后MCF-7乳腺癌细胞迁移减慢?此外,BPA刺激能降低MCF-7乳腺癌细胞黏附能力?结论:外源性BPA可通过上调Snail表达水平,促进MCF-7乳腺癌细胞的迁移,为进一步阐明乳腺癌细胞侵袭与转移的分子调控机制提供了新线索?     

靶向TUG1的mir-29c-3p通过调节CAPN7的表达影响膀胱癌细 胞的迁移和侵袭

目的 探讨长链非编码RNA TUG1影响膀胱癌细胞迁移和侵袭的机制。方法 逆转录实时定量PCR检测膀胱癌组织和细胞中TUG1和mir-29c-3p的表达水平。在膀胱癌细胞系T24细胞中利用RNA干扰技术下调TUG1的表达后Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力的变化,并检测CAPN7的表达水平。在膀胱癌细胞系T24细胞中利用mir-29c-3p类似物过表达mir-29c-3p后在转录及转录后水平检测CAPN7的表达变化。功能回复试验验证CAPN7及TUG1对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响。结果 TUG1和mir-29c-3p在膀胱癌细胞和组织中分别表达升高（P=0.01）及减低（P<0.01）,同时它们的表达呈现负相关关系（P=0.0109,r2=0.4295）。TUG1表达下调后可以抑制膀胱癌细胞T24的迁移和侵袭能力（P<0.01）。mir-29c-3p过表达后可以下调CAPN7的表达水平,CAPN7的表达水平与TUG1在膀胱癌中呈正相关关系（P=0.0139,r2=0.4081）,荧光素酶报告试验验证了 mir-29c-3p可同时靶向调节TUG1及CAPN7,功能回复试验验证了TUG1可以正向调节CAPN7的表达及其对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响（P<0.01）。结论 靶向TUG1的mir-29c-3p可通过调节CAPN7的表达影响膀胱癌细胞的迁移和侵袭。     

网络筛选乳腺癌相关miRNAs及miR-106a-5p对乳腺癌细胞侵袭迁移能力的影响

目的 网络筛选乳腺癌关键微小RNAs(microRNAs,miRNAs),并探讨miR-106a-5p对乳腺癌细胞侵袭及迁移能力的影响.方法 通过TargetScan和miRanda等工具,构建miRNAs与靶基因以及显著靶向性功能(gene ontology,GO)的调控网络,筛选对乳腺癌有关键调控作用的miRNAs;利用miR-106a-5p agomir及miR-106a-5p antagomir转染MCF-7、T47D乳腺癌细胞株,建立乳腺癌细胞中miR-106a-5p的过表达及敲低体系,Transwell侵袭实验、Transwell迁移实验、划痕实验检测miR-106a-5p对乳腺癌细胞的侵袭、迁移能力的影响.结果 在miRNAs-gene-network和miRNAs-GO-network两个网络中调控维度最高的miRNAs基本一致,其中miR-106a-5p是调控维度最高的miRNAs之一;过表达miR-106a-5p显著抑制乳腺癌细胞的侵袭能力和迁移能力(P＜0.05),敲低miR-106a-5p则显著增加乳腺癌细胞的侵袭能力和迁移能力(P＜0.05).结论 miR-106a-5p是乳腺癌miRNAs调控网络中的关键miRNAs之一,具有抑制乳腺癌细胞的侵袭及迁移能力的生物学功能.