基于流式细胞术和K-mer分析的黄芪基因组大小估测

目的使用流式细胞术与K-mer分析估测黄芪基因组的大小及复杂程度,为黄芪基因组测序奠定基础。方法以番茄为内标,用流式细胞仪测定经碘化丙啶(PI)染色的番茄细胞核和黄芪细胞核混合样品的PI荧光强度,通过比较黄芪与番茄细胞DNA含量峰值的倍数关系,计算黄芪的基因组大小。采用高通量测序技术进行黄芪基因组调查测序,利用生物信息学方法估计黄芪杂合率、重复序列和GC含量等信息。结果采用流式细胞术测得黄芪基因组大小约为1 426 Mb。通过基因组调查测序,获得了95 Gb黄芪基因组DNA测序数据,K-mer分析表明黄芪基因组约为1 456 Mb,测序深度为39×。K-mer分布曲线有明显的杂合峰,基因组杂合率为2.1%。结论黄芪基因组大小为1.45 Gb左右,杂合率较高。这一结果可为黄芪基因组学研究提供参考。     

刺果甘草全基因组Survey及叶绿体基因组特征分析＊

目的 基于基因组Survey分析对刺果甘草Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.基因组大小和杂合率进行估计，并通过叶绿体基因组序列特征对其在甘草属Glycyrrhiza L.中的系统发育位置进行研究。方法 使用二代测序技术对刺果甘草进行测序，采用K-mer方法对测序reads进行分析，估算刺果甘草基因组大小和杂合率，使用生物信息学方法进行叶绿体基因组组装、注释和系统发育分析。结果 Survey分析结果显示其基因组大小约为577.82 Mb，杂合度约为0.31%，重复序列比例约为53.72%。叶绿体基因组长度为127，267 bp，不具有典型的四分体结构，总GC含量为34.32%，包含110个基因，其中76个蛋白质编码基因，30个tRNA基因和4个rRNA基因。系统发育分析表明，刺果甘草与圆果甘草G. squamulosa Franch.亲缘较接近。结论 刺果甘草存在低杂合和重复序列较多的特点，为了更好地对全基因组进行序列拼接和组装，可尝试采用三代测序结合二代测序的分析策略进行基因组组装；刺果甘草叶绿体全基因组比对和系统发育分析，为后续开展甘草属遗传多样性研究和分子鉴定标记筛选提供了重要依据。     

基于本草基因组学应用流式细胞术和高通量测序技术检测人参基因组大小

人参（Ginseng）是五加科植物人参（Panax ginseng C. A. Mey.）的干燥根和根茎。由于其基因组数据的缺乏制约了人参基础研究和产业发展。本实验以水稻（Oryza sativa ssp. Nipponbare）和大豆（Glycine max(L.) Merrill）为内参,通过流式细胞术检测人参基因组大小约为3.42 Gb;同时,分别构建人参基因组插入片段大小为250 bp和500 bp的鸟枪法（shotgun）文库,利用Illumina Hiseq X Ten平台进行双端PE 150高通量测序,过滤原始测序数据后获得183.82 Gb高质量数据,K-mer分析法预估人参基因组大小为3.35 Gb,测序深度为54.87 X。本研究采用流式细胞术结合K-mer分析法测定人参基因组大小,为人参全基因组测序以及本草基因组学的研究提供基础数据。     

川芎基因组survey测序及其特征分析

目的 利用流式细胞术和高通量测序技术,对川芎Ligusticum chuanxiong基因组大小和特征进行分析,为川芎全基因组精细测序和分子机制研究奠定基础。方法 以已知基因组大小的绿豆和陆地棉作为内标植物,用流式细胞术估算川芎基因组大小。利用高通量测序技术对川芎基因组进行survey分析,测算出川芎基因组大小、重复序列、杂合率和GC含量等,利用生物信息学对基因组进行预测、注释和基因家族鉴定。结果 估算出川芎基因组大小约为3058.37Mb,重复序列为79.79%,杂合率约2.16%,GC含量为36.32%,川芎基因组呈现高重复、高杂合、基因组庞大等特征。共预测到34864个基因,有30 737个基因在功能数据库中被注释,有53个基因注释到阿魏酸合成过程中。初步鉴定到2058个特异基因家族,2001个单拷贝基因。结论 初步获得了川芎基因组大小、基因组特征、功能基因及基因家族等信息,为进一步川芎全基因组精细测序提供了参考,为阐明川芎阿魏酸等药效成分生物合成提供了基因资源。     

裸花紫珠基因组调研及SSR特征分析

裸花紫珠是海南省特色黎族药大品种,具有止血散瘀、消炎抗菌之功效。目前,裸花紫珠参考基因组信息缺乏。通过研究裸花紫珠的基因组大小、杂合率及SSR特征,可为裸花紫珠基因组精细测序的文库构建和SSR分子标记的开发提供依据。为此,该研究采用二代测序方法,基于K-mer分析手段来研究裸花紫珠基因组的大小及杂合率,在此基础上采用MISA工具分析其SSR特征。结果表明,裸花紫珠基因组大小约为822. 43 Mb,重复序列比例约71. 67%,杂合率约0. 85%,基因组的GC量约49. 20%。提示裸花紫珠为高杂合、高重复的复杂基因组。通过对基因组序列进行SSR特征分析,共鉴定了206 049个SSR,其中,单、双、三核苷酸重复基序占比较高,共198 993个,占96. 57%。在2～6核苷酸重复基序类型中分别是AT/AT,AAT/ATT,AGCC/CTGG,AAAAT/ATTTT,AGATAT/ATATCT的数量最多。该研究为裸花紫珠基因组精细测序的文库构建提供了参考,同时为其SSR分子标记开发和基因资源的保护和利用提供了分子依据。     

基于流式细胞术和基因组survey分析的地黄基因组研究

目的地黄Rehmannia glutinosa是我国传统中药,具有较高的药用价值和经济价值。利用流式细胞技术和高通量测序技术,分析了地黄基因组大小和特征等信息,为绘制地黄全基因组精细图谱提供依据。方法将已知基因组大小的大豆Glycine max和辣椒Capsicum annuum作为对照,用流式细胞技术估算地黄基因组大小。然后利用高通量测序技术对地黄基因组进行survey分析,通过生物信息学分析获得了地黄全基因组重复序列比例、基因组杂合度以及GC含量等信息。结果根据流式细胞实验结果,地黄基因组大小介于大豆和辣椒之间,估算地黄基因组大小应在2.00~2.12 Gb。通过高通量测序,获得了132.79 Gb高质量的数据,总测序深度约为66.40×,估算地黄基因组大小为2.03 Gb。根据Kmer分布情况,估算地黄基因组重复序列比例为78.48%,杂合度为1.93%,GC含量为37.27%。从基因组基本结构特征上看,地黄基因组属于高重复、高杂合、大基因组的复杂基因组。结论获得了地黄基因组大小和特征等信息,这些信息将为绘制地黄全基因组的精细图谱奠定基础,也为阐明地黄有效成分的生物合成和调控途径提供依据。     

三岛柴胡基因组Survey分析及SSR位点挖掘

柴胡是我国传统中药材,主要用于治疗感冒及保肝护肝等。三岛柴胡是日本栽培品种,在我国和韩国等国家地区亦有种植。在大规模全基因组深度测序之前,需要进行低覆盖度的基因组Survey测序,以评价基因组的大小及复杂程度,确定适合该植物全基因组测序研究策略。该研究采用二代高通量测序技术(Illumina Hiseq 2000)进行了三岛柴胡的Survey测序分析,并对所获得基因组序列进行了SSR分析,利用Primer 3设计SSR特异引物并随机选择33对引物以三岛柴胡DNA为模板,进行PCR扩增,对PCR体系以及最佳退火温度进行筛选。共获得了288. 64 G基因组数据,估计基因组大小为2 119. 58Mb,测得基因组数据深度为138×,杂合率为1. 84%,重复序列比例为83. 89%,推测三岛柴胡基因组属于复杂基因组。采用K-mer=41初步组装,得到contig N50 224 bp,总长896. 97 Mb,scaffold N50 313 bp,总长922. 67 Mb。三岛柴胡基因组序列数据中,共检测到91 377条SSR序列,分布于70 809条独立基因。主要类型为二核苷酸重复,存在49 680条,占比70. 16%。在合成的33对引物中,有21对引物成功扩增出目标条带。研究结果为后续大规模基因组测序、开发鉴定柴胡种质和性状定位的SSR分子标记奠定了基础。     

千里香杂合度PCR-RFLP快速评估方法的建立

目的 建立一种快速评估千里香种质材料杂合度的方法，为制定千里香的优异种质繁育策略和促进种质创新提供依据。方法 以65株千里香重测序数据为基础，检测并筛选单核苷酸多态性（SNPs），利用其中20个SNP位点，通过自编脚本将其转化为限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）标记；采用聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）法对12份千里香种质的20个RFLP标记进行检测，根据RFLP标记位点酶切片段数目计算千里香种质的杂合度；采用plink软件计算12份千里香种质的全基因组杂合度，并比较不同种质杂合度评估方法得到的结果。结果 PCR-RFLP法和基因组重测序法计算的杂合度间差异无统计学意义。利用PCR-RFLP法筛选获得了8份杂合度<30%的种质材料，利用基因组重测序法筛选获得9份杂合度<30%的种质材料，2种方法计算杂合度均<30%的种质材料共7份。结论 该文建立了千里香种质杂合度评估的PCR-RFLP法，其精确度为87.5%，准确率为77.8%，该法可为其他药用植物种质杂合度评估方法研究提供借鉴。     

流式细胞术测定苦参基因组大小

目的用流式细胞术测定苦参的基因组大小。方法摘取新鲜的苦参嫩叶,用大豆William 82作为内标,用Galbraith's裂解液提取苦参细胞核悬液,经流式细胞仪检测苦参和大豆的荧光强度。结果估测出苦参的基因组大小约为2.36 Gb。结论该方法明确了苦参的基因组大小,可为破译苦参基因组的方案选择提供数据参考。     

苦豆子总生物碱冻干粉针的制备及其抑瘤作用考察

目的： 考察苦豆子总生物碱注射用冻干粉针的成型工艺并观察其对小鼠肝癌H22移植性肿瘤的抑瘤作用。方法：以颜色、澄明度、水溶性及成形性为指标,通过单因素试验筛选充填剂的种类和用量,确定苦豆子总生物碱注射用冻干粉针的最佳处方;选取药液质量浓度及pH为考察因素,采用单因素试验优选苦豆子总生物碱注射用冻干粉针的制备工艺,测定最低共熔点并绘制冷冻干燥曲线。通过在小鼠右腋皮下无菌接种小鼠肝癌H22腹水瘤瘤株,观察苦豆子总生物碱注射用冻干粉针对该移植性肿瘤的抑瘤作用。结果：选取80 g·L^-1甘露醇为填充剂,冻干前药液中苦豆子总生物碱质量浓度为25 g·L^-1,pH 6.5~7.5时,冻干效果最好,复溶速度快。苦豆子总碱注射用冻干粉针高（120 mg·kg^-1）、中（60 mg·kg^-1）剂量组对小鼠肝癌H22移植性肿瘤的平均抑瘤率分别为56.08%,35.49%。结论：苦豆子总生物碱冻干粉针制备工艺合理且重复性好,质量稳定,对小鼠肝癌H22移植性肿瘤具有明显的抑瘤作用并呈明显量效关系。     

苦豆子不同部位总生物碱提取物指纹图谱分析

目的:研究苦豆子不同部位总生物碱提取物的HPLC指纹图谱,为科学评价及有效控制苦豆子总生物碱提取物的质量提供依据。方法:采用HPLC-DAD方法,对不同主产区的16批苦豆子种子(苦豆籽)和地上部分(苦豆草)总生物碱提取物进行指纹图谱研究,采用相似度评价对指纹图谱进行分析,同时运用聚类分析及主成分分析对其进行模式识别。结果:分别建立苦豆籽和苦豆草提取物对照指纹图谱,确定共有峰,并指认色谱峰。通过聚类分析和主成分分析将16批药材总生物碱提取物按不同产地分为3类。结论:苦豆籽和苦豆草提取物的指纹图谱特征性及专属性良好,可用于全面控制苦豆籽和苦豆草总生物碱的质量。     

基于Illumina高通量测序技术的草豆蔻基因组研究

目的对药食同源植物草豆蔻Alpinia katsumadai进行基因组调研分析,完善草豆蔻基因组遗传信息。方法研究采用Illumina高通量测序技术,基于K-mer分析手段来研究草豆蔻基因组的大小及杂合度,利用MISA方法分析可能的SSR分子标记。结果草豆蔻的基因组大小为1.60 Gb,基因组杂合度为0.44%,重复序列比例为72.72%;在基因组序列中,进行SSR分子标记分析,共鉴定出了364 395个SSR,其中,单、双、三核苷酸重复模体的比例较高,分别占比64.25%、24.05%、10.31%;从测序得到的350 bp文库中,随机取10 000条单端reads,与NT库进行BLAST比对,发现草豆蔻的近缘物种艳山姜Alpinia zerumbet和小豆蔻Elettaria cardamomum上的reads数分别占比对上NT库reads数的12.89%和12.36%。结论通过对草豆蔻植物的基因组大小、杂合度调查及SSR分子标记分析表明,草豆蔻物种基因组属于高重复、大基因组的复杂基因组,这为草豆蔻的资源保护和遗传多样性分析及品种选育提供了遗传信息支撑。     

乙酰化苦豆子多糖的制备及溶液构象

目的:制备乙酰化苦豆子多糖,并对修饰后的乙酰化苦豆子多糖溶液的构象特征进行研究。方法:对苦豆子多糖进行乙酰化修饰,采用取代度测定、红外光谱分析手段对修饰结果进行验证,采用碘-碘化钾反应和刚果红试验研究乙酰化苦豆子多糖的构象特征,采用圆二色谱法(CD)对不同因素影响下乙酰化苦豆子多糖的溶液行为进行研究。结果:乙酰化苦豆子多糖修饰成功,取代度为0.84,其溶液行为显示乙酰化苦豆子多糖具有多股螺旋结构以及较长的侧链和较多的分支,并且溶液构象受浓度、温度以及添加金属离子的影响而变化。结论:成功修饰获得乙酰化苦豆子多糖,并对其溶液构象进行了全面研究,为其进一步研究提供了参考。     

响应面分析法优化苦豆子多糖的醇沉工艺

目的:优化苦豆子多糖的醇沉工艺.方法:在单因素试验基础上,以多糖提取率为指标,依据响应面法原理,使用Design Expert软件的中心组合设计建立试验数学模型,考察醇沉时间、乙醇体积分数及用量对醇沉工艺的影响.采用苯酚-浓硫酸法测定苦豆子多糖含量.结果:最佳醇沉工艺条件为加4.3倍量97％乙醇醇沉26 h,苦豆子多糖提取率6.98％,与预测值(7.03％)的相对误差0.71％.结论:响应面法可有效用于优化苦豆子多糖的醇沉工艺.     

苦豆子不同提取物对小鼠急性毒性的“谱-毒”关系研究

目的建立苦豆子提取物HPLC化学指纹图谱,测定苦豆子在不同提取物对小鼠的半数致死量(LD_(50)),分析其"谱-毒"关系。方法采用75%乙醇回流法(ER)、水煎煮法(WD)、75%乙醇超声法(EU)和水超声法(WU)分别制备苦豆子提取物,并建立其HPLC指纹图谱,测定不同提取物的LD_(50);运用指纹图谱相似度评价系统软件分析不同提取方法下苦豆子提取物化学成分与LD_(50)之间的关系。结果 ER、WD、EU、WU 4种提取方法制备的苦豆子提取物LD_(50)分别为38.397、24.994、18.536、19.957g/kg;苦豆子提取物对小鼠脏器的眼观病变主要表现在肝、肾,其中以ER提取物毒性最大。苦豆子提取物HPLC 10个共有峰可分为2类,第4、10号峰及氧化苦参碱、氧化槐果碱与LD_(50)呈显著负相关。结论构建了苦豆子"谱-毒"关系分析方法,其未鉴定出的第4、10号峰及氧化苦参碱和氧化槐果碱为毒性反应的主要化学成分。