MALAT1调控肿瘤细胞中免疫相关蛋白IRF3的表达

【】 目的 验证长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA) MALAT1与干扰素调节因子3(Interferon regulation factor 3,IRF3)的靶向调控关系。方法 将人IRF3启动子荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-56与将MALAT1敲降的siRNA阴性对照物(siNC)或siMALAT1-1、siMALAT1-2瞬时共转染A549细胞,检测相对荧光素酶活性。同样使用siNC或siMALAT1-1、siMALAT1-2瞬时共转染A549细胞,反转录-实时荧光定量PCR检测IRF3 mRNA表达水平,western blot 检测IRF3蛋白表达水平。结果 1. 检测相对荧光素酶活性的结果：siNC组、siMALAT1-1组和siMALAT1-2组的相对荧光素酶活性分别是17.19±0.96、11.98±2.31和14.26±0.8,均有统计学意义(P＜0.05);2.MALAT1与IRF3 mRNA水平检测结果：siNC组、siMALAT1-1组和siMALAT1-2组的MALAT1 mRNA相对表达量分别为1.01±0.01、0.52±0.12以及0.60±0.08,均有统计学意义(P＜0.05)。siNC组、siMALAT1-1组和siMALAT1-2组的IRF3 mRNA相对表达量分别为1.00±0.01、0.66±0.05和0.80±0.05,均有统计学意义(P＜0.05);3.IRF3蛋白表达水平结果：siNC组、siMALAT1-1组和siMALAT1-2组的IRF3蛋白表达水平分别是0.79±0.09、0.59±0.08和0.62±0.09,均有统计学意义(P＜0.05)。结论 IRF3是MALAT1的靶基因,MALAT1通过调控IRF3启动子区来影响IRF3的转录与表达。     

YAP对非小细胞肺癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的：探讨长链非编码RNA （lncRNA） MALAT1在YAP调控的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖和迁移中的作用,并阐明其作用机制。方法：选择A549和H1299细胞系分为Scramble siRNA组（转染Scramble siRNA）、siYAP-1组（转染siYAP-1）和siYAP-2组（转染siYAP-2）。RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中YAP和MALAT1mRNA及YAP蛋白表达水平;在A549和H1299细胞中分别转染pcDNA3.1-YAP质粒（pcDNA3.1-YAP组）、共转染pcDNA3.1-YAP质粒和siMALAT1-2（pcDNA3.1-YAP+siMALAT1-2组）及对照质粒（pcDNA3.1-YAP+Scramble siRNA组）,CCK-8法检测各组细胞增殖能力,细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力。结果：siYAP-1组和siYAP-2组A549和H1299细胞中YAP mRNA及蛋白表达水平均明显低于Scramble siRNA组（P<0.05）,siYAP-1组和siYAP-2组A549和H1299细胞中MALAT1mRNA表达水平低于Scramble siRNA组（P<0.05）;与pcDNA3.1-YAP组比较,pcDNA3.1-YAP+siMALAT1-2组A549和H1299细胞增殖能力降低（P<0.05）,H1299细胞迁移能力降低（P<0.05）。结论：在NSCLC细胞中,YAP通过调控lncRNA MALAT1的表达促进细胞的增殖和迁移。     

基于T7RNA聚合酶／启动子的细胞融合报导系统载体的构建

目的：建立T7RNA聚合酶／T7启动子载体系统,作为观察细胞融合是否成功的报导系统。方法：设计并合成引物从BL21细菌中扩增T7RNA聚合酶序列,并将其克隆进入真核表达载体pRc／CMV2中,作为RNA聚合酶的供体。T7RNA聚合酶特异性识别的r17启动子人工合成,构建于荧光素酶的表达载体pGL3中,利用其荧光素酶基因作为报导基因。两质粒共转染A549细胞和VeroE6细胞,检测荧光素酶的表达。结果：共转染pRc／CMV2。T7RNAP和pGL3-T7的A549细胞和VeroE6细胞的荧光强度分别为57745±7747和43679±8616,转染质粒pGL3-T7的细胞空白对照荧光强度1034±201和1091±157,分别与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：成功构建了T7RNA聚合酶/T7启动子载体的细胞融合报导系统,可应用于细胞融合的相关实验研究中。     

NF⁃κB p65调控IRF⁃8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的：探讨大鼠核因子?κB（nuclear factor?κB,NF?κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8（interferon regulatory factor?8,IRF?8）基因启动的影响,并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中,构建大鼠野生型（wild type,WT）p65过表达质粒（pIRES2?p65 WT）。在此基础上,将p65第535位丝氨酸（serine,S）突变为天冬氨酸（aspartic,D）或丙氨酸（alanine,A）,分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2?p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2?p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF?8启动子全长（full?length,FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3?IRF?8?FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?2（-752 ~ +174 nt）和pGL3?IRF?8?3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T,HEK?293T）细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性,并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T,发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性,且以pIRES2?p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2?p65 S535A后,IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现,pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2,提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动,且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。     

长链非编码RNA MALAT1对氧糖剥夺/复氧诱导的人脑微血管内皮细胞血管生成的影响

目的：探讨长链非编码RNA (lncRNA)肺腺癌转移相关转录本1 (MALAT1)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)血管生成的影响,并阐明其潜在的分子机制。方法：采用生物信息学方法预测MALAT1、不均一核糖核蛋白K (hnRNPK)和血管内皮生长因子A (VEGFA)的结合位点。HBMECs进行OGD/R处理构建脑缺血细胞模型,分为对照组、OGD/R模型组、OGD/R+siNC组、OGD/R+沉默MALAT1 (OGD/R+siMALAT1)组和OGD/R+siMALAT1+过表达VEGFA (OGD/R+siMALAT1+VEGFA)组。采用小干扰RNA (siRNA)沉默MALAT1的表达,采用pcDNA载体构建VEGFA过表达载体,将构建的siMALAT1和pcDNA VEGFA载体分别或同时转染至HBMECs中。利用管形成实验检测各组细胞血管形成能力,Western blotting法检测各组细胞中VEGFA蛋白表达水平。6周龄健康雄性C57BL/6 J小鼠20只,随机分为假手术组、大脑中动脉闭塞(MCAO)模型组、MCAO+NC空载体(...     

NR6A1在HepG2细胞中抑制HBV转录与复制的初步研究

目的：筛选核受体家族中对乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）增强子或核心启动子转录活性有影响的基因,初步研究生殖细胞核因子（germ cell nuclear factor,NR6A1）对HBV转录与复制的调控作用。方法：克隆带有核受体家族基因的表达质粒,与海肾荧光素酶报告质粒pcore-Rluc共转染,转染后检测荧光素酶活性,筛选对增强子或核心启动子转录活性有影响的核受体基因。然后在HepG2细胞中共转染HBV1.3倍体质粒与NR6A1表达质粒;通过Southern blot检测细胞内复制的HBV DNA;Northern blot检测HBV RNA的转录情况。结果：筛选出对HBV增强子/核心启动子有明显影响的基因NR6A1,其作用与对照组（空载和pcore-Rluc共转染）相比,Rluc活性下降约80%,对照组为1.000±0.319,NR6A1组为0.198±0.009（P=0.000）。NR6A1过表达时,BCP（核心启动子,PCH9-1744-Rluc）实验组荧光素酶活性相对值（0.504±0.023）较对照组（空载和PCH9-1744-Rluc共转染,1.000±0.099）下降约50%（t=6.534,P=0.0226）,BCP（核心启动子）+Enh Ⅱ（PCH9-1636-Rluc）实验组荧光素酶活性相对值（0.089±0.002）比对照组（空载和PCH9-1636-Rluc共转染,1.000±0.042）下降约92%（t=31.59,P=0.001）。NR6A1N（NR6A1DBD+Hinge）荧光素酶活性相对值相对于阳性对照组（NR6A1和pcore-Rluc共转染,1.150±0.141）无统计学差异,其荧光素酶活性相对值为（1.000±0.170）（P＞0.05）。NR6A1C（NR6A1LBD+Hinge）荧光素酶活性相对值相对于阳性对照组（NR6A1和pcore-Rluc共转染,1.150±0.141）无统计学差异,其荧光素酶活性相对值为（1.160±0.078）（P＞0.05）。结论：过表达NR6A1通过抑制核心启动子和增强子II的活性能够显著抑制乙肝病毒的复制。     

曲谷抑霉素A调控人干扰素调节因子3基因初步研究

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACi）曲谷抑霉素A（trichostain A, TSA）对人干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3, IRF3）基因表达的影响,初步分析TSA调控IRF3基因的乙酰化机制。方法：双荧光素酶活性分析法检测TSA和组蛋白乙酰化酶（histone acetylase, HAT）野生型p300对IRF3基因启动子活性的影响;实时荧光定量PCR检测TSA对IRF-3基因mRNA水平的影响;Western blot检测TSA对IRF3蛋白水平的影响。结果：不同浓度TSA干预后IRF3基因启动子活性均增加,TSA浓度为1 μmol/L时,PS1、PS6相对荧光素酶活性分别增加75%、155%;过表达野生型p300后PS1相对荧光素酶活性增加267%;TSA（1、10 μmol/L）干预细胞6 h后,IRF3基因mRNA水平增加23%、39%,干预24 h后,mRNA水平增加17%、64%;TSA（0.1、1、5 μmol/L）干预细胞24 h后,蛋白表达量分别增加15%、72%、191%。结论：TSA上调IRF3基因mRNA和蛋白表达,TSA和组蛋白乙酰化酶p300均可正向调控IRF3基因启动子活性,TSA可能通过IRF3通路发挥治疗免疫性疾病和抗肿瘤作用。     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游,构建pGL3-hTERTp重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5,检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40）,片段长度为1084bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性,在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性,hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定

目的：构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞（A549）后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法：以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张（分别为5%和20%）刺激下荧光素酶的活性变化.结果：PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍（P〈0.05）;而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍（P〈0.01）.结论：利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.     

MASPIN在卵巢癌SKOV3细胞中表达调控机理的研究

目的 构建并瞬时转染P63和MASPIN报告基因质粒,检测转染前后MASPIN启动子活性的改变,初步探讨在卵巢癌中P63对MASPIN表达的调控作用.方法 构建MASPIN报告基因质粒,并与P63质粒(TAP63、△NP63)共转染卵巢癌SKOV3细胞,荧光素酶测定转染后MASPIN启动子活性的变化情况;P63质粒体外瞬时转染卵巢癌SKOV3细胞,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测转染后MASPIN mRNA表达水平的变化.结果 成功构建MASPIN报告基因质粒,并与P63质粒(TAP63、△NP63)共转染SKOV3细胞,荧光素酶报告基因法检测发现TAP63转染组MASPIN启动子活性高于空载体组和△NP63组(P＜0.05),而后两组之间差异无统计学意义(P＞0.05);P63质粒(TAP63、△NP63)瞬时转染SKOV3细胞,RT-PCR方法检测发现,TAP63转染组MASPIN mRNA表达高于未转染组、空载体组和△NP63组(P＜0.05),而后3组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TAP63能增强MASPIN启动子转录活性及MASPIN mRNA的表达,MASPIN可能是TAP63一个新的分子作用靶点.     

乙型肝炎病毒前S2蛋白激活人酰基蛋白硫酯酶1启动子

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S2蛋白（preS2）对人酰基蛋白硫酯酶1（APT1）启动子的作用。方法生物信息学方法确定人APT1启动子序列。PCR扩增人APT1启动子和HBV preS2基因,分别插入pGL3和pcDNA3．1（－）质粒构建人APT1启动子荧光素酶报告基因质粒 pGL3‐APT1和 HBV preS2真核表达质粒 pcDNA3．1（－）‐preS2。将 pGL3‐APT1和pcDNA3．1（－）‐preS2共转染人肝癌细胞系 HepG2,然后通过检测细胞荧光素酶活性来评价 preS2对人APT1基因启动子的作用。数据用独立样本 t检验分析。结果测序结果证实pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1与实验设计相符。pGL3‐APT1的荧光素酶活性是阳性对照质粒pGL3‐Control的荧光素酶活性的1．2倍（P＜0．01）。pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1共转染HepG2细胞的荧光素酶活性为无preS2基因质粒pcDNA3．1（－）与pGL3‐APT1共转染 HepG2细胞荧光素酶活性的2．6倍（P＜0．01）。结论本研究克隆的人APT1启动子序列具有高启动子活性;HBV preS2可激活人APT1启动子。     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

长链非编码RNA MALAT1促进皮肤鳞癌的发生和发展

目的探索长链非编码RNA MALAT1在皮肤鳞癌发生发展中的作用,为皮肤鳞癌的临床治疗提供基础理论依据。方法 收集55例皮肤鳞癌样本和10例正常皮肤组织样本,采用qRT-PCR与原位杂交方法检测MALAT1在皮肤鳞癌组织和正常组织 中的表达情况。在皮肤鳞癌细胞株A431中,采用siRNAs（siNC, siMALAT1-1, siMALAT1-2）和Lipofectamine2000进行细胞转 染来敲减基因,采用Transwell实验,细胞划痕实验,CCK增殖实验检测皮肤鳞癌细胞的迁移侵袭能力,运动能力和增殖能力。 采用qRT-PCR方法检测A431中MALAT1与上皮间质转化（EMT）样转化相关因子（E-cadherin, Vimentin, β-catenin）的变化;明 确其关系。结果相比正常组织,皮肤鳞癌组织的不同分化水平上（高分化,中分化,低分化）,MALAT1 的表达率均升高（P< 0.001）。在皮肤鳞癌细胞A431 中,转染MALAT1 siRNAs 下调其表达后,与对照相比,其增殖能力（P<0.001）,迁移能力（P< 0.01）,侵袭能力（P<0.01）,细胞划痕运动能力均下降（P<0.01）。且EMT相关因子中上皮表型标志物E-cadherin,β-catenin的表 达升高（P<0.01）,间质表型分子vimentin 表达降低（P<0.01）。结论长链非编码RNA MALAT1在皮肤鳞癌的发生发展中起促 进作用,可以为皮肤鳞癌的临床治疗提供基础理论依据。     

TLR7在呼吸道合胞病毒感染A549细胞诱导I型干扰素中的作用

目的：探讨 Toll 样受体7（TLR7）在呼吸道合胞病毒（RSV）感染 A549细胞诱导产生 I 型干扰素（IFN）抗病毒免疫反应中的作用。方法实验分正常对照组、RSV 感染组、TLR7 siRNA 沉默组,分别于感染的4、8、12、24 h 后收集各组细胞以及培养上清液。TLR7 siRNA 通过瞬时转染 A549细胞,半定量 RT-PCR 法检测 TLR7基因沉默效果;TRIzol 试剂提取细胞总 RNA,检测 TLR7、干扰素调节因子7（IRF7）、IFN-α、IFN-β的 mRNA 表达量变化;通过 Western blot 法检测 TLR7蛋白表达量;ELISA 法检测感染不同时间点 A549细胞培养上清液中 IFNα／β含量的变化。结果①转染24 h 后 TLR7 siRNA-2有效抑制 TLR7 mRNA 表达;② RSV 感染A549细胞后,TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA 以及 TLR7蛋白的表达量均升高,并与 RSV 感染之间存在时间依赖性关系;沉默 TLR7后,TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA 以及 TLR7蛋白的表达量较感染组均有明显下降;③ RSV 感染 A549细胞后,明显上调细胞培养上清液中 IFN-α／β的水平,TLR7 siRNA 沉默组 IFN-α／β的表达水平较 RSV 感染组均下降,差异有统计学意义,且 IFN-α的表达量下调更为显著。结论RSV 感染A549细胞后,TLR7被活化能够诱导产生I 型IFN,发挥抗病毒作用,且TLR7诱导产生的I 型IFN 以IFN-α为主。     

人FAT1基因启动子的克隆鉴定及其功能浅析

目的：克隆人脂肪非典型钙黏蛋白1（FAT atypical cadherin 1,FAT1）基因启动子,找到核心启动子区域并对其转录调控机制进行初步分析。方法：通过PCR方法获得人FAT1基因5′上游1 163 bp（-1 029~+134 bp）的片段,亚克隆至pGL3?basic载体;通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒。双荧光素酶报告活性分析检测各重组质粒在A549细胞和HEK293T细胞中的活性,找到核心启动子区域。利用生物信息学方法预测核心区域的转录因子结合位点。结果：经测序、酶切鉴定,成功构建了人FAT1启动子荧光素酶活性报告基因重组质粒。与pGL3?basic质粒相比,人FAT1启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加（P < 0.05）。通过生物信息学软件预测人FAT1启动子区域（-233~-110 bp）可能含有TFAP2C、KLF5等转录因子结合位点。结论：成功构建人FAT1启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因重组质粒。通过荧光素酶活性比较,推测人FAT1的核心启动子区域位于-233~+134 bp区域,其中可能含有若干转录因子结合位点。     

ZHX2在调控背根神经节m阿片受体表达致神经病理性痛中的作用

目的探讨背根神经节（DRG）转录因子锌指和同源框蛋白2（ZHX2）在调控外周神经损伤m阿片受体（MOR）表达致痛觉 过敏的作用,为临床治疗神经病理性疼痛（NP）提供实验理论依据。方法取48只8周龄雄性C57BL6J小鼠,按随机数字表法分 为4 组：DRG内分别注射无义阴性对照序列（siNC）、ZHX2 siRNA 的坐骨神经慢性缩窄性损伤模型（CCI 组）和siNC、ZHX2 siRNA的假手术组,每组12只。注射药物后7 d收集DRG组织,RT-qPCR和Western blot分别检测小鼠DRG ZHX2和MOR转 录和翻译的表达及机械痛阈（PWF）改变。取6只21 d龄SPF级健康成年雄性C57BL6J小鼠,提取上述小鼠DRG组织行原代细 胞培养,分为2组（每组3个重复）：转染siNC和ZHX2 siRNA组。转染后48 h,收集细胞分别检测ZHX2和MOR转录和翻译的 表达。结果与注射siNC 和siRNA 的假手术组比较,注射对照的siNC CCI 组DRG ZHX2 mRNA和蛋白质表达均增加,而 MOR mRNA和蛋白质表达均下调,差异均有统计学意义（P<0.05）。而与注射siNC的CCI组比较,注射siRNA的CCI组小鼠 DRG ZHX2 mRNA和蛋白质表达下调,同时增加MOR mRNA和蛋白质表达,差异均有统计学意义（P<0.05）。在痛行为上,与 注射siNC 的CCI组比较,注射siRNA的CCI组小鼠患侧PWF降低,差异有统计学意义（P<0.05）。与转染siNC 组比较,转染 ZHX2 siRNA组ZHX2的mRNA和蛋白质表达降低同时促进MOR转录和翻译表达增加,差异均有统计学意义（P< 0.05）。结 论敲减外周神经损伤引起的DRG ZHX2高表达,逆转MOR表达下调,从而缓解神经损伤引起的痛觉过敏行为。     

长链非编码RNA-MALAT1调控miR-22/snail轴对胃癌增殖、迁移及侵袭的影响

目的：探讨长链非编码RNA MALAT1（long non-coding RNA MALAT1,lnc RNA MALAT1）调控miR-22/snail轴对胃癌增殖、迁移及侵袭的影响。方法：采用siRNA干扰技术抑制MALAT1表达,同时过表达miR-22和Snail;采用RT-PCR检测MALAT1,miR-22和snail在胃癌细胞系中的表达水平（n=3）;采用Western blot检测NC组、si-MALAT1组中snail蛋白的表达水平（n=3）;采用CCK-8法在12、24、48、72 h检测NC组、si-MALAT1组、miR-22组、miR-22+snail组、si-MALAT1+miR-22组中细胞吸光度值（n=3）;采用划痕实验检测NC组、si-MALAT1组、miR-22组迁移速度（n=3）;采用Transwell检测NC组、si-MALAT1组、miR-22组、miR-22+snail组、si-MALAT1+miR-22组穿过膜细胞的个数（n=3）;采用双荧光素酶检测NC+pMIR-MALAT1-WT组、NC+pMIR-MALAT1-MUT组、miR-22+pMIR-MALAT1-WT组、miR-22+pMIR- MALAT1-MUT、NC+ pMIR-Snail-WT组、NC+pMIR-Snail-MUT组、miR-22+pMIR-Snail-WT组、miR-22+pMIR-Snail-MUT组的荧光活性（n=3）。两独立样本间的比较采用t检验,多组数据之间的比较采用单因素方差进行分析,涉及时间因素时采用重复测量方差分析。结果：MALAT1在胃癌细胞系中的表达水平明显高于正常胃黏膜上皮细胞（均P=0.000）;低表达MALAT1后,AGS和SGC-7901增殖能力（P1=0.001,P2=0.005）,迁移能力（P1=0.018,P2=0.007）,侵袭能力（P1=0.024,P2=0.015）均降低;同时双荧光素酶结果显示MALAT1能够靶向结合miR-22（P=0.001）,miR-22能够靶向结合snail（P=0.001）;miR-22在胃癌细胞中的表达水平明显低于正常胃黏膜上皮细胞（均P<0.05）;过表达miR-22后,AGS和SGC-7901增殖能力（P1=0.004,P2=0.009）,迁移能力（P1=0.034,P2=0.005）,侵袭能力（P1=0.037,P2=0.011）均降低;在低表达MALAT1和过表达miR-22后能够更进一步增加低表达MALAT1后对AGS和SGC-7901的增殖（P1=0.022,P2=0.006）和侵袭（P1=0.024,P2=0.015）的抑制作用;同时过表达miR-22和snail后能够反转miR-22对AGS和SGC-7901的增殖（P1=0.003,P2=0.004）和侵袭（P1=0.015,P2=0.01）的抑制作用。结论：MALAT1在胃癌细胞中明显高表达,并能通过调控miR-22/snail轴促进胃癌增殖、迁移及侵袭。     

小鼠miR-155基因启动子分析及转录活性鉴定

目的：鉴定小鼠miR-155基因启动子转录活性区域,预测转录因子结合位点,探讨miR-155在巨噬细胞极化中表达失调的转录调控机制。方法：分别构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。将miR-155表达载体与miR-155启动子荧光素酶报告载体瞬时共转染人胚肾上皮细胞293T,48 h后检测双荧光素酶活性。选取miR-155基因转录起始位点(TSS)上游2 000 nt作为启动子区,生物信息学预测该区域可能结合的转录因子,并在体外极化的M1型和M2型巨噬细胞中检测结合的相关转录因子的表达。结果：成功构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。双荧光素酶试验结果显示,小鼠miR-155基因TSS上游1～500 nt、1～1 000 nt及1～2 000 nt片段均存在转录激活作用,提示小鼠miR-155基因TSS上游1～2 000 nt均为miR-155基因的启动子区域,其中1～500 nt为启动子核心区域。转录因子的生物信息学预测结果显示,miR-155基因TSS上游1～2 000 nt...