姜黄素通过提高Rab家族蛋白的表达增强N2a/APP695swe细胞的自噬作用

目的:研究姜黄素(curcumin)对N2a/APP695swe细胞中自噬和Rab家族蛋白的影响,并且探讨姜黄素调节N2a/APP695swe细胞自噬的可能机制。方法:采用N2a/WT和N2a/APP695swe细胞,并将其分为4个组:N2a/WT组(WT组)、N2a/APP695swe组(APP组)、DMSO溶剂对照组(DMSO组,5μmol/L,24 h)、curcumin处理组(curcumin组,5μmol/L,24 h)。Western blot分别检测各组自噬标志性蛋白LC3BⅡ和底物蛋白SQSTM1的表达,以及Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7、Rab9、Rab24和Rab33B的表达;共聚焦显微镜观察免疫荧光进一步验证各组LC3BⅡ与SQSTM1蛋白的表达情况。结果:Western blot结果表示,curcumin组LC3BⅡ蛋白表达量明显高于APP组和DMSO组(0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,P=0.000);同时,curcumin组SQSTM1蛋白表达量则明显低于APP组(0.67±0.01...     

姜黄素通过增强Rab7的表达促进N2a/APP695swe细胞中的自噬流

目的:观察姜黄素(curcumin)对稳定表达APP695swe的Neuro-2a小鼠脑神经瘤细胞(N2a/APP695swe)中自噬流的作用;再进一步深入探讨其作用于N2a/APP695swe细胞中自噬流的可能机制.方法:首先将细胞分成4组:野生型对照组(WT组)、空白对照组(Control组)、溶剂对照组(Sham组)、姜黄素组(Curcumin组).透射电镜观察各组中自噬体形态特点,Western blot检测p62和LC3Ⅱ的表达;并分别运用Western blot及免疫荧光检测Rab7蛋白表达,实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测Rab7 mRNA表达.在N2a/APP695swe细胞中分别过表达及沉默Rab7后,将细胞分成5组:Control组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-Rab7组、NC-siRNA组和Rab7-siRNA组.再运用透射电镜观察各组自噬体形态特点,Western blot检测p62和LC3Ⅱ蛋白表达.结果:经姜黄素处理后,透射电镜观察到细胞中的自噬体主要为单层膜结构的自噬溶酶体,同时,自噬活性关键性蛋白LC3Ⅱ的表达增加(P=-0.000),而自噬底物蛋白p62的表达减少(P=0.000);Rab7在蛋白水平及mRNA水平均明显升高(P=0.000、0.000).过表达Rab7后,自噬体主要为单层膜结构的自噬溶酶体,p62蛋白表达明显减少(P=0.000),LC3Ⅱ蛋白表达无明显变化(P=0.669).沉默Rab7后,自噬体主要为双层膜结构的早期自噬体形态,p62蛋白表达明显增加(P=0.000),LC3Ⅱ蛋白表达无明显变化(P=0.622).结论:姜黄素促进N2a/APP695swe细胞中的自噬流,其作用机制可能与增强Rab7表达有关.     

姜黄素影响N2a/APP695swe细胞中ABCA1表达的机制研究

目的：研究姜黄素（Curcumin）对N2a/APP695swe细胞钙调神经磷酸酶（Calcineurin,CaN）活性和三磷酸腺苷结合转运子A1（ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）表达的影响;探讨Curcumin影响N2a/APP695swe细胞中ABCA1表达的可能机制。方法：MTT法分别检测1、5、10、20、40 μmol/L Curcumin或0.1、0.5、1、2、4 μmol/L CaN活性抑制剂环孢素A（Cyclospo－rinA,CsA）对N2a/APP695swe细胞存活率的影响;依据MTT筛选结果,分为正常对照组、模型组、Curcumin组：5 μmol/L Cur－cumin处理24 h的N2a/APP695swe细胞、CsA组：0.5 μmol/L CsA处理48 h的N2a/APP695swe细胞。酶底物显色法检测CaN活性,real-time PCR、Western blot检测ABCA1表达水平的变化。结果：与未处理组比较,5 μmol/L Curcumin组细胞存活率[（110.495±4.005）%]最高（P=0.023）;0.1、0.5、1、2、4 μmol/L CsA组细胞存活率依次为（105.532±4.292）%、（115.211±4.826）%、（76.317±4.475）%、（69.177±5.267）%、（54.687±3.912）%,与未处理组比较,0.5、1、2、4 μmol/L CsA组差异均有统计学意义（P值依次为0.001、0.000、0.000、0.000）;酶底物显色法显示与正常对照组[（18.519±1.664） nmol/mg]比较,模型组CaN活性[（24.488±3.041） nmol/mg]增加（P=0.007）,Curcumin组[（16.717±2.055） nmol/mg]、CsA组[（4.928±1.232）nmol/mg] CaN活性明显受到抑制（P值依次为0.002、0.000）;real-time PCR和Western blot显示Curcumin组ABCA1表达量（real-time PCR：1.988±0.355;West－ern blot：0.294±0.015）高于模型组（real-time PCR：1.000±0.000;Western blot：0.175±0.008）,差异有统计学意义（real-time PCR：P=0.009;Western blot：P=0.000）;与模型组比较,CsA组（real-time PCR：4.000±0.464;Western blot：0.470±0.016）的ABCA1表达水平增加（real-time PCR：P=0.000;Western blot：P=0.000）。结论：Curcumin能上调N2a/APP695swe细胞中ABCA1的表达,其机理可能与抑制CaN活性有关。     

姜黄素激活线粒体凋亡通路诱导肝癌细胞Huh7凋亡

目的 观察姜黄素对肝癌细胞Huh7中Bcl-2家族成员表达,cytochrome c胞内定位以及caspase-3活化的影响,探讨姜黄素诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。方法 Western blotting分析姜黄素处理Huh7细胞后Bcl-2,Bcl-xL,Bad,Bid,Beclin,Bag-1和caspase-3蛋白表达的变化;间接免疫荧光技术观察在姜黄素干预后Bad和cytochrome c蛋白的定位及变化。结果 25 μmol•L-1的姜黄素明显上调Huh7细胞中Bad的表达水平,但是对Bcl-2,Bcl-xL,Bid,Beclin和Bag-1的表达并无显著影响。同时,姜黄素能够促使cytochrome c从线粒体释放至胞浆中,以及诱导caspase-3的活化。结论 姜黄素通过激活线粒体凋亡通路诱导肝癌细胞Huh7凋亡。     

姜黄素加重结肠癌细胞株HCT-116线粒体损伤和促进细胞凋亡的作用研究

目的 观察姜黄素对结肠癌细胞株HCT-116细胞增殖和凋亡的影响以及对细胞线粒体形态和功能的改变,并探讨其可能的机制。方法 体外培养结肠癌细胞株HCT-116,给与不同浓度的姜黄素（5、10、20、30 μmol/L）处理,细胞计数试剂盒CCK-8观察细胞增殖的变化并筛选出最佳作用浓度。流式细胞术检测细胞凋亡的改变。线粒体膜电位检测试剂盒JC-1检测细胞内线粒体膜电位的变化。电镜和Mito Tracker Deep Red染色观察细胞内线粒体形态结构的变化。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）和活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒检测细胞ATP和ROS的变化。分光光度计检测与凋亡密切相关的casppase-3和caspase-9活性变化。最后,Western blot检测结肠癌细胞内caspase-3和caspase-9蛋白水平的变化。结果 姜黄素处理细胞株HCT-116细胞后,细胞的增殖水平受到抑制,且呈浓度-时间依赖性,其半数最大抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC₅₀）为13 μmol/L。姜黄素不仅增加早期凋亡的结肠癌细胞的比例,还使细胞内线粒体膜电位水平下降,且呈浓度依赖性。电镜结果显示姜黄素处理后,细胞内线粒体出现明显的线粒体肿胀,线粒体嵴肿胀、消失、膜破裂和空泡等。Mito Tracker Deep Red染色后显示线粒体数量减少且呈碎片状。细胞内的ATP生产明显下降。另外,姜黄素还增加细胞内caspase-3和caspase-9酶活性和蛋白水平的表达。结论 姜黄素抑制结肠癌HCT-116细胞的增殖,并促进细胞的凋亡,其机制与姜黄素加重线粒体形态和功能的损伤有关。     

姜黄素氧化损伤线粒体诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的 探讨姜黄素诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的机制.方法 80 μmol/L姜黄素作用于肝癌细胞后,用流式细胞仪检测细胞过氧化氢(H2O2)、线粒体膜电位和细胞亚二倍体凋亡峰情况;比较姜黄素组和预处理组(姜黄素联合过氧化氢酶)线粒体膜电位和细胞亚二倍体凋亡峰变化情况.结果 80 μmol/L姜黄素作用于肝癌细胞1、2、3 h后检测H2O2分别为(13.49±3.23)%、(52.43±6.04)%、(48.21±7.18)%,以2 h时间点最高.细胞线粒体膜电位在6、12 h分别为(59.68±4.47)%、(29.83±6.22)%,差异有统计学意义(P＜0.01).细胞亚二倍体凋亡峰     

LXR激动剂TO901317抑制N2a/APP695swe细胞内Aβ生成的机制研究

目的 观察肝脏X受体(LXR)激动剂TO901317对N2a/APP695swe细胞内β-淀粉样蛋白42(Aβ42)生成的影响,并探索其潜在机制。方法 体外培养N2a/APP695swe细胞,并用不同浓度的TO901317(5、10和20μmol/L)作用于细胞,采用ELISA检测细胞上清液中生成的Aβ42水平变化;实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot分别检测N2a/APP695swe细胞内淀粉样前体蛋白(APP)、β-分泌酶(BACE1)和小凹蛋白-1(caveolin-1)mRNA和蛋白水平的表达。结果 ELSIA结果显示,TO901317明显降低了细胞上清液中生成的Aβ42水平(P<0.01),且呈浓度依赖性。RT-PCR和Western blot结果显示,TO901317明显抑制了APP和BACE1 mRNA及蛋白水平表达(P<0.01),促进了caveolin-1 mRNA和蛋白水平表达(P<0.01)。结论 TO901317能明显抑制N2a/APP695swe细胞内Aβ42的生成,其机制可能与TO901317促进caveolin-1...     

姜黄素调控脂多糖诱导成骨细胞线粒体功能改变及凋亡研究

目的：研究脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和姜黄素（curcumin,Cur）对成骨细胞线粒体功能活性改变及凋亡的影响。方法：体外培养小鼠原代成骨细胞,并将细胞分为4组：无任何处理的对照组（N组）;10 μmol/L姜黄素预处理2 h,使用正常培养基培养24 h组（Cur组）;用1 mg/L LPS处理24 h组（LPS组）;用10 μmol/L姜黄素预处理2 h,然后再用1 mg/L LPS处理成骨细胞24 h组（Cur +LPS组）。利用线粒体荧光探针测量线粒体活性氧的产生,检测线粒体氧化呼吸链酶活性、线粒体膜电位、细胞内ATP的合成及细胞凋亡情况。结果：在经过1 mg/L LPS刺激后,小鼠成骨细胞线粒体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成为对照组的2.59倍;与对照组相比,LPS组氧化呼吸链酶Ⅰ活性降低21%,氧化呼吸链酶Ⅲ活性降低26%,氧化呼吸链酶Ⅳ活性降低28%;线粒体细胞膜电位降低32%,ATP合成量为（0.79±0.06） μmol/mg蛋白,细胞凋亡数目增加3.2倍;而Cur+LPS组较LPS组相比,小鼠成骨细胞内ROS水平降低（1.48±0.21 vs. 2.59±0.32,P=0.003）,氧化呼吸链酶Ⅰ活性升高（0.98±0.02 vs. 0.79±0.03,P=0.000）,氧化呼吸链酶Ⅲ活性升高（0.93±0.03 vs. 0.74±0.03,P=0.004）,氧化呼吸链酶Ⅳ活性升高（0.92±0.05 vs. 0.72±0.02,P=0.009）,线粒体膜电位增加（0.91±0.04 vs. 0.68±0.04,P=0.002）,ATP合成量增加（1.53±0.05 vs. 0.79±0.06,P=0.000）,细胞凋亡数目减少（1.67±0.42 vs. 5.33±0.80,P=0.002）。结论：姜黄素预处理组的成骨细胞线粒体功能得以明显改善,并且细胞凋亡数目明显减少,为姜黄素可能被进一步应用于临床治疗慢性牙周炎提供一定的实验依据。     

白藜芦醇改善多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢颗粒细胞线粒体功能和抑制凋亡的作用

目的：观察白藜芦醇对多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）模型大鼠卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响以及线粒体的形态和功能的改变,并探讨其可能的保护机制。方法：32只雌性SD大鼠幼鼠随机分为2组,PCOS模型组（n=24）和模型对照组（n=8）。成功提取PCOS组颗粒细胞并体外培养,然后用不同浓度的白藜芦醇处理颗粒细胞,CCK-8法检测细胞活力的变化;Mito Tracker Deep Red染色观察细胞线粒体的形态变化;JC-1检测线粒体膜电位的变化;ATP检测试剂盒检测ATP的变化;分光光度计检测与凋亡密切相关casppase-3和caspase-9酶活性变化;最后,蛋白免疫印迹法检测颗粒细胞内caspase-3和caspase-9蛋白水平的变化。结果：白藜芦醇处理PCOS模型大鼠卵巢颗粒细胞后,颗粒细胞的增殖活性明显增强（P=0.000）;Mito Tracker Deep Read染色结果显示线粒体质量明显增加,形状呈管状或长条状;颗粒细胞内ATP产量和线粒体膜电位也明显增加（P=0.000、P=0.000）。另外,白藜芦醇也降低了caspas...     

姜黄素抑制β淀粉样蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡的实验研究

目的探讨姜黄索对β淀粉样蛋白(Aβ)25～35诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法采用不同浓度的Aβ25～35处理分化后的PC12细胞,同时应用姜黄素进行干预,采用四甲基偶氮唑盐法检测细胞活力及代谢状态,采用磷脂酰丝氨酸外翻法检测细胞凋亡,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果Aβ25～35处理24h后,PC12细胞活力显著下降,且呈剂量依赖性。姜黄素(5～20μmol/L)对Aβ25～35诱导的细胞凋亡具有明显的抑制作用。与仅以20μmol/L Aβ25～35处理相比,5μmol/L姜黄素 20μmol/L Aβ25～35处理后的细胞凋亡百分比明显降低(P<0.01)。结论Aβ25～35能够诱导PC12细胞凋亡,姜黄素对其诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用。     

London/Swedish双突变APP转基因小鼠的鉴定

鉴定及评价APP双突变阿尔茨海默病的转基因小鼠模型。方法将London/Swedish双突变APP基因插入到PDGF启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立APP695^V652I/K596N/M597L双突变转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定APP695双突变转基因小鼠的基因表型,RT-PCR和Western blotting检测APP突变基因表达,免疫组化检测APP695双突变转基因小鼠大脑病理改变。水迷宫检测APP695^V652I/K596N/M597L转基因小鼠的行为学改变。结果建立了2个品系的人APP695^V652I/K596N/M597L转基因小鼠。抗Aβ1-17免疫组织化学显示APP695双突变转基因小鼠海马区阳性细胞数较APP695^V652I单突变转基因小鼠,及野生小鼠阳性细胞数明显增多,胞膜着色明显加深。双突变转基因小鼠在5月龄时可检测到老年斑。行为学检测显示APP695^V652I/K596N/M597L双突变转基因小鼠学习记忆能力比APP695^V652I单突变转基因小鼠有明显下降。结论APP695^V652I/K596N/M597L转基因小鼠较APP695^V652I转基因小鼠更早出现老年斑及学习认知能力障碍。成功建立了人APP695^V652I/K596N/M597L转基因小鼠阿尔茨海默病模型,为研究阿尔茨海默病发病机制和药物研发提供了有价值的动物模型。     

APP695-siRNA慢病毒载体构建及其对SH-SY5Y细胞中APP695基因的沉默作用

目的：构建针对APP6995的siRNA慢病毒载体,并检测其对人神经纤维母细胞瘤SH-SY5Y细胞株中APP695基因表达的沉默作用。方法：设计并合成针对筛选确定的APP695基因寡核苷酸序列特异性siRNA有效靶序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列,将以上寡核苷酸序列退火后连人pFU-GW-jRNA质粒,酶切和测序...     

三羟基异黄酮对转染APP695基因PC12细胞周期和凋亡的影响

目的 以APP695MT基因转染PC12细胞为细胞模型,研究三羟基异黄酮(Genistein,GST)对模型细胞周期和凋亡的影响.方法 用pIRES2-EGFP空载体和pIRES2-EGFP/APP695 MT表达载体转染正常的PC12细胞,将细胞分为空载对照组、APP695转染组、GST干预组.应用流式细胞仪测定检测细胞周期和细胞凋亡率,激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡形态学变化.结果 APP695转染组与空载对照组比较,PC12细胞在G0和G1期明显增多,而进入S期的细胞减少,细胞增殖指数明显降低[(55.6±0.57)％,P＜0.01],细胞凋亡率明显升高[(77.10±12.53)％,P＜0.01];细胞死亡发出的红色荧光明显增多,胞体肿胀,细胞器崩解,细胞核固缩或碎裂.GST( 15 μmol/L)干预组与APP695转染组比较,PC12细胞在Go和G1期明显减少,而进入S期的细胞增多,细胞增殖指数明显增加[ (61.57±0.47)％,P＜0.01],细胞凋亡率降低[(46.00±8.43)％,P＜0.01];细胞死亡发出的红色荧光明显减少,绿色荧光显著增强,细胞形态较APP695转染组好转.结论 GST能改善APP695MT基因转染引起的细胞周期阻滞,促进细胞向S期的过渡,降低PC12细胞凋亡率,对转染细胞有一定的保护作用.     

辛伐他汀抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡及改善心功能的实验研究

目的:观察辛伐他汀对心肌梗死后心肌细胞凋亡及心功能的影响.方法:结扎大鼠左冠状动脉前降支造成心肌梗死模型,实验组给予药物处理(辛伐他汀40 mg/kg),7天后,TUNEL法检测心肌组织中的凋亡心肌细胞,超声检测左心室功能参数,生化法检测血脂水平.结果:辛伐他汀组较心肌梗死组在梗死区、梗死周边区、远离梗死区凋亡心肌细胞显著减少(P＜0.05),左心室功能改善(P＜0.05),血脂水平没有显著性差异(P＞0.05).结论:辛伐他汀抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡,改善心功能.     

Effects of suppressed autophagy on mitochondrial dynamics and cell cycle of N2a cells

Autophagy dysregulation, mitochondrial dynamic abnormality and cell cycle re-entry are implicated in the vulnerable neurons of patients with Alzheimer＇s disease. This study was designed to testify the association among autophagy, mitochondrial dynamics and cell cycle in dividing neuroblas- toma （N2a） cells. The N2a cells were cultured in vitro and treated with different concentrations of 3-methyladenine （3-MA）. The cell viability was detected by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay. They were randomly divided into control group （cells cultured in normal culture medium） and 3-MA group （cells treated with 10 mmol/L 3-MA）. The cell cycle was analyzed in the two groups 3, 6, 12, and 24 h after treatment by flow cytometry. Western blotting was used to evaluate the expression levels of mitofission 1 （Fisl）, mitofusin 2 （Mfn2）, microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）, cell cy- cle-dependent kinase 4 （CDK4） and cdc2. The flow cytometry revealed that the proportion of cells in G2/IVI was significantly increased, and that in G0/G1 was significantly reduced in the 3-MA group as compared with the control group. Western blotting showed that the expression levels of Fisl, LC3, and CDK4 were significantly up-regulated in the 3-MA group at the four indicated time points as compared with the control group. Mfn2 was initially decreased in the 3-MA group, and then significantly in- creased at 6 h or 12 h. Cdc2 was significantly increased in the 3-MA group at 3 h and 6 h, and then dropped significantly at 12 h and 24 h. Our data indicated that 3-MA-induced suppressed autophagy may interfere with the cell cycle progression and mitochondrial dynamics, and cause cell death. There are interactions among cell cycle, mitochondrial dynamics and autophagy in neurons.     

姜黄素对过氧化氢诱导内皮细胞凋亡及衰老的影响

目的 探讨姜黄素对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬、凋亡及衰老的影响.方法 体外培养HUVECs,分为对照组(只给予培养基),模型组(给予60 μmol/L H2O2),姜黄素组(给予60μmol/L H2O2+ 10 μmol/L姜黄素),3-MA组[(给予60 μmol/L H2O2+ 10μmol/L姜黄素+1 mmol/L3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine)],培养4d后,DCFH-DA法检测细胞培养液中活性氧(ROS)的含量,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测细胞衰老程度,Western blot技术检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达水平.结果 与对照组相比,模型组ROS含量、凋亡率、SA-β-gal阳性率及p62水平升高(均P＜0.05),而LC3-Ⅱ/Ⅰ比值差异无统计学意义(P＞0.05).与模型组比,姜黄素组ROS含量、凋亡率及SA-β-gal阳性率及p62水平降低(均P＜0.05),但LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高(P＜0.05).与姜黄素组比较,3-MA组ROS含量、凋亡率、SA-β-gal阳性率及p62水平升高(均P＜0.05),但LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低(P＜0.05).结论 姜黄素可减轻H2O2诱导内皮细胞凋亡及衰老,其机制与提高内皮细胞自噬有关.     

APP695K595N/M596L突变转基因小鼠的建立和病理表型动态分析

目的建立APP695K595N/M596L(Swedish突变)转基因小鼠和评价痴呆表型的发生和发展过程。方法将APP695K595N/M596L突变基因插入到小鼠朊蛋白(mouse prion protein)启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立APP695K595N/M596L突变转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因表型,Western blotting检测APP突变基因表达。Thioflavin-S染色检测不同年龄转基因小鼠大脑病理改变。Morris水迷宫动态观察小鼠行为学改变。结果建立了人APP695K595N/M596L转基因小鼠,Thioflavin-S染色显示转基因小鼠9月龄时在脑海马区可检测到老年斑形成,并且在11、12月龄时明显增多。Morris水迷宫结果发现与同月龄野生型小鼠相比,该转基因小鼠5月龄开始出现学习记忆能力缺陷,7、9、11月行为学结果证实转基因小鼠的学习记忆能力缺陷随年龄增加而日趋严重(P<0.05)。结论建立了人APP695K595N/M596L转基因小鼠,并能再现人类阿尔茨海默症的行为学及神经病理学特征,为阿尔茨海默病发病机制研究和药物研发提供了有价值的动物模型。