FOXP3基因3＇-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

目的：构建FOXP3基因3＇-UTR双荧光素酶基因报告载体,并通过检测荧光素酶活性,初步分析可能调控FOXP3基因表达的miRNAs.方法：利用PCR方法,根据FOXP3基因3＇-UTR序列信息设计其扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板PCR扩增FOXP3基因的3’-UTR序列,将其克隆到pmiRB-REPORT双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与FOXP3基因3’-UTR相互作用的miRNAs;利用LipofectaminTM 2000试剂将miRNAs mimics与构建好的FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶报告载体共转染于常规培养的293T细胞中,然后使用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,并与空白对照相比较.结果：经酶切及基因测序验证,成功构建含有FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体;Targetscan软件预测显示,FOXP3基因3’-UTR可能是miR 608的作用靶位点;双荧光报告显示,miR 608 mimics组比空白对照组[（0.700 0±0.016 41）比（1.000±0.055 75） （P＜0.001）] FOXP3基因3’-UTR双荧光素酶基因报告载体的荧光素酶活性下降30％.结论：FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体构建成功,初步证实miR 608对FOXP3有调控作用.     

HIF-1α和HIF-2α在人肾透明细胞癌中的表达及意义

目的探讨低氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α在人肾透明细胞癌组织中的表达及其临床意义。方法应用RT-PCR的方法从转录水平检测了56例原发性散发肾细胞癌和52例正常肾组织中HIF-1αmRNA及HIF-2αmRNA的表达情况,应用Western-Blot方法从蛋白质水平检测了HIF-1α和HIF-2α的表达情况。结果HIF-1αmRNA在肾透明细胞癌标本组织中的表达率为87.5%,较对照组织中增高,差异有统计学意义(P<0.05);HIF-2αmRNA在肾透明细胞癌标本组织中的表达率为94.6%,较对照组织中增高,差异有统计学意义(P<0.05)。56例CCRCC组织标本中52例表达HIF-1α蛋白,阳性率为92.9%,较对照组织中增高,差异有统计学意义(P<0.05)。56例CCRCC组织标本中54例表达HIF-2α蛋白,阳性率为96.4%,较对照组织中增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α和HIF-2α的表达可能对肾透明细胞癌的发生和发展有重要作用。     

神经干细胞移植对脑缺血/再灌注损伤大鼠HIF-1α和HIF-3α表达的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脑缺血/再灌注损伤海马区低氧诱导因子1α(HIF-1α)和低氧诱导因子3α(HIF-3α)表达的影响。方法线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型,大鼠随机分为假手术组、模型组、NSCs组。再灌注72 h后神经功能损害评分表(NSS)法行神经功能评分,免疫组化法检测海马区HIF-1α和HIF-3α蛋白表达。结果 NSCs移植后可见PKH26标记的NSCs在海马区有表达。与模型组比较,NSCs组NSS评分显著降低(P<0.05),海马区HIF-1α和HIF-3α蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论神经干细胞移植可上调脑缺血/再灌注损伤大鼠海马区HIF-1α和HIF-3α表达,促进脑缺血损伤神经功能恢复。     

脂肪源性干细胞移植对脑缺血再灌注损伤大鼠HIF-1α和HIF-3α表达的影响

目的探讨脂肪源性干细胞(ADSCs)移植对大鼠脑缺血再灌注损伤海马区乏氧诱导因子HIF-1α和HIF-3α表达的影响。方法线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)2 h再灌注模型,18只大鼠随机分为假手术组(n=6)、模型组(n=6)、ADSCs组(n=6)。ADSCs组经尾静脉注射PKH-26标记的ADSCs细胞悬液(0.5 ml,细胞密度为4×106个/ml)。缺血3 h再灌注72 h后行NSS法行神经功能评分,Western blot和实时荧光定量PCR检测海马区HIF-1α和HIF-3α蛋白和mRNA表达。结果 ADSCs移植后可见PKH26标记的ADSCs在海马区有表达。与模型组比较,ADSCs组神经功能损害评分显著降低(P<0.05),海马区HIF-1α和HIF-3α蛋白和mRNA表达显著上调(P<0.05)。结论脂肪源性干细胞移植可上调脑缺血再灌注损伤大鼠海马区HIF-1α和HIF-3α表达,促进脑缺血损伤神经功能恢复。     

改造IFNα—2b基因3′端提高其在大肠杆菌中表达水平

目的：对人ＩＦＮα－２ｂ基因的５′端进行改造,从翻译水平上调控ＩＦＮα－２ｂ基因在大肠杆菌中的表达。方法：采用ＰＣＲ方法,人工合成寡核苷酸引物,对人ＩＦＮα－２ｂ基因进行了改造：去除３′端非编码区,并增加原核系统强终止密码子。将改造后的基因片段分别克隆入原核表达载体ｐＢＶＦ３２１,在大肠杆菌中进行表达。对表达产物进行活性效价测定。结果：３′端删除非编码区,表达水平比删除前提高４倍。结论：ＩＦＮα－     

哮喘大鼠HIF-1α、转化生长因子-β的表达及调控

目的 探讨HIF-1α、TGF-β1在哮喘急性发作期中的作用及两者间的相关性.方法 选取健康清洁级雄性SD大鼠48只,随机均分为4组：正常对照组、哮喘组、地塞米松治疗组（地塞米松组）、布地奈德治疗组（布地奈德组）.制备大鼠哮喘模型,观察各组大鼠肺组织病理变化、分析支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞总数和分类计数,并采用免疫组织化学法和原位杂交法测定各组大鼠肺组织中HIF-1α、TGF-β1的表达情况,并作相关性分析.结果 正常对照组大鼠气道及肺实质无异常改变,细胞结构完整;哮喘组大鼠气道腔内有大量炎症细胞及分泌物充塞,形成黏液栓,气道上皮细胞损伤、脱落、基底膜增厚且形态不规则、平滑肌肥大增生;布地奈德组和地塞米松组大鼠气道腔内无明显分泌物,其它症状亦较哮喘组明显减轻.哮喘组细胞总数及EOS、PMN、Lym计数比例均显著高于正常对照组（P〈0.01）,Mφ计数比例显著低于正常对照组（P〈0.01）;布地奈德组和地塞米松组细胞总数及EOS、Lym计数比例均显著低于哮喘组（P〈0.01）,Mφ计数比例显著高于哮喘组（P〈0.01）.哮喘组大鼠肺组织HIF-1α及TGF-β1的表达均显著高于正常对照组（P〈0.01）,地塞米松组和布地奈德组HIF-1α的表达均明显高于正常对照组（P〈0.05）,布地奈德组和地塞米松组大鼠肺组织HIF-1α及TGF-β1的表达均显著低于哮喘组（P〈0.01）.哮喘大鼠肺组织中HIF-1α与TGF-β1的表达呈显著正相关（P〈0.01）.结论 哮喘急性发作期HIF-1α及TGF-β1的表达显著增加,两者间呈现显著正相关;糖皮质激素干预可以降低HIF-1α及TGF-β1的表达,减轻哮喘气道炎症.     

HIF-1α在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:研究低氧诱导因子-1 α(Hypoxia-inducible factor-1 α,HIF-1 α)在胃癌组织中的表达及临床意义.方法:收集60例胃癌标本(胃癌组)为研究对象,另设20例胃溃疡(胃溃疡组)和20例正常胃黏膜组织(正常组)标本作对照.采用免疫组织化学染色S-P法检测60例胃癌、20例胃溃疡及20例正常胃黏膜组织标本中HIF-1 α蛋白的表达情况.结果:胃癌组中HIF-1 α的阳性表达率为66.7%(40/60),而胃溃疡组和正常组不表达,差异有显著性(P＜0.01).Ⅰ Ⅱ期胃癌的表达率为45.0%(9/20),Ⅲ Ⅳ期的表达率为77.5%(31/40),二者差异有显著性(P＜0.05).HIF-1 α与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、远处转移存在正相关,而与肿瘤的病理类型分化程度、大小无显著相关性.结论:胃癌组织中HIF-1 α呈高表达,且表达率与临床病理分期相关.     

SOCS3基因3’端非翻译区荧光素酶报告载体的构建及活性鉴定

目的:研究细胞因子信号抑制蛋白-3(suppressors of cytokine signaling-3,SOCS3)基因3’端非翻译区(3’-un-translated region,3’-UTR)微小RNA(microRNA,miRNA)的调控作用,构建重组SOCS3基因3’-UTR荧光素酶报告载体,并通过荧光素酶活性测定,初步分析可能调控SOCS3基因表达的miRNAs。方法:采用PCR方法从原代培养的小鼠星形胶质细胞基因组DNA中扩增SOCS3基因3’-UTR序列,插入荧光素酶报告载体pGL3-Promoter,获得重组载体pGL3-Promoter/SOCS3;通过Target Scan5.2、RNAhybrid和FINDTAR3软件预测可能与SOCS3基因3’-UTR结合的miR-NAs;将pGL3-Promoter/SOCS3重组质粒和miRNAs共转染HEK 293T细胞,测定SOCS3 3’-UTR荧光素酶的活性。结果:酶切及核酸测序证实,成功构建了SOCS3基因3’-UTR序列的荧光素酶报告重组子;miRNA靶位点预测显示,SOCS3基因可能是miR-203、miR-291a-5p、miR-9、miR-140和miR-130b的作用靶标;与对照组相比,miR-203、miR-291a-5p、miR-140能使SOCS3 3’-UTR荧光素酶的活性显著降低。结论:成功构建了SOCS3基因3’-UTR荧光素酶报告载体,且miR-203、miR-291a-5p、miR-140可显著降低其荧光素酶的活性。     

老龄大鼠脑组织不同部位HIF-1α的表达规律探讨

目的 观察低氧诱导因子-1a(HIF-1a)在老龄大鼠脑组织不同部位的表达规律,探讨FIF-1a在神经系统衰老过程中的作用.方法 应用尼氏染色和免疫组化技术对比观察3月龄和30月龄大鼠脑组织不同部位神经细胞内尼氏体及HIF-1a的表达情况.结果 30月龄大鼠脑组织各部位神经细胞体积大,排列稀疏,胞浆内尼氏体稀疏.与3月龄组比较,30月龄组大鼠脑组织内各部位阳性表达细胞数目明显增多(P<0.01),且各部位阳性细胞个数有显著变化(P<0.01),其中海马CA3区阳性细胞数最多,而运动皮质区及第1小脑小叶阳性细胞数相对较少.结论 老龄大鼠脑组织各部位神经细胞蛋白质合成功能减弱,而HIE-1a表达增强,其中又以海马区表达最强,推测HIF-1a可能在衰老过程中尤其是记忆减退方面发挥重要作用.     

子宫颈癌中VHL基因和HIF-1α表达及意义

目的探讨VHL基因和HIF-1α在子宫颈癌组织中的表达及其与子宫颈癌临床病理因素的关系。方法用免疫组织化学SP法检测130例子宫颈癌和20例子宫颈正常组织中VHL、HIF-1α表达情况,并统计分析子宫颈癌分化程度、临床分期、转移及预后的相关性。结果 VHL基因在130例子宫颈癌组织中的阳性表达率为43.1%,在20例子宫颈正常黏膜中的阳性表达率为95%(P<0.001);HIF-1α蛋白在130例子宫颈癌组织中的阳性表达率为71.5%,在20例子宫颈正常黏膜中的阳性表达率为25%(P<0.001);VHL基因的阴性表达与HIF-1α蛋白的阳性表达与子宫颈癌分化程度、分期、淋巴结转移及预后有关(P<0.05)。结论 VHL基因表达下调和HIF-1α蛋白表达上调在子宫颈癌的侵袭、转移中发挥重要作用。     

HIF-1α在原发性肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨低氧诱导因子-1α（HIF-1α）在原发性肝细胞癌中的表达,以及HIF-1α与血管内皮生长因子（VEGF）和微血管密度（MVD）表达的相关性。方法采用免疫组化法检测HIF-1α、VEGF和MVD在原发性肝细胞癌、肝硬化及肝正常组织中表达情况。结果HIF-1α在肝细胞癌、肝正常组织和肝硬化组织中的表达差异有显著性（P〈0.05）,HIF-1α与VEGF和MVD在肝癌中的表达有相关性。结论HIF-1α在肝细胞癌中高表达在肝癌肿瘤血管生成中有重要作用。     

miR-1290与RASAL2基因靶向关系的探索

目的 通过构建RASAL2 3'-非翻译区(3'-UTR) 双荧光素酶报告载体,探索RASAL2 与非编码核糖核酸(ncRNA)miR-1290 的靶向调控情况.方法 借助在线数据库Targetscan 预测miR-1290与RASAL2 结合位点;利用聚合酶链反应( PCR) 技术扩增RASAL2 基因3'-UTR ...     

miR-1290与RASAL2基因靶向关系的探索

目的通过构建RASAL2 3′-非翻译区(3′-UTR)双荧光素酶报告载体,探索RASAL2与非编码核糖核酸(ncRNA)miR-1290的靶向调控情况。方法借助在线数据库Targetscan预测miR-1290与RASAL2结合位点;利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增RASAL2基因3′-UTR序列,并以GV272为载体将其连接,分别构建野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR和突变型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR荧光素酶报告基因重组质粒;并将miR-1290及相应阴性对照分别与这两种重组质粒共转染到293T细胞中,通过检测各组荧光素酶活性,探索miR-1290与RASAL2基因的结合情况。结果酶切和测序数据表明:野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR及突变型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR双荧光素酶报告载体构建成功;相较于miR-1290与突变型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR共转染组,miR-1290与野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR共转染组的荧光素酶活性无明显变化(P＞0.05)。结论成功构建了RASAL2 3′-UTR的双荧光素酶报告基因载体,但miR-1290不能与RASAL2结合,不能抑制其表达。     

重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建和鉴定

目的构建重组人HIF-1α真核表达载体质粒,为进行治疗性血管再生研究做准备。方法从Hela细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计两对引物分别调取目的基因片段A和B,与T载体连接后转化大肠杆菌JM109,LB平板培养基筛选菌落,抽提质粒。测序正确后双酶切先后克隆进入pcDNA4/HisMaxA载体。结果获得重组的人HIF-1α真核表达载体质粒,经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同,插入pcDNA4/HisMaxA载体部位正确。结论重组的人HIF-1α,所选用的pcDNA4/HisMax可高表达目的基因,为利用其进行治疗性血管再生研究奠定了基础。     

不同月龄大鼠海马组织中HIF-1α表达规律的探讨

目的 揭示低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在不同月龄大鼠海马组织中的表达规律,探讨HIF-1a在神经系统衰老过程中的作用.方法 应用尼氏染色和免疫组化技术观祭不同月龄组(3,18、24、30月)大鼠海马组织中不同区域神经细胞尼氏体及HIF-1α的表达情况.结果 ①随大鼠月龄的增大,海马组织中各区域神经细胞体积变大,排列稀疏,胞浆内尼氏体减少.②海马Cal、CA3区,随月龄增加,HIF-1a阳性细胞数增加,差异有统计学意义(P<0.05),其中由3月龄到18月龄、18月龄到30月龄增加更明显(P<0.01).结论 随着月龄的增大,大鼠海马组织中神经细胞蛋白质合成功能减弱,而HIF-1α的表达逐渐增强,推测HIF-1a可能在衰老过程中起一定的作用.     

大肠癌中VHL mRNA,FIH-1 mRNA的表达对HIF-1α蛋白水平的影响

目的:检测大肠癌中VHL mRNA,FIH-1 mRNA以及HIF-1α蛋白的表达,探讨VHL,FIH-1对HIF-1α蛋白水平的影响. 方法:采用RT-PCR技术检测42例大肠癌组织和相应的癌旁正常粘膜组织中VHL mRNA,FIH-1 mRNA的表达,采用免疫组化SP法检测HIF-1α蛋白在大肠癌和癌旁正常组织中的表达,Spearman相关关系检验分析其之间的相关性. 结果:大肠癌组织VHL mRNA和FIH-1 mRNA的表达水平显著低于癌旁正常组织(t=-10.14,P=0.00;t=-15.26,P=0.00);二者的表达水平随Dukes分期而降低,DukesA B期显著高于DukesC D期(t=2.84,P=0.01;t=-5.13,P=0.00);它们的表达水平与与肿瘤部位、性别无关. 大肠癌组织HIF-1α蛋白表达阳性率为69.1%(29/42),在癌旁正常组织中均为阴性;DukesC D期(80.0%,24/30)显著高于Dukes A B期(41.7%,5/12),(t=5.89, P=0.02); Spearman相关分析显示,HIF-1α表达水平与VHL mRNA,FIH-1 mRNA的表达水平显著负相关(rs=-0.97,P=0.01,rs=-0.66,P=0.01). 结论:HIF-1α的过表达在大肠癌的发生发展、浸润转移过程中起着重要作用,大肠癌组织中VHL以及FIH-1的水平下降与HIF-1α蛋白水平的升高之间存在密切相关.     

MALAT1调控 miR-19b-3p/HIF-1α分子轴参与非小细胞肺癌的发生发展

摘要:目的 探讨 MALAT1调控 miR-19b-3p/HIF-1α影响非小细胞肺癌(NSCLC)的发病机制。方法 采用实时 荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测 MALAT1、miR-19b-3p在 NSCLC 肺癌组织和 NSCLC 细胞系中的表达水平。过表达 miR-19b-3p和敲除 MALAT1后,采用qRT-PCR和 Westernblot检测 A549细胞中 MALAT1、miR-19b-3p、缺氧诱导因 子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化。采用细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)和流式细胞术检 测细胞增殖、细 胞 周 期 和 凋 亡 情 况。采 用 Transwell实 验 检 测 细 胞 迁 移 及 侵 袭 能 力。结 果 在 NSCLC 癌 组 织 及 NSCLC细胞系中 MALAT1表达升高、miR-19b-3p表达降低,并且 MALAT1与 miR-19b-3p表达水平呈负相关(r= -0.8969,P<0.01);过表达 miR-19b-3p及敲除 MALAT1可使 A549细胞中 miR-19b-3p基因表达升高,MALAT1、 HIF-1α及 VEGF基因表达下降。过表达 miR-19b-3p使 A549细胞增殖能力、分裂能力、侵袭迁移能力下降,凋亡率增 加。结论 MALAT1可能靶向 miR-19b-3p调节 HIF-1α/VEGF参与非小细胞肺癌发生发展。