罗汉果苷IIIE的酶法定点糖基化修饰

罗汉果苷是由罗汉果Siraitia grosvenorii生物合成的四环三萜类皂苷。基于甜度高、热量低和口感好等优点,罗汉果苷已成为开发全新非营养型天然甜味剂的重要来源。本研究以甜度为蔗糖300倍且口味较好的罗汉果苷IIIE为模型化合物,利用糖基转移酶对11位羟基进行糖基化修饰,研究其与罗汉果苷类化合物甜度和口味的构效关系。通过糖基转移酶库的筛选,获得了能够区域选择性糖基化罗汉果苷IIIE 11位羟基的糖基转移酶HXSW-GT-2,然后经诱导表达条件优化实现了该酶在大肠埃希菌中的高效可溶性表达。在此基础上,通过对HXSW-GT-2反应条件如反应pH、温度、二磷酸尿苷葡萄糖二钠盐用量、反应时间等系统优化,罗汉果苷IIIE糖基化的转化率被提高至85%以上,扩大反应体系后纯化得纯度大于95%的糖基化产物MG-IIIE-Glu。口感测试结果表明,与罗汉果苷IIIE和5%蔗糖溶液相比,MG-IIIE-Glu的甜度基本消失,苦涩味明显。本研究初步阐释了11位羟基与罗汉果苷甜度和口感的构效关系,为该类天然甜味剂的构效改造和开发提供理论指导。     

HPLC法测定罗汉果中罗汉果苷Ⅴ和11-氧化罗汉果苷Ⅴ

目的建立HPLC法测定不同产地、不同栽培品系的罗汉果药材中罗汉果苷Ⅴ和11-氧化罗汉果苷Ⅴ。方法采用ODS（250mm×4．6mm，5μm）色谱柱，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，体积流量：0．75mL／min，检测波长：210nm，柱温：40℃。结果罗汉果苷Ⅴ在0．8046～20．1150μg线性关系良好（r=0．9998），平均回收率为104．6％，RSD为3．28％（n=6）。11-氧化罗汉果苷Ⅴ在0．5985～14．9625μg线性关系良好（r=0．9984）。结论本方法简便、快速、准确，可作为罗汉果药材的质量控制方法。     

HPLC法测定罗汉果中罗汉果苷V和11-氧化罗汉果苷V

目的建立HPLC法测定不同产地、不同栽培品系的罗汉果药材中罗汉果苷V和11-氧化罗汉果苷V。方法采用ODS(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,体积流量0.75mL/min,检测波长210nm,柱温40℃。结果罗汉果苷V在0.8046~20.1150μg线性关系良好(r=0.9998),平均回收率为104.6%,RSD为3.28%(n=6)。11-氧化罗汉果苷V在0.5985~14.9625μg线性关系良好(r=0.9984)。结论本方法简便、快速、准确,可作为罗汉果药材的质量控制方法。     

乙酰短杆菌酶法合成5—甲基尿苷

用乙酰短杆菌完整细胞为酶源,以鸟苷和胸腺嘧啶为底物,酶法合成５－甲基尿苷。最佳反应条件为：底物浓度１００－２００ｍｍｏｌ／Ｌ,ｐＨ８．０,磷酸盐缓冲液尝试１０－５０ｍｍｏｌ／Ｌ,６０℃,摇床转速１２０ｒ／ｍｉｎ,反应１ｈ即达到平衡,５－甲基尿苷转化率达６０％以上。     

HPLC测定罗汉果中罗汉果甜苷V的含量

[目的]建立HPLC法测定罗汉果药材中罗汉果甜苷V的含量。[方法]用Nucleosil 100-5 NH2(5μm,4.6mm×250mm)色谱柱,以乙腈-水-2.5%四氢呋喃(77∶22∶1)为流动相,流速为1ml/min,检测波长为203nm,柱温30℃。[结果]罗汉果甜苷V进样量在0.2136~21.3600μg线性关系良好(r=0.99993),平均回收率为96.96%,RSD为0.72%(n=5)。[结论]本方法简便、快速、准确,可作为罗汉果药材的质量控制方法。     

罗汉果甜苷的生物活性研究

报道了罗汉果Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ（Ｓｗｉｎｇｌｅ）Ｃ．Ｊｅｆｆｅｒｙ ｅｘ Ｌｕ ｅｔ Ｚ．Ｙ．Ｚｈａｎｇ提取物罗汉果甜苷（ｍｏｇｒｏｓｉｄｅｓ,Ｍｏｇ）的祛痰、镇咳、平喘等药理作用。结果表明：Ｍｏｇ能增加小鼠气管酚红的分泌量,抑制氨水诱发的小鼠咳嗽,促进青蛙食道粘液移动,但并不影响枸橼酸诱发的豚鼠哮喘。提示Ｍｏｇ有化炎镇咳作用,是罗汉果的有效活性成分。     

维生素E麦芽糖碳糖苷类似物的合成

1,2,3,6,2′,3′,4′,6′-八-O-乙酰基-β-麦芽糖与二甲基对甲氧基苯通过Friedel-Craft烷基化反应形成稳定的碳糖苷,经硝酸铈氨（CAN）氧化、低亚硫酸钠还原、无水氯化锌催化分子内醚化反应,合成了两类结构稳定且保留抗氧活性基团的新型VE麦芽糖碳糖苷类似物——包括ε-VE类的8-(2′, 3′, 6′, 2″, 3″, 4″, 6″-七-O-乙酰基-β-麦芽糖基)-6-羟基-2, 2, 5, 7-四甲基苯并二氢吡喃（10）和8-(2′, 3′, 6′, 2″, 3″, 4″, 6″-     

化学－酶法合成甜味天苯二肽

为探索天－苯甜二肽生产新技术,以马来酐与Ｌ－苯丙氨酸甲酯为原料经化学法缩合成马来酰－Ｌ－丙氨酸甲酯,并将后者异构化成富马酰－Ｌ－苯丙氨酸甲酯（ＦＰＭ）,收率９５％;再以ＦＰＭ及氨或氨供体为底物,经Ｅ．ｃｏｌｉＣＰＵ８９０１转化为天－苯甜二肽,产物浓度为５．６ｍｇ／ｍｌ。     

罗汉果甜苷对复合因素所致大鼠肝纤维化的保护作用

目的 研究罗汉果甜苷对复合因素所致大鼠肝纤维化的影响.方法 通过给予大鼠高脂、乙醇和四氯化碳三种因素建立复合因素诱导肝纤维化模型,观察罗汉果甜苷对肝纤维化大鼠的肝功能指标、脂质过氧化产物和胶原蛋白的影响.结果 与正常对照组相比,复合因素所致肝纤维化模型组血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量明显增加（P＜0.01）,肝组织脂质过氧化产物丙二醛（MDA）和胶原标志物羟脯氨酸（Hyp）含量也显著增加（P＜0.01）.与模型对照组相比,不同剂量罗汉果甜苷可剂量依赖性地降低大鼠血清中ALT活性及TC和TG含量（P＜0.05或＜0.01）;并可降低肝组织中MDA和Hyp的含量（P＜0.05或＜0.01）.结论 罗汉果甜苷对复合因素所致肝纤维化大鼠有一定的保护作用.     

化学—酶法合成甜味天苯二肽

为探索天－苯甜二肽生产新技术,以马来酐与Ｌ－苯丙酸甲酯为原料经化学法缩合成马来酰－Ｌ－苯丙氨酸甲酯,并将后者异构化成富马酰－Ｌ－苯丙氨酸甲酯（ＦＰＭ）,收率９５％;再以ＦＰＭ及氨或氨供体为底物,经Ｅ．ａｄｉ ＣＰＵ ８９０１转化为天－苯甜二肽,产物浓度为５．６ｍｇ／ｍｌ．     

药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸的酶法合成

目的 利用在大肠杆菌中高效重组表达的O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶A(OASS-A)合成药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸,并对合成产物进行纯度及结构鉴定.方法 通过PCR扩增目的基因Cys K,并连接到pET-22b(+)载体上构建原核表达质粒,重组体转到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达,重组蛋白采用Ni2-树脂柱亲和层析纯化,利用SDS-PAGE鉴定表达纯化蛋白,通过HPLC对合成产物纯度进行检测,应用1H NMR技术对化合物进行结构鉴定.结果 成功构建了OASS-A原核表达载体,在IPTG诱导下获得了高效表达.重组酶高效合成非蛋白质氨基酸S-苯基-L-半胱氨酸.合成的化合物以晶体形式析出,采用HPLC和1HNMR技术对其结构进行了鉴定,合成产物的纯度为100％.结论 利用大肠杆菌中重组表达的OASS-A能够高效合成药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸.     

酶催化合成CCK-4三肽片段

目的探讨酶法合成胃泌激素CCK-4 C-末端片段三肽衍生物Phac-Met-Asp(OMe)-Phe-NH2。方法以Phac-Met- OCam为起始原料,采用三种蛋白酶,即α-糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(α-chymotrypsin, papain,thermolysin),经过三步酶促反应得到目标三肽化合物;研究了酶催化条件下Met-Asp肽键的形成以及天门冬氨酸双酯中α-酯的酶催化条件下的选择性水解;对酶以及反应介质的选择等酶促合成条件进行了研究。结果三步酶促反应均可得到较合适的收率(63%~92%),产物经FAB-MS、FD-MS质谱确认。结论以α-糜蛋白酶为酶催化剂,在含有1.5% 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液的乙酸乙酯介质中,Phac-Met-OCam和H-Asp(OMe)2缩合可得到收率大于63%的缩合产物;木瓜蛋白酶催化下可选择性水解Phac-Met-Asp(OMe)2中的α-酯而保留β-酯;嗜热菌蛋白酶能有效地催化Phac-Met-Asp(OMe)-OH与H-Phe-NH2生成肽键。     

罗汉果甜苷对肝纤维化大鼠肝组织病理学和细胞的影响

摘要：目的研究罗汉果甜苷对复合因素所致肝纤维化病理组织改变及肝脏主要细胞肝细胞和肝星状细胞的影响。方法通过给予大鼠高脂、乙醇和四氯化碳三种因素建立复合因素所致肝纤维化模型,观察罗汉果甜苷对肝纤维化大鼠肝脏病理组织学、肝星状细胞活化标志a～平滑肌肌动蛋白（a—smoothmuscleactin,a—SMA）表达和肝细胞凋亡的影响。结果不同剂量罗汉果甜苷对肝组织纤维化病变有一定程度的改善作用,可抑制肝脏a—SMA表达,减少肝细胞凋亡的作用。结论罗汉果甜苷对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化和肝细胞凋亡有一定的抑制作用,可能为其抗纤维化的机制之一。     

壳聚糖的酶法降解

用壳聚糖酶降解壳聚糖,探讨了壳聚糖降解过程中温度、pH值、底物浓度和金属离子对酶促反应的影响。结果表明:酶促反应进行到5 h左右时,即可得到聚合度小于10的壳寡糖。该酶促反应的最适温度为50℃,最适pH=5.5;最适底物浓度为0.02 g/mL;金属离子Ca2+和Mg2+对酶降解有一定的促进作用,而Zn2+、Cu2+对酶降解有较强的抑制作用。该酶促反应符合米氏动力学方程,米氏常数Km=7.80 g/L,最大反应速率Vmax=7.72 g/(min.L)。     

固定化E.coli BL21(pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽

分别以卡拉胶、明胶、海藻酸钠包埋E.coli BL21 (pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽(GSH).从酶活收率及机械强度方面进行比较,选择卡拉胶为包埋载体,其最适pH为7.0,最适温度为40°C.相关物质对GSH的合成均有影响半胱氨酸、甘氨酸的最适浓度为20mmol/L,谷氨酸的最适浓度为60mmol/L;Mg2+/ATP为1～5(V/V)较合适;腺苷二磷酸(ADP)浓度为5mmol/L时对酶活的抑制为20%.优化条件下罐式反应器中GSH的产量为0.84g/L,操作稳定性较好;延迟加入甘氨酸时GSH产量可提高17.5%;与酵母生产ATP体系相耦联的共固定化体系在填充床中反应,GSH合成量达1.24g/L,收率比直接加入ATP提高24.2%.     

胞苷二磷酸胆碱酶促合成的研究

研究了胞苷三磷酸和磷酸胆碱在啤酒酵母磷酸胆碱胞苷酰转移酶催化作用下,直接合成胞苷二磷酸胆碱的反应条件,包括最适pH,底物浓度、镁离子浓度及反应时间的选择。在最适反应条件下转化率可达58%。此外,还测得了胞苷三磷酸的表观米氏常数K_M2×10~(-2)M,对酶的分离也作了初步的探索。