酵母双杂交筛选锥虫早老素蛋白相互作用蛋白

目的 筛选寻找锥虫早老素蛋白相互作用蛋白,以了解锥虫早老素蛋白功能.方法 体外表达锥虫早老素蛋白片段,装入pGBKT7诱饵质粒,与随机肽库系统共转化酵母,筛选阳性克隆并测序,通过与基因库锥虫功能序列比较,推导可能的相互作用蛋白.结果 获得108个阳性克隆,对其中50个进行了序列测定和比较,获得最有可能的4个候选基因,分别为:丝/苏氨酸性磷酸酶2b催化亚基A2;钙激活蛋白,含锚蛋白重复序列蛋白以及一个具有与APP跨膜区结合位点特征序列的功能未知蛋白.结论 成功利用随机肽库酵母双杂交系统筛选锥虫早老素蛋白相互作用基因,其相互作用仍有待进一步确认.     

利用酵母双杂交系统筛选与FXR1P相互作用的蛋白

目的筛选FXR1P相互作用蛋白,探讨FXR1P生物学功能。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体pGBKT7/FXR1,转化酵母菌AH109,与转化了人胎脑cDNA文库的酵母菌Y187交配筛选阳性克隆并测序。结果重组表达载体pGBKT7/FXR1构建成功;从人胎脑cDNA文库中筛选出5个与FXR1P结合的蛋白基因,分别与5种已知的编码蛋白基因序列同源：胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶（CMAS）、铁蛋白重链多肽1（FTH1）、高尔基体自身抗原golgina亚类4（GOLGA4）、17-β羟类固醇脱氢酶1（HSD17B1）、绒毛膜生长催乳激素1（CSH1）。结论为进一步研究FXR1P的功能及脆性X综合征发病机制提供新的线索。     

CytoTrap酵母双杂交系统筛选p85α蛋白相互作用蛋白

目的筛选与p85α蛋白发生相互作用的新蛋白质分子。方法 PCR扩增小鼠p85α基因全长,并将此基因重组入pSOS载体,构建诱饵质粒pSOS-p85α,经酶切及测序鉴定构建正确后将其转化酵母菌cdc25Hα,检测其在酵母中的表达及有无自激活作用,并利用CytoTrap酵母双杂交系统筛选与诱饵蛋白p85α相互作用的蛋白质分子。结果成功获得重组诱饵质粒pSOS-p85α,并验证其可在酵母细胞中表达诱饵蛋白pSOS-p85α,且诱饵质粒在此双杂交系统中无自激活。利用此系统筛选出4个能与p85α相互作用的细胞蛋白,分别为v-Ki-ras2克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同族体蛋白KRAS、小鼠着丝粒蛋白K、小鼠多聚嘧啶结合蛋白PTBP1、小鼠雄性激素调节蛋白RP2。结论成功筛选出小鼠p85α蛋白的相互作用蛋白,为进一步研究小鼠p85α蛋白及其相关信号通路的生物学功能提供了新线索。     

酵母双杂交筛选PA28γ相互作用蛋白

目的通过酵母双杂交筛选与蛋白酶体激活因子3(PA28γ)相互作用的肝细胞蛋白,为研究其在肝癌的发生发展中的作用机制提供新依据。方法通过酵母双杂交技术,构建PGBKT7-PA28γ蛋白酶体激活因子酵母双杂交诱饵载体,以PA28γ为诱饵,在人类肝细胞cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白,并将部分阳性基因构建表达载体后与PA28γ共转染于AGS细胞进行初步验证。结果筛选出32个阳性克隆,其中有5个与肝癌细胞周期及凋亡密切相关,如ZPR9。将PWPI-PA28γ和Pcmv-myc-ZPR9共转染AGS细胞,检测发现PA28γ含量与ZPR9负相关。结论成功筛选到一些与肝癌细胞周期及凋亡相关的蛋白,为研究其机制提供了良好的线索和基础。     

CytoTrap酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒HBx 蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒HBx蛋白发生相互作用的肝细胞蛋白。方法构建诱饵重组载体pSos-HBx,经测序正确后将
其转化酵母菌cdc25Hα中,检测其在酵母中的表达及有无自激活作用,并利用CytoTrap酵母双杂交的方法筛选与诱饵蛋白HBx
相互作用的肝细胞蛋白。结果获得重组诱饵质粒pSos-HBx,验证可以在酵母中表达诱饵蛋白Sos-HBx,且诱饵质粒在此系统
中没有自激活作用。利用此系统筛选出6个能与HBx相互作用的肝细胞蛋白,分别为纤连蛋白1、翻译调控肿瘤蛋白1、核受体
结合蛋白IQ-WD1、软泡抑素、血清类粘蛋白1、二硫化物异构酶家族A3。结论成功克隆出乙型肝炎病毒HBx蛋白的结合蛋白,
为进一步研究HBx蛋白在肝炎或肝癌过程中发挥的作用提供了新线索。
     

酵母双杂交RRS筛选系统对已知蛋白间相互作用的验证

目的:通过一对已知蛋白Pak和Chp间的相互作用介绍酵母双杂交RRS筛选系统,以期将此系统更广泛的用于蛋白间相互作用的研究.方法:挑选酵母温度缺陷株cdc25-2的低回复突变单克隆,醋酸锂法制备酵母感受态细胞.重组质粒Met425-Myc-Ras-Pak 单独转化酵母,排除诱饵蛋白的白激活作用.将两重组质粒Met425-Myc-Ras-Pak和Ura-M-ChpAc共转化酵母,设置不同质粒组合和不同培养基平板作为对照,观察酵母在36℃的生长情况.结果:制备感受态的cdc25-2细胞无回复突变发生.质粒Met425-Myc-Ras-Pak转化酵母后对细胞既无毒性也无自激活作用.只有当能够表达两已知蛋白的重组质粒共转化酵母,并且在适合它们表达的培养基上,cdc25-2细胞才能够在36℃生长.结论:(1)RRS筛选系统正确验证了Pak和Chp间的相互作用,可将其用于其它已知蛋白间相互作用的研究.(2)可以利用某已知蛋白构建诱饵,通过RRS筛选系统去寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白.     

酵母双杂交系统筛选FOXP3的相互作用蛋白

目的 利用酵母双杂交系统筛选与人FOXP3相互作用的蛋白.方法 应用酵母双杂交系统,将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-FOXP3,与转化了成人肝cDNA文库的酵母菌Y187接合,筛选与FOXP3相互作用的蛋白,通过一对一的回复性杂交实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析.结果 经过酵母双杂交共获得最终确认3个阳性克隆,测序后经生物信息分析为肿瘤蛋白D52、分裂因子3b及未知蛋白.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与FOXP3相互作用的3个蛋白,它们可能与Treg细胞的发育分化及其功能有关.     

用酵母双杂交体系筛选与FMRP相作用蛋白的cDNA

目的 采用平双杂交体系寻找与脆性Ｘ智力低下蛋白相互作用的蛋白,探讨ＦＭＲＰ的生物医学功能。方法以编码ＦＭＲＰＰｐｒｏ３２７－Ｔｈｒ５１８肽段的ＣＤＮＡ序列与ＰＢＴＭ１１６质粒ＤＮＡ结合结构域重组作为“钓饵”,从小鼠胎ＣＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白的ＣＤＮＡ。结果 筛选出１３个与ＦＭＲＰＰｒｏ３２７Ｔｈｒ５１８肽段特异性地相互作用的克隆,其中１２个为小鼠泛素转运酶９（ＵＢＣ９）,１个是在ＧｅｎＢ     

应用酵母双杂交筛选与FAM172A相互作用蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术（蛋白与蛋白的相互作用）,筛选人胎脑cDNA文库中与FAM172A蛋白相互作用的蛋白,为深入研究新发现的蛋白质FAM172A生物学功能及在疾病中的作用奠定基础.方法 构建pGB-FAM172A诱饵质粒,转化酵母菌株Y190.人胎脑cDNA转化诱饵酵母菌,于营养缺陷型培养基（SD/-Leu/-Trp/-His）上生长,从中筛选到35个单克隆进行β-半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验,对蓝色克隆者进行质粒抽提,转入大肠杆菌DH/OB,进行抗性筛选,从中提取质粒,一对一与诱饵质粒pGB-FAM172A共转酵母细胞Y190,进行验证鉴定,提取质粒DNA进行测序并进行BLAST比对分析.结果 成功构建pGB-FAM172A质粒,经严格筛选,共有10个阳性克隆,分别进行测序、序列比对,成功筛选出6个与FAM172A存在相互作用的蛋白：RTCD1、MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和TOX2.结论 利用酵母双杂交系统筛选出6个可能与FAM172A相互作用的蛋白,为进一步研究FAM172A蛋白的生物学功能提供了线索.     

应用酵母双杂交系统筛选MRP2胞内区相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术研究与多药耐药蛋白MRP2发生相互作用的蛋白.方法 应用酵母双杂交系统,以人MRP2胞内区C末端220个氨基酸为诱饵,筛选成人肝cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白.利用生物信息学分析,一对一酵母回复性杂交等提供的信息,筛除假阳性.结果 经过酵母双杂交共获得162个克隆,经过验证分析,最终确定3个无重复阳性克隆.结论 获得的3个基因编码的蛋白可能揭示MRP2新的作用机制.     

应用酵母双杂交技术筛选与前S1蛋白反式激活蛋白3结合的肝细胞蛋白基因

目的用酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白反式激活蛋白3(PS1TP3)的结合蛋白。方法通过聚合酶链反应扩增获得的PS1TP3基因,构建诱饵质粒pGBKT7-PS1TP3,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在涂有X-α-Gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上进行双重筛选,提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经BglII酶切后测序,进行生物信息学分析。结果筛选出30个与PS1TP3相互作用的蛋白,其中包括泛素蛋白酶E2、丝裂原活化蛋白激酶、β2-微球蛋白、磷酸酯酶张力蛋白等已知功能基因及4个未知功能序列,以及拼接新基因1个。结论成功克隆出PS1TP3蛋白的结合蛋白,为研究PS1TP3的分子生物学功能及HBV的致病机制提供了新的思路和线索。     

应用酵母双杂交方法筛选LRP16相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术筛选人乳腺癌细胞MCF-7中可与LRP16相互作用的蛋白。方法:将诱饵质粒pGBKT7-LRP16、MCF-7双链cDNA文库片段及线性化质粒pGADT7-Rec共转化AH109酵母菌,营养缺陷型培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)筛选阳性菌落。提取阳性克隆质粒进行PCR,将PCR产物测序,并将酵母质粒转化感受态大肠杆菌Top10获得与诱饵质粒有相互作用的单个文库质粒,测序后回复验证其在酵母中的相互作用。结果:获得8个与LRP16相互作用的候选蛋白,选取4个在酵母中进行回复验证,其中有3个可生长出阳性克隆。结论:应用酵母双杂交技术筛选出一族功能基本明确的可与LRP16相互作用的候选蛋白,为研究LRP16的病理生理功能和分子机制奠定了基础。     

酵母双杂交技术筛选与HCMV-UL146编码产物相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术,在人胎脑文库中筛选与人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV) UL146基因编码蛋白相互作用蛋白,以探讨HCMV-UL146的生物功能.方法 应用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-UL146诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人胎脑cDNA文库质粒的酵母相互作用,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌,提取质粒DNA进行测序分析.结果 pGBKT7-UL146构建成功.经严格筛选,共有200余个阳性克隆,分离测序80个克隆,成功筛选出30个与HCMV-UL146特异性相互作用的蛋白.结论 HCMV-UL146与多种蛋白有相互作用,提示其生物学功能复杂.此结果为进一步研究HCMV-UL146基因功能提供依据.     

利用酵母双杂交筛选与DAT1的LIM2相互作用的蛋白质

目的利用酵母双杂交系统筛选人胎脑组织中能与多巴胺相关转录因子DAT1的LIM2相互作用的蛋白质,以初步了解DAT1的功能.方法构建酵母双杂交诱饵质粒pLexA-LIM2,筛选人胎脑cDNA文库,并用酵母交配试验初步验证.结果获得3个能与DAT1的第2个LIM结构域LIM2结合的相互作用蛋白,通过酵母结合试验证实了它们在酵母中的结合.结论DAT1的第2个LIM结构域LIM2可与唐氏综合征关键区基因2(Similar to Down syndrome critical region gene2,DSCR2)、钙-整合素结合蛋白(calcium and integrin binding protein,CIB)、和HSPC170(CD34 hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs)结合.     

Screening of FOXP3-interacted proteins by yeast two-hybrid technique

Objective： To screen the proteins interacting with the Treg specification factor forkhead box protein P3 （FOXP3） by yeast two-hybrid system, Methods： Human FOXP3 gene was amplified by nest RT-PCR from peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and inserted into plasmid pGBKT7 to construct the bait vector, then the self-activation and toxicity of the bait vector in host yeast strain AH109 were observed. Thereafter, a human liver cDNA library was screened by the bait vector. The positive clones were selected out by nutrient-deficient culture and back-hybridizing. The sequences from the candidate positive clones were blasted and analyzed by bioinformatics methods. Results： The constructed bait vector encoding FOXP3 was found no self-activation and toxicity in yeast AH109. Three proteins which interacted with FOXP3, including tumor protein D52, splicing factor 3b subunit 1 and hypothetical protein, were identified. Conclusion： Three new candidate proteins interacting with FOXP3 are selected out by this yeast two-hybrid system and library, which may facilitate the further study of FOXP3 in Treg.     

用酵母双杂交技术筛选DND1相互作用蛋白

目的:小鼠睾丸生殖细胞瘤易感蛋白DND1是在进化中保守的RNA结合蛋白.为了进一步了解DND1的功能,我们筛选了与DND1相互作用的蛋白.方法:采用酵母双杂交系统,用Dnd1基因编码序列构建诱饵载体筛选小鼠10.5天的胚胎文库.结果:筛选小鼠胚胎cDNA文库得到4个与DND1相互作用蛋白,分别为Tun蛋白、辅肌动蛋白α...     

从小鼠胚胎干细胞文库中筛选PIASx相互作用蛋白

目的应用酵母双杂交系统,从小鼠胚胎干细胞cDNA文库中筛选与PIASx(protein inhibitor ofactivated STAT x,PIASx)相互作用的蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,探讨PIASx在干细胞分化中的作用机制。方法以pGBKT7-PIASx为诱饵质粒,从小鼠胚胎干细胞cDNA文库中筛选出与PIASx相互作用的阳性克隆,对验证后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,进一步采用直接酵母双杂交进行相互作用验证。结果经过筛选、测序、同源性分析及直接酵母双杂交验证,发现了6种与PIASx相互作用的蛋白。结论应用酵母双杂交系统,共筛选得到了6种不同的基因,其编码蛋白与PIASx相互作用,可能与小鼠胚胎干细胞的增殖与分化相关。对PIASx相互作用蛋白的筛选有助于揭示PIASx在胚胎干细胞中的作用机制。     

酵母双杂交技术筛选细胞极化蛋白PALS1的结合蛋白

目的筛选细胞极化蛋白PALS1的结合蛋白,进一步探讨PALS1的功能及其分子机制。方法将PALS1的全长cDNA序列克隆到载体pGBKT7中,重组的pGBKT7-PALS1质粒转入酵母AH109细胞,细胞置于SD/-Trp培养基上生长,阳性细胞再用Hela细胞的cDNA文库质粒转化,生长于SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal,显蓝色的克隆为阳性。阳性克隆细胞中的DNA被抽提后转化细菌细胞,然后抽提DNA进行酶切分型。合适的类型测序后进行BLAST检索分析。结果筛选到了13个阳性克隆,其中有2个是已知蛋白的基因即ATRAP和GLT28D1。结论利用酵母双杂交系统成功克隆了PALS1的结合蛋白的基因,为进一步研究PALS1蛋白的功能提供了有益的启示。