顺铂耐药乳腺癌细胞株的建立及FANCF 基因在耐药中的作用

[摘要] 目的：探讨三阴性乳腺癌顺铂（cisplatin, DDP)耐药细胞和敏感细胞中FA/BRCA通路关键基因FANCF的表达和功能,以及与DDP耐药的相关性。方法：DDP浓度递增法诱导建立乳腺癌细胞MDA-MB-231的DDP耐药细胞株MDA-MB-231/DDP;通过RNAi技术敲减MDA-MB-231 敏感细胞和DDP耐药细胞中FANCF,并在mRNA和蛋白水平进行敲减效果验证。CCK-8 法检测DDP耐药细胞株增殖活性,Western blotting 法检测该细胞中FANCF蛋白表达,流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞周期和凋亡情况,实时定量PCR（RT-qPCR）法检测FANCF mRNA的表达。结果：MDA-MB-231细胞DDP诱导3个月建立的MDA-MB-231/DDP细胞株耐药指数为13.5,其G0/G1 期细胞增多、S期和G2/M期细胞减少。MDA-MB-231/DDP细胞中FANCF mRNA和蛋白表达水平显著升高（均P<0.01）。FANCF敲低后MDA-MB-231/DDP细胞凋亡增加,细胞对DDP的药物敏感性显著升高（均P<0.01）。结论：FANCF基因通过抗凋亡作用导致MDA-MB-231细胞对DDP的耐药性,FANCF是乳腺癌治疗的一个潜在靶点。     

lncRNA LINC00504在乳腺癌组织及细胞中的表达、功能及可能机制

目的：探讨lncRNA LINC00504在乳腺癌中的表达、功能及可能的机制。方法：利用GEPIA等多个数据库分析LINC00504在乳腺癌组织中的表达及其与患者预后关系、与乳腺癌驱动基因相关性,筛选与LINC00504表达密切相关的关键基因并分析其相关信号通路。将si-LINC00504转染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和SKBR3,qPCR检测转染细胞中LINC00504的表达;CCK-8法检测转染细胞的增殖能力。结果：数据库分析显示LINC00504在乳腺癌组织和体外培养MDA-MB-231和SKBR3细胞中均呈高表达,其高表达患者的PFS长于低表达患者。LINC00504表达与乳腺癌驱动基因ERRB2和BRCA1呈正相关、与BRCA2呈负相关,LINC00504相关的20个关键基因涉及多种肿瘤,主要参与氨基酸代谢、糖酵解/糖异生途径。敲减LINC00504表达可促进MDA-MB-231和SKBR3细胞的增殖。结论：在乳腺癌组织中高表达的LINC00504与患者PFS有关联;其相关基因可能参与多种肿瘤的氨基酸和糖代谢;敲减LINC00504可促进MDA-MB-231和SKB...     

FANCF基因沉默增强多药耐药多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226/R对马法兰的敏感性

目的:使用小片段干扰RNA（siRNA）沉默FANCF基因表达,观察其对FA/BRCA途径的影响及对多药耐药多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226/R对交联剂马法兰的敏感性变化。方法:FANCF siRNA瞬时转染多药耐药细胞株RPMI8226/R,采用CCK-8法检测转染前后细胞对马法兰的敏感性变化,RT-PCR,western-blot法检测FA/BRCA途径中FANCF、FANCD2、BRCA2基因表达量的改变,彗星实验检测DNA损伤,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:FANCF siRNA转染耐药骨髓瘤细胞后,对马法兰的IC50值由17.29μmol/L降至4.88μmol/L;western-blot检测出瞬时转染FANCF siRNA后FA/BRCA途径中FANCF、FANCD2、BRCA2 蛋白表达量明显较转染前减低;彗星实验检测出转染后耐药细胞的DNA损伤增多;转染后马法兰诱导细胞凋亡率由（77.67±0.62）%升高至（88.37±0.25）%,提示FANCF基因沉默可使耐药RPMI8226/R细胞对化疗药物马法兰重新恢复敏感性。结论:FANCF基因沉默可抑制FA/BRCA途径中FANCD2及下游BRCA2基因表达,从而阻断FA/BRCA途径介导的DNA修复,增强马法兰对多药耐药骨髓瘤细胞株RPMI8226/R的细胞毒性,增加细胞凋亡率,为解决临床耐药问题提供一个新的思路。     

lncRNA 178030.2通过TRPS1对三阴性乳腺癌细胞紫杉醇耐药的影响与机制研究

目的:探讨lncRNA 178030.2通过TRPS1对三阴性乳腺癌细胞紫杉醇耐药的影响与机制。方法:采用逐步增加剂量间歇作用的方法诱导三阴性乳腺癌紫杉醇耐药细胞系并命名为MDA-MB-231/R。采用定量PCR和Western blot检测耐药细胞和亲本细胞中lncRNA 178030.2和TRPS1的表达;应用Lipofectamine 2000将lncRNA 178030.2高表达质粒pcmv-178030.2和对照质粒pcmv转染至MDA-MB-231细胞,分别为高表达组和对照组,定量PCR检测lncRNA 178030.2水平的变化,分别用定量PCR和Western blot检测TRPS1 mRNA及蛋白水平的变化;RIP实验检测lncRNA 178030.2是否与TRPS1相结合;MTT法检测MDA-MB-231细胞对紫杉醇的敏感性及细胞增殖。应用Lipofectamine 2000将lncRNA 178030.2小干扰RNA si178030.2和对照siNC转染至MDA-MB-231/R细胞,分别为干扰组和对照组,定量PCR检测lncRNA 178030.2水平的变化,分别用定量PCR和Western blot检测TRPS1 mRNA及蛋白水平的变化;MTT法检测MDA-MB-231/R细胞对紫杉醇的敏感性及细胞增殖。应用Lipofectamine 2000将TRPS1过表达质粒pcmv-TRPS1和对照质粒pcmv转染至MDA-MB-231细胞,分别为高表达组和对照组,分别用定量PCR和Western blot检测两组细胞中TRPS1 mRNA及蛋白水平的表达情况,然后再分别应用Lipofectamine 2000将lncRNA 178030.2高表达质粒pcmv-178030.2转染入两组细胞,MTT法检测MDA-MB-231细胞对紫杉醇的敏感性及细胞增殖。结果:成功构建在3 μg/ml紫杉醇中稳定生长的三阴性乳腺癌耐药细胞系MDA-MB-231/R。定量PCR结果显示:lncRNA 178030.2在紫杉醇耐药细胞系MDA-MB-231/R中的表达明显高于在其亲本细胞MDA-MB-231中的表达;定量PCR和Western blot显示:TRPS1 mRNA和蛋白在紫杉醇耐药细胞系MDA-MB-231/R中的表达明显低于在其亲本细胞系MDA-MB-231中的表达;与对照组相比,高表达lncRNA 178030.2组的MDA-MB-231细胞中TRPS1表达下降,细胞对紫杉醇的敏感性降低,细胞增殖增强,且lncRNA 178030.2确实可以与TRPS1相结合;与对照组相比,低表达lncRNA 178030.2组的MDA-MB-231/R细胞中TRPS1表达升高,细胞对紫杉醇的敏感性升高,细胞增殖减弱;在MDA-MB-231细胞中过表达TRPS1后再过表达lncRNA 178030.2,其促进紫杉醇耐药、促进细胞增殖的作用也明显减弱。结论:lncRNA 178030.2促进三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的紫杉醇耐药,促进细胞增殖,其发生机制可能与下调TRPS1的表达有关。     

Mus81基因沉默对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤能力的影响北大核心

目的:分析甲磺酸盐及紫外线敏感性81号基因(Mus81)在乳腺癌组织中的表达水平,观察Mus81基因敲减对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡和裸鼠移植瘤形成能力的影响。方法:从TCGA数据库下载乳腺癌样本基因表达数据,应用perl及R软件整理数据筛选出每个样本Mus81基因表达量。通过慢病毒介导的小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)技术构建Mus81基因敲减的MDA-MB-231乳腺癌细胞系(即Mus81敲减组)和阴性对照组MDA-MB-231乳腺癌细胞系,以实时定量PCR法检测Mus81基因的敲减效率,再以MTT检测实验、克隆形成实验、细胞流式检测及实时定量PCR法检测两组MDA-MB-231细胞的生长、增殖、细胞周期分布、凋亡水平及Mus81下游基因表达水平。最后,向BALB/c裸鼠右侧腋下注射Mus81基因敲减组和阴性对照组MDA-MB-231乳腺癌细胞,观察Mus81基因沉默对MDA-MB-231细胞在裸鼠中成瘤能力的影响。结果:Mus81基因在乳腺癌组织中的平均表达量明显高于癌旁组织(P<0.05)。Mus81基因敲减组MDA-MB-231细胞中Mus81基因的表达水平明显低于阴性对照组(P<0.05),Mus81基因的敲减效率达70.7%。较之阴性对照组,Mus81基因敲减组MDA-MB-231细胞的生长速度明显减缓(P<0.05);形成的细胞克隆数也明显下降(P<0.05);细胞凋亡水平、G2/M期细胞比例则明显升高(P<0.05)。STC2等Mus81下游基因的表达水平在两组MDA-MB-231细胞间也有明显差异(P<0.05)。裸鼠成瘤实验显示,Mus81基因敲减组形成的裸鼠瘤体体积和重量均明显低于阴性对照组(P<0.05)。结论:Mus81基因在乳腺癌组织中的表达明显升高,且可能通过调控STC2等下游基因的表达促进三阴性乳腺癌细胞的生长增殖及裸鼠体内成瘤能力并抑制其凋亡,提示其可能是一个潜在的乳腺癌治疗靶点。     

mTOR信号通路介导产生XCL1可促进乳腺癌耐药细胞株的增殖

背景与目的：统计表明90%以上肿瘤患者的死亡与肿瘤耐药相关,而在乳腺癌中常见PI3K/Akt/mTOR信号通路的异常激活,以此通路为靶点的药物已成为乳腺癌治疗的研究热点。本研究主要分析C族趋化因子配基1(C chemokine ligand 1,XCL1)对乳腺癌耐药细胞增殖的影响及其产生机制。方法：建立吉西他滨耐药性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231/Gem。采用CCK8检测MDA-MB-231和MDA-MB-231/Gem的增殖能力,RT-PCR、ELISA检测2株细胞株XCL1表达差异,Western blot检测mTOR的表达。结果：与MDA-MB-231相比,MDA-MB-231/Gem的增殖能力增强,XCL1在耐药细胞株表达增强。mTOR在耐药细胞株表达水平及磷酸化水平增强。在MDAMB-231中加入外源性XCL1 24 h后,细胞增殖能力增强。而在MDA-MB-231/Gem中加入抗XCL1抗体后,细胞增殖能力降低。mTOR抑制剂处理MDA-MB-231/Gem后,细胞增殖能力降低,XCL1产生减少。结论：趋化因子XCL1的分泌可促进乳腺癌耐药细胞的增殖并由mTOR信号通路介导产生。     

miR-101、EZH2和MYC调控乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖能力的机制

目的:研究miR-101、EZH2和MYC对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响,并探究三者之间的调控机制。方法:以实时荧光定量PCR法检测三阴型乳腺癌组织及相应正常乳腺组织中miR-101、EZH2与MYC的表达,以及乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞中miR-101的表达水平。以LipofectamineTM 2000将miR-101 mimics、EZH2 siRNA和MYC siRNA以及相应的阴性对照转染至MDA-MB-231细胞,Western blot法检测EZH2、MYC蛋白的表达,MTT法检测MDA-MB-231细胞的增殖能力。结果:相对于正常乳腺组织,三阴型乳腺癌组织中miR-101 mRNA的表达降低,而EZH2、MYC mRNA表达则显著升高;三阴型乳腺癌细胞中miR-101 mRNA的表达低于正常乳腺细胞MCF-10A。miR-101 mimics转染使MDA-MB-231细胞中miR-101 mRNA含量显著升高。miR-101过表达抑制EZH2、MYC的表达;EZH2敲减也抑制了MYC蛋白的表达。EZH2或MYC敲减可使miR-101 mRNA的表达显著升高。MTT实验结果示,miR-101过表达或敲减EZH2、MYC均可抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力。结论:miR-101通过EZH2与MYC形成反馈环路调控MDA-MB-231细胞的增殖能力。     

FANCF基因启动子甲基化在散发性肿瘤的发生和耐药性形成中的作用

FANCF是范可尼贫血 (Fanconi anemia,FA) 蛋白互补基团的重要成员之一,FANCF作为关键因子参与FA复合体的稳定及FANCD2泛素化激活过程,因此是维持FA/BRCA通路功能所必需的重要蛋白.FANCF通过FA/BRCA通路,参与细胞周期的调控、细胞凋亡、DNA的修复、基因转录与基因稳定性等多种生命信号的转导与调控.FANCF蛋白低表达及功能缺失与FANCF基因启动子超甲基化相关.本文主要综述了FANCF基因启动子甲基化与某些散发性肿瘤的发生和耐药性形成的相关研究,为进一步研究散发性肿瘤的发生和耐药性产生机制奠定一定的理论基础.     

Notch3增强三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对顺铂的敏感性

目的: 探讨干细胞相关因子Notch3在三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对顺铂化疗敏感性中的作用。方法: 用Lipofectamine 2000试剂转染乳腺癌MDA-MB-231细胞并用G418筛选稳定转染细胞系,根据转染质粒不同分为MDA-MB-231-PCLE组(对照组)和MDA-MB-231-N3ICD组(过表达Notch3组),应用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测不同组间Notch3表达的差异;用CCK8法检测各组MDA-MB-231细胞对顺铂敏感性的差异;同时利用Lipofectamine 2000转染Notch3的小干扰序列,根据转染序列不同分为T47D-NC(对照组)和T47D-siNotch3(Notch3敲减组);采用免疫印迹检测Notch3表达改变后凋亡相关因子caspase-3的表达情况。结果: 与对照组比较,高表达Notch3后三阴性乳腺癌对顺铂的敏感性增加(P<0.05),同时caspase-3的表达随着Notch3的增加而增加,而在高表达Notch3的乳腺癌T47D细胞中,敲减Notch3的表达使caspase-3表达减少。结论: 高表达Notch3可以增加三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对顺铂的敏感性,从而增强患者化疗疗效。     

顺铂诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231/DDP细胞株的建立及鉴定

目的 建立人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231顺铂（DDP）耐药细胞株,并对其耐药机制进行初步分析。方法 采用逐步增加顺铂浓度、间歇诱导的方法,建立人三阴性乳腺癌MDA-MB-231/DDP体外耐药细胞模型;MTT法检测MDA-MB-231/DDP的耐药特性;高效液相色谱法检测耐药细胞内DDP药物浓度的改变; 实时荧光定量PCR法分析两种细胞耐药相关基因MDR1、BCRP、MMP7及 GST-π表达差异。结果 MTT显示MDA-MB-231/DDP的顺铂、5-氟尿嘧啶及环磷酰胺的耐药指数分别为9.80、4.43及2.21;高效液相检测显示2种细胞分别与6 μg/ml的DDP接触24 h后,MDA-MB-231细胞内DDP的浓度为（47.10±2.37）ng/（5×10⁴） cells,而MDA-MB-231/DDP细胞则为（6.30±1.64）ng/（5×10⁴）cells（P<0.01）;MDA-MB-231/DDP细胞中MDR1、BCRP、MMP7及GST-π基因 mRNA的表达量分别是亲本细胞的15.39、13.73、22.52及44.90倍（P<0.01）。结论 逐步增加浓度、间歇诱导的方法建立了稳定、耐药性较高的MDA-MB-231/DDP细胞株,其耐药机制可能与ABC转运蛋白表达增加等多种机制相关。