重组hEGF-TCS融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的 构建新型人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)和天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-TCS融合蛋白.方法 利用基因工程技术将人表皮生长因子EGF和天花粉蛋白基因连接起来,克隆到高效表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-EGF-TCS.并在大肠杆菌M15中表达该融合蛋白(EGF-TCS).产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化.结果 重组表达质粒pQE30-EGF-TCS在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达.目的蛋白占细胞总蛋白的40%左右,以可溶性形式存在,表达上清柱纯化纯度达95%以上.结论 应用基因工程技术,成功构建了融合蛋白EGF-TCS,为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定了基础.     

人表皮生长因子-天花粉蛋白融合蛋白的基因克隆、表达及纯化

目的 构建人表皮生长因子(EGF)-linker-天花粉蛋白(TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-linker-TCS融合蛋白.方法 用PCR方法扩增EGF及柔性连接肽Linker基因片段,插入质粒PQE30-TCS中,转化至大肠杆菌M15中,表达该融合蛋白(EGF-linker-TCS).表达产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化.结果 PQE30-EGF-linker-TCS蛋白在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达.目的蛋白占细胞总蛋白的40%左右,以可溶性形式存在,表达上清柱纯化后纯度达95%以上.结论 应用基因工程技术,成功地构建了融合蛋白EGF-linker-TCS的表达载体,表达并纯化了该融合蛋白,为进一步研究其结构功能关系和肿瘤临床应用奠定了基础.     

重组人表皮生长因子联合纳米银护创液作用于糖尿病溃疡动物模型的实验研究

目的观察重组人表皮生长因子（rhEGF）联合纳米银护创液作用于糖尿病溃疡动物模型创面的疗效。方法建立糖尿病溃疡动物模型,随机分为重组人表皮生长因子组和重组人表皮生长因子＋纳米银护创液组,动态观察两组的溃疡愈合面积、愈合时间及动态愈合率。结果重组人表皮生长因子＋纳米银护创液组溃疡的面积变化、愈合时间及动态愈合率与重组人表皮生长因子组相比较均有显著性差异（P〈0.01）。结论重组人表皮生长因子与纳米银护创液联合使用比单纯使用重组人表皮生长因子更能显著促进糖尿病溃疡创面的愈合。     

重组人表皮生长因子作用于糖尿病溃疡动物模型的实验研究

目的 观察重组人表皮生长因子(rhEGF)作用于糖尿病溃疡动物模型创面的疗效.方法 建立糖尿病溃疡动物模型,随机分为凡士林纱布组和重组人表皮生长因子组,动态观察凡士林纱布和重组人表皮生长因子对溃疡面积、愈合时间及动态愈合率的影响.结果 重组人表皮生长因子组溃疡的面积变化、愈合时间及动态愈合率与凡士林纱布组相比较有显著差异(P<0.01).结论 重组人表皮生长因子可以显著促进糖尿病溃疡创面的愈合.     

人表皮生长因子真核表达载体的构建

目的：构建人表皮生长因子的真核表达载体。方法：采用RT-PCR扩增人表皮生长因子(hEGF)cDNA基因序列并克隆入PGEM-T载体,再用限制性内切酶切取目的基因,插入pcDNA3．1真核表达载体。结果：重组体经转化E．coli JM109感受态大肠杆菌后可大量扩增,提取重组体进行限制性酶切及PCR可见目的片段。结论：已成功构建hEGF真核表达载体,为进一步研究hEGF的功能奠定了基础。     

人表皮生长因子对兔角膜上皮细胞生长的影响

人表皮生长因子是细胞生长因子之一。应用本室自制的人表皮生长因子加入培养的兔角膜上皮细胞中，观察对角膜上皮细胞生长的影响。结果表明：加入人表皮生长因子的实验组比未加人表皮生长因子的对照组的上皮细胞数目明显增加。本文提出了快速、简单、大量培养上皮细胞的新方法。     

人表皮生长因子受体胞内酪氨酸激酶结构域原核表达

目的研究人表皮生长因子受体（EGFR）胞内酪氨酸激酶结构域的原核表达及纯化条件。方法构建原核表达人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的重组质粒pGEX／GST—EGFR-TKD，在大肠杆菌中表达目的融合蛋白，通过在尿素中变性、在梯度尿素中透析复性，经GST融合蛋白纯化，肠激酶去除GST“标签”后获得人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域蛋白。结果限制酶切分析和测序表明成功构建重组质粒pGEX／GST—EGFR—TKD；SDS-PAGE分析表明，异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导下可以表达融合蛋白GST—EGFR-TKD，但以不溶性包涵体的形式存在。经尿素变性、梯度透析复性及去除GST“标签”后，获得重折叠的人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域蛋白。结论在大肠杆菌中可成功表达人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域蛋白。     

人表皮生长因子对兔用角膜上皮细胞生长的影响

人表皮生长因子是细胞生长因子之一。应用本室自制的人表皮生长因子加入培养的兔角膜上皮细胞中，观察对角膜上皮细胞生长的影响，结果表明：加入人表皮生长因子的实验组比未加人表皮生长因子的对照组的上皮细胞数目明显增加。本文提出了快速、简单，大量培养上皮细胞的新方法。     

肝癌细胞生物学行为改变涉及p120ctn酪氨酸磷酸化的研究

目的 以表皮生长因子刺激肝癌细胞内p120^ctn酪氨酸磷酸化,观察p120^ctn酪氨酸磷酸化与p120^ctn在细胞内转位及肝癌细胞生物学行为的关系,探讨p120^ctn在肝癌细胞粘附和信号转导中的作用。方法 使用免疫沉淀和免疫印迹法检测表皮生长因子引起的p120^ctn酪氨酸磷酸化改变情况,用间接免疫荧光法观察了表皮生长因子引起的p120^ctn在BEL—7404人肝癌细胞内的分布、转位。用相应的方法检测表皮生长因子促使BEL—7404人肝癌细胞的细胞形态和细胞粘附能力的改变情况。人全长p120^ctn反义核苷酸转染细胞,观察表皮生长因子促使的p120^ctn磷酸化改变情况是否受到明显抑制。结果表皮生长因子可使BEL—7404人肝癌细胞内的p120^ctn酪氨酸发生磷酸化,以表皮生长因子作用20min时最明显;在细胞内转染人全长p120^ctn反义核苷酸后,表皮生长因子对p120^ctn酪氨酸磷酸化的上调作用明显减弱。表皮生长因子刺激下,磷酸化的p120^ctn发生了细胞内转位,表现为p120^ctn细胞膜的表达明显减少,核表达增加;同时β—连环蛋白也发生相似的改变;表皮生长因子刺激下,BEL—7404人肝癌细胞的粘附能力明显下降;细胞形态变为细长和不规则,伪足增多。结论 在表皮生长因子刺激下BEL—7404中p120^ctn酪氨酸磷酸化增加,p120^ctn发生从细胞膜到核内的转位,并同表皮生长因子引起的细胞形态和细胞粘附能力的改变密切相关。结果 提示p120^ctn酪氨酸磷酸化与p120^ctn在细胞内的转位和细胞的生物学行为密切相关。     

表皮生长因子治疗萎缩性鼻炎的效果观察

表皮生长因子 (EGF)是一种促进上皮细胞生长的活性肽 ,Cohen首次以小鼠颌下腺分离出表皮生长因子 (hEGF) ,随后他从人的体液中分离出人表皮生长因子 (hEGF) [1] 。表皮生长因子能与靶细胞中的生长因子受体结合而产生生物效应 ,具有刺激细胞增殖 ,分化的作用 ,局部应用可促进创面组织愈合 ,表皮生长因子是已达到可用临床研究的细胞因子之一。最近我们将表皮生长因子应用于临床上对比较难治的萎缩性鼻炎进行治疗 ,取得比较满意的效果 ;现将观察结果报告如下。1　临床资料1 1　一般资料　萎缩性鼻炎 6 8例 ,其中女 6 7例 ,男 1例 ;年龄 2 5…     

表皮生长因子及其受体在人原发性肝细胞癌中的表达

表皮生长因子及其受体在人原发性肝细胞癌中的表达吴晓英彭隆祥（电镜室长沙４１００７８）⒇关键词肝肿瘤；癌；增生；表皮生长因子＊；受体；免疫组织化学中图号Ｒ７３５．７随着分子病理学的进展，近年各种生长因子与肿瘤的关系越来越引起人们的关注。已知表皮生长因子...     

非病毒载体H1s-EGFc的构建及其功能的初步研究

目的 探讨和构建一种用于靶向性基因治疗的非病毒载体。方法 采用基因工程的方法构建H1s—EGFc融合蛋白表达载体,在毕赤酵母表达系统中获得分泌表达的融合蛋白。使用阴离子交换柱及分子筛进行纯化。制备H1s—EGFc融合蛋白与pKG杀伤基因表达重组体的复合物。选用表皮生长因子受体高表达的HeLa细胞及表皮生长因子受体不表达的Jurkat细胞进行复合物特异性杀伤活性测试。结果 构建并表达了H1s—EGFc融合蛋白,所获融合蛋白纯度可达90％以上。该融合蛋白能够有效地包装杀伤基因表达载体,将其导入表皮生长因子受体特异性表达的肿瘤细胞中,达到靶向性杀伤作用,当融合蛋白／杀伤基因复合物使用剂量分别是3、6、9μg／ml时,杀伤率分别为30．6％、36．2％和58．1％;而对表皮生长因子受体不表达的细胞无杀伤作用。结论 融合蛋白H1s—EGFc能够有效地用于功能基因的包装及转运,可以作为非病毒载体应用于恶性肿瘤的靶向性基因治疗。     

重组人表皮生长因子治疗放射性口腔溃疡的疗效观察与护理

目的:观察重组人表皮生长因子治疗放射性口腔溃疡的疗效。方法:分析放射性口腔溃疡发生的原因和治疗措施。对照组给予常规口腔护理,餐后使用呋喃西林漱口液漱口,每次漱口后片刻用锡类散进行喷涂,观察组在对照组的基础上,用呋喃西林漱口后片刻用重组人表皮生长因子进行局部喷涂。结果:用重组人表皮生长因子组治愈率优于对照组。结论:重组人表皮生长因子治疗放射性口腔溃疡具有临床实用价值。     

两种方法治疗糖尿病大鼠皮肤溃疡同体效果观察

目的 观察唐肌康和重组人表皮生长因子凝胶治疗糖尿病大鼠皮肤溃疡效果及差异性.方法 同体对照,分别采用唐肌康和重组人表皮生长因子凝胶对10只糖尿病大鼠背部两侧皮肤溃疡进行外敷治疗,观察溃疡创面大小、自溶清创效果、有无换药疼痛.结果 唐肌康自溶清创效果高于重组人表皮生长因子凝胶（t=-1.455,P=0.172）;唐肌康换药疼痛显著低于重组人表皮生长因子凝胶（=68.850,P=0.000）.结论 两种方法治疗糖尿病大鼠皮肤溃疡均有效,唐肌康自溶清创效果、换药疼痛优于重组人表皮生长因子凝胶.     

人表皮生长因子缓释型滴眼剂对角膜碱烧伤的基因治疗

目的观察人表皮生长因子基因对角膜细胞的转染情况,探讨用人表皮生长因子基因对角膜损伤治疗的可行性。方法利用基因重组技术构建了人表皮生长因子全基因序列,将该基因序列插入 pcDNA3.1真核表达高效穿梭质粒,用脂质体制成人表皮生长因子基因缓释型滴眼剂,滴眼治疗家兔角膜碱烧伤。在治疗后的不同天数,分别测定了角膜组织中人表皮生长因子 mRNA 和 DNA 的表达,用 ELISA 法测定了人表皮生长因子在兔角膜组织中的含量。结果在基因转染后24h 至28天,角膜组织分别用 RT-PCR 和 PCR 均可检测出人表皮生长因子 mRNA 和 DNA 表达。用 ELISA 法测定人表皮生长因子蛋白质表达水平。结果表明,在转染后24h,实验组分别与对照组和空白组平行对比,实验组蛋白质表达水平明显升高(P<0.01),第7天达高峰,为224.286mg/g 角膜湿重,随后逐渐降低,持续可表达20天以上;在转染后24h,免疫组织化学染色在全层角膜细胞内亦可见 hEGF 蛋白质表达,第7天达到高峰,细胞转染率高达98%以上,随后逐渐降低,持续可表达20天以上。结论用 pcDNA3.1真核表达高效穿梭质粒作为载体,携带人表皮生长因子基因用脂质体包裹后制成缓释型滴眼液,以滴眼的方式给药转染角膜,可达到极高的转染率,具有良好的应用前景。     

靶向性抗肿瘤融合蛋白-表皮生长因子-腺病毒早期转录区4第4编码蛋白在细胞内的转运及对胞外信号调节激酶磷酸化的影响

目的 探讨经表皮生长因子受体介导进入肿瘤细胞的融合蛋白表皮生长因子-腺病毒早期转录区4第4编码蛋白(EGF-E4orf4)在细胞内的转运及对胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化的影响.方法 采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在MDA-MB-231和BGC823细胞中的转运和代谢特点,Western blot检测融合蛋白引起的细胞内ERK磷酸化水平的改变.结果 融合蛋白可在细胞内累积,向细胞核周围聚集,并与细胞早期内体和晚期溶酶体共定位;融合蛋白能快速触发细胞内ERK发生磷酸化,磷酸化水平在10min时最强,之后逐渐回落至刺激前水平,活化ERK的能力较表皮生长因子弱.结论 融合蛋白EGF-E4orf4在细胞内经内体-溶酶体途径发生缓慢降解;在MDA-MB-231和BGC823细胞中,融合蛋白的作用特点存在明显差异,可能是导致融合蛋白对二者抑瘤率不同的原因之一.     

重组人表皮生长因子(rhEGF)与百克瑞纱布联合治疗烧伤后期残余创面的疗效观察

目的 观察重组人表皮生长因子(rhEGF) 加百克瑞纱布治疗烧伤后残余创面的疗效.方法 选择烧伤后期残余创面40例,随机分为对照组20例(用百克瑞纱布换药)和治疗组20例(用重组人表皮生长因子(rhEGF) 加百克瑞纱布换药),观察创面愈合情况及创面愈合后的瘢痕情况. 结果 与对照组比较,重组人表皮生长因子(rhEGF)组创面愈合时间明显缩短,预后瘢痕轻. 结论重组人表皮生长因子(rhEGF) 加百克瑞纱布治疗烧伤后残余创面能加速残余创面愈合,能有效减轻后期瘢痕增生挛缩.     

生物技术Ⅰ类新药重组人表皮生长因子凝胶研制成功

包括EGF、FGE、EPO、G-CSF、IL-2、IL-11等在内的多种生长因子在近年获准临床使用完全取决于有关因子和受体的基础研究取得了重大进展。人表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)是50年代由Cohen和Montalcini在研究鼠神经生长因子时发现的一种多肽生长因子,由53个氨基酸组成。1975年由人尿中又纯化出了人表皮生长因子,其可抑制胃酸分泌故又称抑胃素。它们均有广泛的刺激细胞增殖的作用。而这种作用是通过结合细胞膜上的表皮生长因子受体产生的。近年来。在国内外,天然的与重组的表皮生长因子已应用于角膜、皮肤损伤和胃肠溃疡的临床试验。     

重组人表皮生长因子治疗糖尿病合并溃疡的观察及护理

目的:对糖尿病合并溃疡应用重组人表皮生长因子进行治疗和护理观察其临床效果。方法:在清创和控制感染的基础上,对糖尿病溃疡创面涂擦重组人表皮生长因子凝胶并用3M透明敷贴固定。结果:创面均愈合,皮肤光滑,均未在住院期间发生新的溃疡。结论:重组人表皮生长因子凝胶与3M透明敷贴治疗糖尿病合并溃疡效果好,而且方法简单、安全,可减轻患者的痛苦和护士的工作负担。     

甲基营养型酵母系统表达的重组人表皮生长因子的纯化及其性质

目的 获得可用于动物试验和临床试验的人表皮生长因子原料药。方法 化学合成的人表皮生长因子基因在甲基营养型酵母中表达并分泌到培养中的人表皮生长因子蛋白经Phenysepharose6Fast Folw(high sub)柱、Q－sepharose High Performance柱、Superdex30柱纯化后进行生物学性质检测。结果 纯化后的蛋白产物纯度达98％、是无热源、无内毒素、无甲基营养性质的重组蛋白。结论 纯化蛋白符合动物试验和临床试验的要求,为制备多种人表皮生长因子制剂进行动物实验和临床试验打下了基础。