HRM-非标记探针法检测IL-15基因SNPs方法的建立

目的建立用于检测白细胞介素-15(IL-15)基因单核苷酸多态性(SNP)位点的高分辨率熔解曲线(HRM)-非标记探针的方法。方法采用HRM-非标记探针法及小片段扩增法对80名健康儿童IL-15基因4个SNPs位点进行基因分型,采用基因测序法进行验证并同时与小片段扩增法分型结果进行比较。结果 HRM-非标记探针法与基因测序分型结果一致,准确率为100%;未加入温度内标的小片段扩增法不能区分野生纯合子和突变纯和子。结论 HRM-非标记探针法是对已知SNP位点突变研究的一种廉价、简便、准确的基因分型技术,适合于对已知的SNP位点或基因突变进行分型和检测。     

熔解曲线分析法检测乙醛脱氢酶2基因多态性

目的应用熔解曲线分析法建立乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因Glu504Lys多态性分型方法并探讨其临床应用价值。方法提取受检者EDTA-K2抗凝外周血的基因组DNA,用等位基因特异性PCR(AS-PCR)扩增ALDH2基因,通过熔解曲线分析扩增峰,对乙醛脱氢酶2基因504位点的多态性进行基因分型,并与DNA微阵列芯片法的检测结果进行比较,出现结果不一致时,用基因测序法进行验证。结果对60例外周血标本进行ALDH2基因的多态性分型检测,两种方法检测结果均为野生型(Glu504Glu)27例,突变型(Lys504Lys)13例,杂合型(Glu504Lys)20例,熔解曲线分析方法与DNA微阵列芯片法分析结果完全一致(Kappa值为1)。结论本研究成功建立了基于熔解曲线分析检测乙醛脱氢酶2基因Glu504Lys多态性分型方法。     

高保真酶特异性检测大鼠SNP基因型新方法

目的应用高保真酶(Pfu)和3’末端修饰引物在单管双向等位基因特异性扩增(SB-ASA)中区分SNP基因型,建立高保真酶特异性检测SNP基因型的新方法。方法选取近交系大鼠SNP位点,以RS8149053为例,设计两个外部引物和两个等位基因特异性引物,四引物3’末端进行硫代磷酸化修饰,应用高保真聚合酶(Pfu)进行特异性扩增,扩增结果测序验证其可靠性。结果在RS8149053 SNP位点(C/T)上,等位基因型CC扩增出179 bp目的片段,基因型TT扩增出597 bp目的片段,基因型不同则扩增出分子量不同的片段,目的条带测序结果与Rat Genome Database数据库基因型结果一致,高保真酶扩增结果稳定且特异性强。结论高保真酶等位基因特异性扩增技术能有效降低假阳性率,是一种快速、特异的SNP基因分型新方法。     

CYP1B1 432C/G基因多态性与子宫内膜异位症易感性的相关研究

目的探讨中国南方汉族妇女CYP1B1基因第3外显子432C/G(rs1056836)位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与子宫内膜异位症(endometriosis,Ems)遗传易感性的相关性.方法收集经手术证实的432例Ems患者和499例对照人群外周血,采用荧光定量PCR为基础的高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting,HRM)技术检测CYP1B1 432C/G基因SNP.结果病例组和对照组妇女CYP1B1 432C/G位点CC、CG、GG基因型频率分别为80.6%、18.8%、0.7%以及77.6%、21.0%、1.4%,2组的基因频率分布差异无统计学意义(P>0.376);C和G等位基因分布为89.8%、10.1%以及88.1%、11.9%,2组差异无统计学意义(P>0.376).结论中国南方汉族妇女CYP1B1 432C/G位点SNP与Ems遗传易感性无明显相关性.     

高分辨率熔解曲线法检测中国北方汉族人群KIF6基因的单核苷酸多态性

目的 探讨用新型基因分析法—高分辨率熔解曲线法(high resolution melting,HRM)分析中国北方汉族人群驱动蛋白分子6(KIF6)基因Trp719Arg(rs20455)的单核苷酸多态性.方法 样本来自2010至2011年心内科门诊及住院的234例非致死性心肌梗死患者(病例组)和228例非冠心病人群(对照组).取受检者静脉血样1ml,留存于-80℃超低温冰箱.采用HRM法对rs20455位点进行基因多态性分型检测.结果 对照组中rs20455位点TT、TC、CC基因型频率分别为29.5％、47.4％、23.1％;T、C等位基因频率分别为47.0％和53.0％;病例组的基因型频率是TT 14.0％、TC 59.7％、CC 26.3％,T、C等位基因频率分别为56.0％和44.0％;病例组与对照组基因型和等位基因频率在2组间分布差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 成功利用HRM对中国北方非致死性心肌梗死患者和非冠心病人群的KIF6 Trp719Arg位点进行了基因分型,并发现其在心肌梗死患者和非冠心病人群中分布差异有统计学意义,提示rs20455可能是中国北方汉族人群中非致死性心肌梗死筛查的生物学标记物之一.     

胰岛素样生长因子1基因多态性与食管癌遗传易感性的关系

目的:研究中国汉族人群中胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)基因多态性与食管癌发生危险因素的关系.方法:采用病例对照研究方法,以高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)小片段扩增子法分析260例食管癌患者和384例非肿瘤患者的IGF...     

单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性

目的:建立了一种单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性(SNP).方法:以TYP基因外显子1上的3个SNP位点(71G>A、425A>T和758G>A)为例,首先采用PCR预扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;然后用限制性内切酶将其消化成短片段,在连接酶的作用下与设计的DNA适配器相连;以此连接产物为模板,在单个PCR管中加入一种适配器特异性通用引物和所有等位基因特异性引物进行PCR扩增;最后用琼脂糖凝胶电泳法分离检测PCR扩增产物,并根据扩增片段的大小判断SNP的类型.结果:采用该法成功测定了30名健康中国人的TYP基因中的3个SNP位点,与限制性片段长度多态性法(RFLP)测定结果完全一致.结论:该方法特异性高、结果准确、检测成本低,可用于同时测定多个SNP位点.     

高分辨率熔解曲线在CRISPR基因编辑检测和基因型鉴定中的应用

目的 建立一种基于PCR和在线高分辨率熔解曲线（high-resolution melting curve, HRM）分析工具的检测方法,实现对DNA序列微小差异的快速检测。方法 在CRISPR基因编辑检测和基因型鉴定中,采用两步PCR,分别对目的片段进行扩增和富集,并通过免费在线软件对HRM进行分析。结果 HRM分析结果显示,本实验所设计的CRISPR慢病毒系统未能对COS7细胞中的RPE65基因进行有效的基因编辑;而在瘦素突变大鼠的子代基因型中,HRM可以明显区分杂合子和纯合子。结论 HRM能够快速鉴定CRISPR编辑和区分基因型。     

冬虫夏草的成熟伴随着冬虫夏草子座中多个基因突变型冬虫夏草菌表达的变化

目的:检测冬虫夏草成熟过程中冬虫夏草菌转换突变和颠换突变基因型在子座中表达的动态变化。方法:采用MassARRAY单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)质谱基因分型法,根据冬虫夏草菌基因内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列中大量散在的点突变,设计了8个SNP延伸引物,其中5个位于rDNA ITS1和ITS2段:067721-211,067721-240,067721-477,067721-531和067721-581,用于检验GC和AT偏倚基因型,但不区分两个AT偏倚基因型;另外3个延伸引物位于rDNA 5.8S段:067740-324,067740-328和067740-360,用于区分两个AT偏倚基因型。应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ioniza-tion-time of flight,MALDI-TOF)测定各个SNP位点的单核苷酸延伸反应,观察未成熟和成熟冬虫夏草子座中转换突变和颠换突变基因型表达的动态变化。结果:冬虫夏草子座rDNA的8个SNP位点的质谱图显示复杂的动态变化。067721-211位点的AT偏倚型等位基因的分子浓度明显高于GC偏倚型,但随着冬虫夏草的成熟,这个位点的AT型等位基因消失。多个SNP位点的质谱图中不仅显示转换突变的等位基因,颠换突变等位基因也有很高的检出率,有些甚至超过GC和AT偏倚基因型等位基因的峰高;而随着冬虫夏草的成熟,颠换突变等位基因的检出率和峰高趋于下降。在区分两个AT偏倚基因型的研究中,AB067744和AB067740两个基因型的等位基因同时存在于未成熟冬虫夏草子座中。随着冬虫夏草的成熟,AB067744基因型等位基因的峰高大幅度降低,而AB067740基因型等位基因的峰高大幅度升高。结论:在冬虫夏草子座中共存的至少5个冬虫夏草菌突变基因型的表达随着冬虫夏草的成熟呈现动态变化,这些突变基因型菌的存在和它们的动态变化对于冬虫夏草子座的萌发和成熟具有重要意义。     

DNA修复相关基因SNP与辐射致离体血微核率的相关性研究

目的 分析DNA修复相关基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与辐射致离体血微核率(micronucleus frequency, MNF)的关系，为寻找辐射易感性标志物提供理论依据。方法 采集75例研究对象的外周血并分为乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗凝血样本和肝素抗凝血样本。提取EDTA抗凝血样本的DNA,设计8种基因11个SNP的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)引物和单碱基延伸引物，通过PCR扩增、延伸，应用DP-TOF型飞行时间质谱检测系统对SNP位点进行基因分型。将肝素抗凝血样本分为两份，一份行1.0 Gy X线照射为辐照组，另一份未行照射为对照组，采用胞质分裂阻断微核实验对两组外周血淋巴细胞进行MNF测定。结果 75份样本11个SNP位点均分型成功，检出率100.0%。辐照后，外周血淋巴细胞MNF升高(1.919‰±0.642‰vs. 0.177‰±0.107‰,t=22.925,P<0.001)。X线交...     

无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性

目的：探讨无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性（SNP）的实用性．方法：采用新型荧光染料EvaGreen和无标记探针技术对IL-6基因启动子SNP进行基因分型．以其-597G〉A位点为例设计PCR扩增引物和无标记探针,按PCR扩增效率和产物特异性进行Mg^2＋浓度、不对称PCR引物比例以及模板浓度等条件的优化．并用此优化体系基因分型100例临床标本,杂合型与突变型以测序验证．结果：结果显示EvaGreen荧光PCR检测体系是最适Mg^2＋浓度为2．5mmol／L,不对称PCR引物比例为0．1／0．5umol／L,模板浓度为10ng／10uL的两步法不对称PCR．该体系对100例样本进行IL-6基因～597G〉A位点基因分型,发现7例杂合型和1例突变型,经测序与检测结果一致．结论：无标记探针技术检测基因SNP是一种值得推广的简便易行、低成本、常规化的基因分型方法．     

基于定量聚合酶链式反应技术的多囊卵巢综合征与促卵泡激素的受体基因多态性的相关性研究

目的  多囊卵巢是造成不孕和子宫内膜癌等疾病的重要因素之一,该研究目的是探索多囊卵巢与相关单核苷酸的多态性位点相关性。方法  该研究首先提出了一种改良的等位特异的定量聚合酶链式反应技术并对其进行了可靠性评估,随后对多囊卵巢患者和对照样本进行了卵泡刺激素受体基因两个单核苷酸的多态性位点进行了分型鉴定。结果  该研究结果显示其提出的改良的定量聚合酶链式反应方法进行单核苷酸的多态性位点分型准确度高,区分度好,与Sanger测序法获得的结果完全一致,能够很好的用于单核苷酸的多态性等多态性位点的分型鉴定;该实验对152例多囊卵巢患者和152例对照样本中卵泡刺激素受体基因两个单核苷酸的多态性位点分型检测结果显示Thr307Ala和Asn680Ser两个位点的等位基因频率和基因型频率均呈现了与多囊卵巢之间的显著相关性。结论  该研究结果表明卵泡刺激素受体基因的两个单核苷酸的多态性位点可能与多囊卵巢的发病密切相关,为深入探讨该疾病和进一步研究单核苷酸的多态性分型奠定了基础。

     

鲑鱼精DNA提高人工突变质粒模板中单核苷酸多态性位点识别的特异性及其应用

目的探讨等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）检测单核苷酸多态性（SNP）的方法,研究鲑鱼精DNA对优化等位基因特异性引物的作用。方法对鲑鱼精DNA设一系列浓度梯度,分别进行AS-PCR后观察电泳结果。结果鲑鱼精DNA能显著提高识别基因SNP位点的特异性,在25μl的质粒检测系统中加入50 ng的鲑鱼精DNA结果最佳。结论鲑鱼精DNA加入到质粒检测系统中可有效测试所设计的检测引物的特异性,达到模拟基因组DNA的目的 。     

等位基因特异性PCR检测脂联素基因SNP位点方法的建立

目的:建立等位基因特异性PCR检测脂联素基因与2型糖尿病相关SNP位点的方法.方法:针对脂联素基因G531A,G545C,G11963T,T12194G和T13320C 5个SNP位点设计野生型和突变型特异性引物,第一轮PCR的上游引物或下游引物与等位基因特异性引物进行半巢式PCR.在同一SNP位点如果野生型引物出现扩...     

小鼠冷冻胚胎和精子SNP遗传鉴定方法的建立

【摘要】目的 建立小鼠冷冻胚胎和精子SNP(Single-Nucleotide Polymorphism)分型方法,用于冷冻胚胎和精子快速遗传鉴定方案。方法 本研究以中科院上海实验动物中心（国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心）提供的小鼠冷冻胚胎和精子为样本,采用全基因组扩增技术和PCR-LDR分型技术建立小鼠冷冻物SNP遗传鉴定方法。结果 全基因组扩增技术能大幅度增加冷冻胚胎样本的DNA总量;PCR-LDR分型方法适用于小鼠全基因组45个SNPs的分型;分型确定C57BL/6, BALB/c, FVB/NJ 等胚胎和精子各10种近交系,SNP位点信息与测序结果一致;小鼠冷冻胚胎个数与SNPs检出个数成正比,当胚胎数达到12以上时SNP检出率100%。结论 实现近交系小鼠冷冻胚胎和精子快速SNP基因分型,及遗传质量鉴定。     

AS-PCR方法检测中国人群CYP2C19基因多态性

目的:建立一种快速、灵敏的细胞色素氧化酶P4502C19基因多态性检测方法。方法:分离外周血淋巴细胞基因组DNA,分别用一对等位基因特异性(allele-specific,AS)的反向引物与共用正向引物进行PCR扩增,通过电泳分析对应的PCR产物来判断CYP2C19基因型。在AS引物3′端倒数第三位或第二位引入错配碱基改进特异性。采用优化后方法对278例健康人进行CYP2C19基因型分析。结果:AS-PCR可检测CYP2C19基因多态性,引入第二个错配碱基可提高检测特异性。经直接测序验证结果完全一致。结论:建立和优化的AS-PCR方法适用于CYP2C19基因多态性快速检测。     

COL3A1基因多态性与国内散发颅内动脉瘤病人的相关关系

目的通过对颅内动脉瘤病人和对照组的比较研究,探讨Ⅲ型胶原蛋白基因α1(COL3A1基因)与颅内动脉瘤之间的相关关系。方法抽取病例组和对照组的外周血,并提取基因组DNA,选择目的基因片断,设计聚合酶链反应(PCR)所需引物并合成,应用PCR反应扩增感兴趣的目的片断,经琼脂糖电泳验证后进行测序反应,比较病例组和对照组之间COL3A1基因多态性出现频率的差异。结果通过统计分析发现,2组研究对象的COL3A1基因功能性SNP-rs1800255基因型之间,差异具有统计学意义(χ2=4.94,P<0.05)。结论COL3A1基因的功能性SNP-rs1800255与国内散发颅内动脉瘤病人之间存在明显相关,COL3A1基因是国内散发颅内动脉瘤病人的易感基因之一。     

两种全基因组扩增技术对单根毛发DNA检验效能的研究

目的研究简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide-primed PCR,DOP-PCR)和扩增前引物延伸PCR(primer extension pre-amplification PCR,PEP-PCR)对单根毛发检验的法医学价值。方法以三种方法对单根毛发样本进行STR分型,第一种方法直接对提取DNA用Profiler Plus试剂盒进行STR分型,第二种和第三种方法是先对提取的DNA样本分别进行DOP-PCR和PEP-PCR扩增处理,然后对其产物用Profiler Plus试剂盒进行STR分型,对两种方法的效能进行比较评价。结果 DOP-PCR和PEP-PCR技术增加了单根毛发STR分型的准确率和信息量。结论 DOP-PCR和PEP-PCR技术对单根自然脱落毛发的检验具有实用价值。     

基于AllgloTM探针检测IL-1单核苷酸多态性检测方法的建立

目的：探讨AllgloTM探针检测IL-1单核苷酸多态性的实用性。方法：采用AllgloTM 探针实时荧光PCR对IL-1β基因SNP进行基因分型。设计其3954C＆gt;T位点AllgloTM探针序列和PCR扩增引物,按照PCR产物特异性和扩增效率,对退火温度、引物浓度等条件进行优化。结果：结果显示AllgloTM探针实时荧光PCR检测体系最适引物浓度为0.4μM,退化温度为58.9℃两步法PCR。在同一条件体系下,检测100例健康体检者IL-1β基因3954C＆gt;T位点,并进行基因分型,测序验证其分型结果。结论：AllgloTM探针实时荧光PCR检测IL-1β基因SNP是一种值得推广的高通量、低成本、常规化的基因分型方法。