和厚朴酚通过mTOR信号通路诱导肺癌A549细胞自噬

目的:探讨和厚朴酚(honokiol)对人肺腺癌A549细胞自噬的诱导作用及可能的作用机制。方法:体外培养A549细胞,加入不同浓度(0、10、20、40、60和80μmol/L)的honokiol处理48 h,MTT法检测honokiol对细胞活力的影响;吖啶橙染色观察细胞酸性自噬泡情况;Western blot法检测honokiol及联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用后对自噬相关蛋白LC3及相关的信号通路mTOR蛋白表达的变化。结果:Honokiol剂量依赖地抑制肺癌A549细胞的活力(P0.05)。Honokiol处理肺癌A549细胞能显著增加细胞内发出亮红色荧光的酸性自噬泡的比例。在40μmol/L的honokiol作用下肺癌A549细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P0.01),3-MA作用则显著降低。Honokiol可显著降低p-mTOR蛋白表达水平(P0.01),而联合3-MA作用后则使p-mTOR蛋白水平显著升高(P0.01),mTOR总蛋白表达水平均无显著变化。结论:Honokiol可诱导肺癌A549细胞自噬,其机制可能与抑制mTOR信号通路相关。     

连接子蛋白43(Cx43)抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞自噬

目的 探讨连接子蛋白43(Cx43)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)自噬中的作用。方法 采用α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光细胞化学染色鉴定原代VSMC, ox-LDL处理后,采用油红O染色鉴定泡沫细胞;Western blot法检测(0、 40、 80、 160)μg/mL ox-LDL处理0、 6、 12、 24 h, VSMC中微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白的表达以及80μg/mLox-LDL干预24 h,Cx43蛋白的表达;将VSMC随机分为对照组、ox-LDL组和ox-LDL联合Cx43特异性阻断剂Gap26组,Western blot法检测各组细胞LC3、beclin 1的表达。结果 分离的细胞α-SMA阳性率达95%以上,与对照组相比,ox-LDL处理的细胞油红O阳性细胞明显增加,ox-LDL呈浓度依赖及时间依赖地降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值及beclin 1蛋白表达,Cx43蛋白的表达明显升高;给予Gap26后,可上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值及beclin 1蛋白表达。结论 Cx43抑制ox-LDL引起的自噬。     

阿霉素诱导下多发性骨髓瘤细胞中自噬和氧化应激的相互作用

 目的: 探讨阿霉素(doxorubicin,DOX)诱导对多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226细胞内自噬和活性氧簇(reactive oxidative species,ROS)生成的影响及其相互作用关系。方法: 不同浓度阿霉素诱导RPMI-8226细胞24 h,采用Western blot技术检测细胞内beclin 1、LC3等自噬相关蛋白的表达水平。采用DCFH-DA荧光染色法检测RPMI-8226细胞内ROS的水平,荧光显微镜采集图像。采用氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)及tempol处理RPMI-8226细胞后,通过Western blot技术检测阿霉素诱导下细胞内beclin 1、LC3等蛋白的表达水平。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理PRMI-8226细胞后,检测阿霉素诱导下细胞内ROS和凋亡的表达水平。结果: RPMI-8226细胞内beclin 1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平呈阿霉素剂量依赖性增加,当阿霉素诱导浓度达2 mg/L时,与对照组比较显著增加(P<0.05)。采用2 mg/L阿霉素处理RPMI-8226细胞,通过荧光显微镜观察,ROS水平较对照组明显增加。氧自由基清除剂NAC和tempol处理RPMI-8226细胞后,beclin 1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平较阿霉素处理组下降。采用自噬抑制剂3-MA处理细胞后,RPMI-8226细胞内ROS和凋亡的水平较阿霉素处理组及对照组增加。结论: 阿霉素能增加RPMI-8226细胞内自噬和ROS的生成,抑制自噬能增加阿霉素诱导下ROS和凋亡的水平,抑制ROS后能减少阿霉素诱导下多发性骨髓瘤细胞中的自噬。     

AZD8055对胆管癌细胞自噬和凋亡的影响

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)双重抑制剂AZD8055对人胆管癌HuCCT1细胞自噬和凋亡的影响。方法:采用MTT法检测不同浓度的AZD8055对HuCCT1细胞活力的抑制作用;吖啶橙染色检测AZD8055处理胆管癌细胞后,细胞自噬小体形成情况;Western blot法观察细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3以及自噬相关标志蛋白beclin 1、LC3和p62的表达;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果:AZD8055显著抑制胆管癌细胞的活力(P0.05)。吖啶橙染色后,AZD8055用药组橙红色颗粒增多。Western blot实验显示,AZD8055处理后,与对照组相比自噬标志蛋白beclin 1表达上调,LC3-II/LC3-I比例上调,p62表达下调;cleaved caspase-3表达降低,促凋亡蛋白Bax表达降低,抑凋亡蛋白Bcl-2表达升高(P0.05)。流式细胞术显示,AZD8055可抑制细胞凋亡。结论:AZD8055可抑制胆管癌细胞的生长,其机制可能与诱导细胞自噬相关。     

自噬在晚期糖基化终产物诱导的内皮细胞凋亡中的作用

目的: 研究晚期糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬水平的影响并探讨自噬在AGEs诱导的内皮细胞凋亡中的作用。方法: 用AGEs处理HUVECs,相同条件牛血清白蛋白处理为对照组,Western blotting检测相应蛋白表达的变化,电镜观察细胞自噬体的出现,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT比色法测定细胞活性。结果: AGEs处理HUVECs后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达显著上调并呈时间和浓度依赖性,电镜观察到细胞胞浆内自噬体数量增加;与对照组比较,AGEs处理组内皮细胞凋亡率增加,活性下降,自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤预处理的AGEs组细胞活性较AGEs组进一步下降,凋亡率继续增加。AGEs处理HUVECs后,蛋白激酶B(Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平也明显下调, Akt激活剂胰岛素样生长因子1预处理后,Akt的磷酸化水平增加,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的增高表达被抑制。结论: AGEs通过PI3K/Akt/mTOR介导的信号通路诱导HUVECs自噬水平升高。自噬在AGEs诱导的内皮细胞凋亡中对细胞起保护作用。     

同型半胱氨酸通过激活beclin 1调节的自噬激活分子(AMBRA1)促进人肝细胞自噬

目的 探讨beclin 1调节的自噬激活分子(AMBRA1)在同型半胱氨酸(Hcy)引起肝细胞自噬中的作用。方法 体外培养肝细胞,分为对照组(0μmol/L Hcy处理)和100μmol/L Hcy处理组。Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3B(LC3BⅡ、 LC3BⅠ)的表达水平;使用(0、 25、 50、 100)μmol/L氯喹(CQ)处理肝细胞,CCK-8法检测CQ对肝细胞增殖的抑制作用,Western blot法检测LC3B和AMBRA1的表达;采用AMBRA1小干扰RNA感染肝细胞后,实时荧光定量PCR和Western blot法检测肝细胞AMBRA1表达干扰效率。敲低AMBRA1后肝细胞用Hcy处理,Western blot法检测LC3B蛋白表达水平,转染表达双荧光蛋白和LC3的腺病毒(mRFP-GFP-LC3),激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬流的变化。结果 与对照组相比较,Hcy处理组LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值升高;50μmol/L CQ对肝细胞增殖的抑制率接近于50%;与对照组相比,Hcy组LC3BⅡ/LC3BⅠ比值、 AMBRA1的表达明...     

Rip2诱导人胰腺癌细胞自噬及其机制研究

目的:研究受体相互作用蛋白2(Rip2)是否诱导人胰腺癌细胞株Panc-1发生自噬及其作用机制。方法:用jet PRIME转染试剂将空质粒pEGFP-C2和重组质粒pEGFP-Rip2分别转染入Panc-1细胞,不做处理的细胞为对照组。转染后培养细胞48 h,采用Western blot检测Rip2、自噬相关蛋白[beclin-1和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)]及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白的表达;透射电子显微镜观察自噬体的数量。结果:转染pEGFP-Rip2的细胞Rip2蛋白表达显著增加。与对照组和pEGFP-C2组相比,pEGFP-Rip2组细胞的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(均P0.01);在透射电子显微镜下观察发现,pEGFP-Rip2组细胞内自噬体的数量明显多于对照组和pEGFP-C2组。pEGFP-Rip2组细胞的p-Akt和p-mTOR蛋白水平明显低于对照组和pEGFP-C2组(均P0.01),而总Akt和mTOR的蛋白水平变化不明显。结论:过表达Rip2可诱导Panc-1细胞发生自噬,其作用机制可能与Rip2抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化有关。     

UCP2通过调控mTOR对LPS诱导的HK2细胞自噬产生影响

目的探讨线粒体解耦联蛋白2(uncouplingprotein2,UCP2)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肾小管上皮细胞(HK2细胞)自噬中的作用机制。方法以HK2细胞为研究对象,采用不同质量浓度LPS(0,0.1,0.5,1,5μg/ml)干预不同时间(0,12,24,48 h),Western blot检测HK2细胞UCP2蛋白水平变化。并将HK2细胞分为4组:正常对照组,LPS组(LPS induced),UCP2shRNA组(UCP2 shRNA+LPS)和UCP2 scramble组(UCP2 scramble+LPS),LPS为1μg/ml,24 h。利用Real-time PCR和Western blot检测HK2细胞UCP2 mRNA和蛋白表达水平,免疫荧光检测线粒体动力相关蛋白1(Drp1)表达变化,Western blot检测线粒体融合蛋白2(Mfn2)、Drp1,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B,凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved-Caspase-3以及mTOR的蛋白表达水平。结果 Western blot结果显示,1μg/ml LPS处理的HK2细胞,在12 h和24 h UCP2蛋白的水平较对照组明显增加(P0.05);0.1,0.5和1μg/ml的LPS刺激24 h,UCP2水平与对照组相比逐渐增加。使用1μg/ml的LPS刺激24 h,免疫荧光和Western blot发现,UCP2, Drp1较对照组明显增加,Mfn2表达减少(P0.05),而转染UCP2 shRNA后,可显著抑制UCP2, Drp1水平的增加以及Mfn2水平的降低(P0.05)。同时,Western blot发现LPS组自噬相关蛋白Beclin-1,LC3B,促凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3明显增加(P0.05),抗凋亡相关蛋白Bcl-2水平降低(P0.05),而转染UCP2 shRNA后,Beclin-1,LC3B,Bcl-2表达水平降低,Cleaved-Caspase-3水平进一步增加(P0.05)。Western blot结果显示转染UCP2 shRNA组p-mTOR水平较正常组和LPS组明显增加(P0.05);而mTOR蛋白水平各组间无统计学差异(P0.05)。结论 UCP2在LPS诱导的HK2细胞损伤中通过自噬发挥保护作用。     

NOD8抑制人胰腺癌细胞自噬及凋亡对其自噬作用的影响

目的:探讨NOD8(也称NLRP10或PYNOD)是否能抑制胰腺癌细胞发生自噬及其可能机制,并研究凋亡对NOD8调控自噬的影响。方法:用JetPRIME阳离子聚合物将空质粒pEGFP-C2和重组质粒pEGFP-NOD8分别转染入胰腺癌Panc-1细胞,并设立空白对照组,48 h后应用Western blot检测NOD8蛋白、自噬相关蛋白(beclin-1和LC3-Ⅱ)以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白(Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR)的表达;并采用免疫荧光染色法观察细胞LC3斑点的数量。此外,用caspase抑制剂Z-VAD-FMK作用于过表达NOD8的Panc-1细胞后,Western blot检测beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平;免疫荧光染色法观察细胞LC3斑点数量。结果:pEGFP-NOD8组细胞NOD8蛋白表达明显高于对照组和pEGFP-C2组(P0.01)。与对照组和pEGFP-C2组相比,pEGFP-NOD8组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达及细胞LC3斑点数量显著降低;并且pEGFP-NOD8组细胞p-Akt及p-mTOR蛋白表达量显著上升(P0.01),而AKT和mTOR蛋白表达无明显差异。与pEGFP-NOD8组相比,pEGFP-NOD8+Z-VAD-FMK组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平及LC3斑点数量显著高于pEGFP-NOD8组。结论:NOD8可抑制Panc-1细胞自噬,其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR通路有关;凋亡可增强NOD8对自噬的抑制作用。     

雷帕霉素激活自噬改善嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤

目的:通过观察雷帕霉素对PAN 诱导的足细胞损伤及自噬相关蛋白表达的影响,探讨自噬在雷帕霉素保护PAN 诱导的足细胞损伤中的作用及可能机制。方法:构建PAN 诱导的足细胞损伤模型,将足细胞分成对照组(Control 组),PAN 组(加入50 μg/ ml PAN),雷帕霉素组(RAP 组:分别加入100、200、300 ng/ ml 雷帕霉素),PAN+雷帕霉素组(PAN+RAP组:细胞在用含PAN 的培养液培养前1 h,分别用100、200、300 ng/ ml 雷帕霉素进行预处理1 h)。采用Annexin V/ PI 双染法检测细胞凋亡,透射电镜观察自噬小体,Western blot 检测LC3、p62、4EBP1、P70S6K、mTOR 蛋白表达。结果:与对照组比较,PAN组足细胞凋亡增加,自噬体减少,LC3域蛋白表达下调,p62 上调,mTOR、4EBP1、P70S6K 磷酸化水平上调;与PAN 组比较,PAN+RAP 组足细胞凋亡率下降,自噬体增加,LC3域蛋白表达上调,p62 下调,mTOR、4EBP1、P70S6K 磷酸化水平下调。结论:PAN 可以抑制足细胞自噬,促进足细胞凋亡;雷帕霉素可通过激活自噬改善PAN 诱导的足细胞损伤,这种作用可能与雷帕霉素抑制mTOR/4EBP1、P70S6K 信号通路有关。     

黄芩素诱导乳腺癌细胞自噬

目的:考察黄芩素诱导乳腺癌细胞的自噬作用,并初步探讨其机制。方法:采用MTT实验考察黄芩素对乳腺癌MCF-7细胞和4T1细胞活力的影响,确定给药剂量。Western blot检测黄芩素(25、50和100μmol/L)及联合自噬抑制剂3-MA作用下,MCF-7细胞和4T1细胞中自噬特征蛋白LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表达水平,流式细胞术Annexin V/PI双染法观察3-MA对黄芩素诱导MCF-7细胞和4T1细胞凋亡的影响,确认黄芩素诱导自噬的作用。通过Western blot考察自噬信号通路相关蛋白p-mTOR、mTOR、p-AKT和AKT的蛋白水平,结合AKT-mTOR激活剂EGF明确AKT-mTOR通路在黄芩素诱导乳腺癌自噬中的作用。结果:50μmol/L及其以上剂量的黄芩素可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞和4T1细胞的活力,其作用具有显著的时效和量效性。Western blot结果表明,50和100μmol/L黄芩素作用下MCF-7细胞和4T1细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例显著增强,3-MA加入后又明显降低。流式细胞术结果显示,相比黄芩素单用组,联合自噬抑制剂可促进MCF-7细胞的坏死和凋亡。通路蛋白研究表明mTOR和AKT总量不变,其活化蛋白水平在黄芩素作用下显著降低,而加入EGF后又再次增加。结论:黄芩素可通过抑制AKT-mTOR通路诱导乳腺癌MCF-7细胞和4T1细胞自噬。     

人乳头瘤病毒16 E5(HPV16 E5)蛋白抑制角质形成细胞生长因子诱导的细胞自噬

目的研究人乳头瘤病毒16 E5(HPV16 E5)蛋白对角质形成细胞生长因子(KGF)诱导的细胞自噬的影响。方法构建HPV16 E5蛋白真核表达载体p CI-neo-E5,采用LipofectamineTM2000转染至Ha Ca T人角质形成细胞,实时定量PCR检测HPV16 E5 mRNA转录水平。转染p CI-neo-E5并以KGF刺激Ha Ca T细胞后,实时定量PCR检测自噬相关蛋白beclin 1、自噬相关基因5(ATG5)、ATG7及LC3B mRNA的水平,Western blot法检测LC3BⅡ蛋白的表达量,免疫荧光技术检测LC3B的分布。结果成功构建HPV16 E5真核表达载体p CI-neo-E5并可有效表达。角质形成细胞转染p CI-neo-E5,自噬相关蛋白mRNA的水平显著降低,抑制KGF诱导的LC3BⅡ表达水平升高和LC3B的聚集。结论 HPV16 E5蛋白通过下调自噬相关蛋白的表达,抑制KGF诱导的细胞自噬。     

细胞自噬在Aβ_(25-35)损伤SH-SY5Y细胞中的作用

目的:探究β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的神经细胞损伤作用是否与调节细胞自噬相关,并基于Akt/mTOR通路对其作用机制进行初步探究。方法:5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L和25μmol/L的Aβ_(25-35)与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞共同孵育24 h,MTT法检测细胞活力,Western blot检测细胞内微管相关蛋白1轻链3-I(LC3-I)、微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白表达情况。选用合适浓度的Aβ_(25-35),观察自噬诱导剂雷帕霉素(Rapa)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)分别与Aβ_(25-35)联用后上述指标的变化。结果:各浓度Aβ_(25-35)均能引起SH-SY5Y细胞损伤,使细胞活力下降。Aβ_(25-35)能够增加自噬标志蛋白LC3-II蛋白表达,提高LC3-II/LC3-I水平,下调Akt和mTOR蛋白磷酸化水平(P0.05)。与自噬诱导剂Rapa联用,细胞活力未见明显变化,而细胞内LC3-II蛋白表达升高,LC3-II/LC3-I明显增加,p-mTOR/mTOR明显降低(P0.05);与自噬抑制剂3-MA联用,LC3-II蛋白表达和LC3-II/LC3-I水平有下降趋势,p-Akt/Akt水平明显下降(P0.05)。结论:Aβ_(25-35)可能通过下调Akt和mTOR蛋白磷酸化水平而诱导SH-SY5Y细胞自噬状态及损伤。     

维生素D抑制细颗粒物(PM2.5)诱导的A549人肺泡上皮细胞自噬及细胞因子释放

目的 探讨维生素D(VD)在细颗粒物(PM_2.5)诱导A549人肺泡上皮细胞发生自噬过程中的作用及对上皮细胞因子产生的影响。方法 燃烧器的乙炔扩散火焰上部采集制备PM_2.5,采用PM_2.5体外处理A549细胞，并给予VD或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理。Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)及beclin-1的表达，实时荧光定量PCR检测A549细胞白细胞介素25(IL-25)、 IL-33及胸腺间质淋巴细胞生成素(TSLP)的mRNA表达，透射电镜观察自噬体的形成。结果 PM_2.5导致A549细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、 beclin-1蛋白表达增加，自噬体形成增多，给予VD处理后，PM_2.5诱导的细胞自噬水平降低；在3-MA抑制A549细胞自噬水平后，PM_2.5仍可诱导细胞自噬，且VD依然可逆转PM_2.5诱导的自噬；PM_2.5通过诱导自噬促进A549细胞分泌...     

shRNA 沉默CCAT2 通过抑制自噬对非小细胞肺癌细胞A549 化疗敏感性的 影响

目的:探究shRNA沉默CCAT2抑制自噬对非小细胞肺癌细胞A549化疗敏感性的影响及机制。方法:细胞分为A549/DDP组、Scramble组、CCAT2 shRNA组,转染相应的shRNA处理细胞,RT-PCR检测CCAT2基因表达水平,CCK8检测A549/DDP的细胞活力,Hoeschst和流式细胞法检测细胞凋亡,Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活性半胱天冬酶3(cl-caspase-3)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表达水平。结果:与A549细胞株相比,A549/DDP细胞株中CCAT2表达水平显著升高。与A549/DDP组相比,CCAT2 shRNA组CCAT2表达水平显著降低,细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高,凋亡相关蛋白Bax、cl-caspase-3蛋白表达水平显著升高,Bcl-2蛋白表达水平显著降低,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平比率显著降低,Beclin1蛋白表达水平降低,p62蛋白表达水平升高。结论:沉默CCAT2可提高非小细胞肺癌细胞A549株化疗敏感性,作用机制可能与抑制自噬作用有关。     

AZD4547促进自噬并促进索拉非尼耐药肝癌细胞的死亡

目的研究成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂AZD4547对索拉非尼耐药肝癌细胞死亡的影响及机制。方法构建Huh7R索拉非尼耐药肝癌细胞株,分为对照组、 12μmol/L索拉非尼处理组、 5μmol/L AZD4547处理组、 12μmol/L索拉非尼联合5μmol/L AZD4547处理组。CCK-8法检测细胞存活率, Western blot法检测FGFR、 Toll样受体4(TLR4)及微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、 beclin 1、 P62的蛋白水平。利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)验证AZD4547联合索拉非尼诱导索拉非尼耐药的肝癌细胞死亡的机制。结果 AZD4547联合索拉非尼显著降低Huh7R耐药肝癌细胞的存活率; AZD4547抑制FGFR活性,且该药物联合索拉非尼显著增加Huh7R细胞的LC3Ⅱ/Ⅰ、 beclin 1蛋白水平、降低P62蛋白水平,并上调TLR4蛋白表达。3-MA抑制自噬可逆转AZD4547联合索拉非尼对Huh7R细胞的杀伤效应。结论 AZD4547抑制FGFR活性可显著增强索拉非尼耐药肝癌细胞的自噬及免疫应答水平,促进耐药肝癌细胞死亡。     

MEG3和腺苷对HepG2细胞自噬和增殖的影响

目的:研究母系表达基因3(MEG3)过表达和腺苷对人肝细胞癌HepG2细胞自噬和增殖的影响,并探讨MEG3和腺苷影响HepG2细胞自噬的可能机制和抑制细胞增殖的效果。方法:常规培养HepG2细胞,分为对照组、MEG3组(MEG3慢病毒转染)、腺苷组(1 mmol/L腺苷处理)和MEG3+腺苷组(腺苷组中加入MEG3慢病毒转染)。Western blot检测LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等蛋白的表达,MDC染色观察自噬体数量,CCK-8法观察细胞的活力,细胞计数仪检测活细胞数量。结果:与对照组比较,MEG3组和腺苷组中HepG2细胞内LC3-Ⅱ减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,mTOR表达增加,HepG2细胞的活力降低(P0.05),自噬体减少。与MEG3组和腺苷组比较,MEG3+腺苷组中HepG2细胞内LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值进一步降低,mTOR表达进一步增加,HepG2细胞的活力进一步降低,自噬体减少更加显著(P0.05或P0.01)。MEG3组和腺苷组中HepG2活细胞数在24～72 h较对照组均明显降低(P0.01),在MEG3+腺苷组中降低更为明显(P0.01)。结论:MEG3过表达和低浓度腺苷可激活mTOR通路,抑制HepG2细胞自噬和增殖。MEG3增强了腺苷对HepG2细胞的作用。     

胃饥饿素在脂多糖诱导的胎盘滋养细胞自噬中的作用

目的 探讨胃饥饿素（Ghrelin）对脂多糖诱导的胎盘滋养细胞自噬的影响。方法 构建脂多糖（LPS）诱导的子痫前期（PE）大鼠模型,分为对照组、LPS组和LPS+Ghrelin组,利用透射电镜观察胎盘自噬体和自噬溶酶体的变化。体外培养人胎盘滋养细胞株（HTR-8/SVneo）,分为对照组,LPS组,LPS+Ghrelin低、中、高剂量组,利用透射电镜观察滋养细胞自噬体和自噬溶酶体的变化。利用免疫荧光法检测各组滋养细胞中LC3B的表达,利用Western blot检测各组滋养细胞中LC3B、Beclin1、p-IKKα/β及p-p65蛋白的表达。利用Transwell法观察各组滋养细胞迁移能力的变化。结果 在LPS组中胎盘和滋养细胞的自噬体及自噬溶酶体显著增多,而在LPS+Ghrelin组中显著减少。LPS组的滋养细胞内LC3B荧光强度显著增强,而随着Ghrelin浓度的增加,LC3B荧光强度逐渐减弱。在LPS组中LC3B、Beclin1、p-IKKα/β及p-p65蛋白表达水平升高,而随着Ghrelin浓度增加,LC3B、Beclin1、p-IKKα/β及p-p65蛋白表达水平逐渐降低...     

丹酚酸B 通过mTOR / Ulk1 信号通路诱导胶质瘤细胞C6 自噬性死亡

目的:探究丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)对胶质瘤细胞自噬的作用机制。方法:不同浓度的Sal B 处理细胞,CCK8 检测细胞活性,流式检测细胞凋亡情况,Western blot 检测增殖、凋亡及自噬标记蛋白表达,免疫荧光检测LC3 含量。结果:Sal B 浓度达到100 μmol/ L 时能明显抑制细胞活性,因此,选择10、20、50 μmol/ L 三个剂量进行后续试验;Sal B 能显著促进C6 细胞凋亡和凋亡标记蛋白caspase-3、Bax 的表达,降低Bcl-2 及增殖标记蛋白Ki67 的表达水平,并具有量效关系;同时,Sal B 能显著促进自噬标记蛋白(Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1)的表达,升高LC3Ⅱ/ Ⅰ的比值,促进LC3 荧光斑点的形成并降低p62 的表达水平;此外,Sal B 可明显抑制mTOR/ Ulk1 通路蛋白mTOR 的表达,促进Ulk1 的表达。结论:Sal B 可通过mTOR/ Ulk1 信号通路诱导胶质瘤细胞自噬性死亡。     

肝素结合血凝素通过抑制A549细胞的自噬作用增强耻垢分枝杆菌的感染能力

目的将肝素结合血凝素(HBHA)重组表达于耻垢分枝杆菌(MS),鉴定其对A549细胞自噬作用的影响。方法将HBHA克隆于穿梭表达质粒pMV261,构建HBHA重组载体,电转化至MS;感染A549细胞,Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,并检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化可估计自噬的水平;利用单丹磺酰尸胺(MDC)将自噬体染色后,激光共聚焦观察细胞内自噬体变化的情况;通过MS、rMS-HBHA感染A549细胞18 h,计算胞内活菌数,鉴定感染状况。结果 rMS-HBHA经42℃热诱导成功表达HBHA蛋白;相对野生型MS,重组表达HBHA蛋白的MS(rMS-HBHA)可以显著抑制A549细胞中的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表达,rMS-HBHA组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值为0.625显著低于MS组2.025,表明rMS-HBHA组自噬体形成受到抑制;并且rMS-HBHA感染A549细胞18 h后胞内活菌为6.3×106,明显高于MS组1×105。结论外源性HBHA可以通过抑制A549细胞的自噬作用增强MS的感染能力。