肺腺癌细胞源性外泌体活化的人THP-1巨噬细胞促进肺癌细胞的侵袭

目的研究肺腺癌细胞来源的外泌体对巨噬细胞极化的作用及受外泌体作用后的巨噬细胞对肺癌细胞生物学行为的影响。方法提取A549和H1299肺腺癌细胞外泌体, Western blot法检测其表面标志物CD9、 CD63进行鉴定。100 ng/mL佛波酯(PMA)处理人THP-1细胞48 h,实时定量PCR检测细胞CD68的mRNA水平。200μg/mL外泌体处理贴壁巨噬细胞24 h后,实时定量PCR检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、 CD163的mRNA水平, IMMULITE 1000化学发光免疫分析仪检测白细胞介素6(IL-6)、 IL-8、 IL-10的蛋白水平;将外泌体处理后的巨噬细胞分别与A549细胞和H1299细胞共培养,通过Transwell~(TM)实验检测肺腺癌细胞侵袭能力,实时定量PCR检测基质金属蛋白酶2(MMP2)、 MMP9的mRNA水平。结果 CD9、 CD63在外泌体高表达, PMA诱导后的巨噬细胞高表达CD68,外泌体处理后的巨噬细胞iNOS表达降低, CD163、 TNF-α、 IL-6、 IL-8、 IL-10表达水平均增加;外泌体处理后的巨噬细胞与肺腺癌细胞共培养,可增强肺腺癌细胞的侵袭能力并促进MMP2、 MMP9的表达。结论肺腺癌细胞来源的外泌体可以诱导巨噬细胞极化,表现为M1/M2的混合表型,进而增强肺癌细胞的自身侵袭能力。     

白细胞介素-34/集落刺激因子-1R在转化生长因子-β1诱导A549细胞上皮-间质转化中的表达

目的探讨白细胞介素-34/集落刺激因子-1受体(IL-34/CSF-1R)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导A549细胞发生上皮-间质转化(EMT)中的表达。方法体外培养A549细胞;CCK 8法检测不同浓度TGF-β1在不同时间点对A549细胞增殖的影响;选用5μg/L TGF-β1刺激A549细胞(0、12、24、48h),提取细胞蛋白和RNA,Western blotting法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏连蛋白(E-Cad)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白的变化;Real-time PCR法检测IL-34、CSF-1R、MMP-2、MMP-9基因表达的变化。结果 TGF-β1对A549细胞的增殖无明显影响(P0.05)。TGF-β1刺激A549细胞后,间质细胞标志性蛋白α-SMA表达升高,上皮细胞标志性蛋白E-Cad表达下降,纤维化相关的MMP-2蛋白表达升高,MMP-9蛋白表达先升高后下降,TIMP-1蛋白早期出现短暂性增高后,呈持续降低趋势(P0.01)。IL-34mRNA表达逐渐升高,CSF-1R mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达先升高后下降(P0.01)。结论 TGF-β1诱导A549细胞的EMT过程中,存在IL-34/CSF-1R的动态表达。     

木犀草素逆转由TGF-β1诱导的人肺癌细胞上皮-间充质转化的实验研究

目的:探讨在肺癌A549细胞中木犀草素(luteolin)对转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及细胞侵袭的影响。方法:将不同浓度(5、10、20、40、80和160μmol/L)的luteolin作用于肺癌A549细胞后,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力;TGF-β1诱导肺癌A549细胞建立EMT模型,加入不同浓度luteolin处理;倒置显微镜观察细胞形态的变化;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力的变化; Western blot法检测细胞中EMT标志蛋白上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的蛋白表达情况。结果:Luteolin抑制肺癌A549细胞的生长,并呈一定的时间-剂量依赖关系(P0.05),luteolin作用24 h的IC_(50)为68.79μmol/L,48 h的IC_(50)为47.86μmol/L。TGF-β1诱导的肺癌A549细胞发生EMT。Luteolin显著抑制TGF-β1诱导肺癌A549细胞的侵袭能力(P0.01)。Luteolin能逆转TGF-β1诱导的肺癌A549细胞EMT形态的改变,同时,Western blot法检测也显示luteolin可逆转TGF-β1诱导的肺癌A549细胞EMT标志蛋白E-cadherin表达的下调和vimentin表达的上调(P0.01)。结论:Luteolin逆转TGF-β1诱导肺癌A549细胞的EMT,同时对肺癌细胞的侵袭和转移有一定的抑制作用。     

Akt/GSK-3β/Snail通路在TGF-β_1诱导A549/DDP细胞上皮间质转化中的作用

目的:通过观察转化生长因子β_1(TGF-β_1)诱导前后Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关分子的表达情况,探讨A549/DDP细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的分子机制。方法:TGF-β_1(5μg/L)作用48 h,观察A549/DDP细胞的形态变化,并测定EMT标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏蛋白(N-cadherin)的表达情况,评估TGF-β_1是否成功诱导A549/DDP细胞发生EMT。进一步将A549/DDP细胞分为TGF-β_1(+)组、TGF-β_1(-)组和LY294002组,应用Western blot法检测各组Akt/GSK-3β/Snail通路相关分子Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平。结果:形态学观察可见TGF-β_1(+)组的细胞变得更加狭长,呈纺锤形,细胞间较为疏散,形态与间充质细胞相似。与TGF-β_1(-)组比较,TGF-β_1(+)组E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin蛋白表达上调(P0.05);各组间Akt和GSK-3β的蛋白表达水平并无明显差别,TGF-β_1(+)组的p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail蛋白水平较TGF-β_1(-)组明显增强(P0.05);PI3K抑制剂LY294002与TGF-β_1同时刺激细胞后,p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平较TGF-β_1(+)组下调(P0.05)。结论:TGF-β_1干预Akt/GSK-3β/Snail信号通路,促进Akt和GSK-3β的磷酸化,提高Snail的表达水平,诱导A549/DDP细胞发生EMT。     

肿瘤微环境中Lewis肺腺癌细胞调控巨噬细胞表型转换

目的探究Lewis肺腺癌细胞(LLC)与巨噬细胞之间的细胞通讯及其对巨噬细胞表型转换的可能调控机制。方法正常肺泡上皮细胞(nAECs)与LLCs分别与巨噬细胞在Transwell共培养,脂多糖LPS刺激下室巨噬细胞。免疫荧光检测两组巨噬细胞表型转化情况;ELISA检测上清液中炎性因子IL-1β、TGF-α、IL-10和TGF-β表达;电镜与Western blot鉴定外泌体;PKH26染色检测巨噬细胞吞噬外泌体情况;RT-qPCR检测microRNA表达差异;siRNA-550a、siRNA-182转染LLCs,ELISA试剂盒检测巨噬细胞炎性因子表达情况。结果对照组巨噬细胞多为M1型,癌细胞刺激组巨噬细胞转化为M2型(P0.05);LLCs刺激组促炎因子与nAECs相比, IL-1β与TGF-α高表达, LI-10与TGF-β低表达(P0.05);电镜、PKH26染色等证明巨噬细胞可主动吞噬nAECs和LLCs外泌体; LLCs外泌体中的miR-550a和miR-182含量高于nAECs外泌体(P0.05)。LLCs转染siRNA-550a后,外泌体刺激巨噬细胞分泌的IL-1β与TGF-α明显高于siRNA-182转染,而IL-10与TGF-β则更低(P0.05)。结论 LLC可通过分泌外泌体将肿瘤微环境中巨噬细胞表型转化为癌支持性细胞,其机制可能是外泌体中miR-550a可调控巨噬细胞转型。     

Caveolin-1在TGF-β1诱导人支气管上皮细胞间质化中的作用

目的:探究小窝蛋白1(caveolin-1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人支气管上皮细胞(16HBE细胞)上皮-间充质转化(EMT)中的作用。方法:以16HBE细胞株为研究对象,免疫荧光、RT-q PCR和Western blot实验检测16HBE细胞EMT过程中caveolin-1的mRNA和蛋白表达;Western blot检测siRNA干扰caveolin-1对16HBE细胞EMT的影响。结果:Caveolin-1广泛存在于16HBE细胞膜上,TGF-β1刺激后,caveolin-1的mRNA和蛋白表达减少(P0.05)。与TGF-β1组比较,caveolin-1 siRNA和TGF-β1共同作用促进了细胞形态的转化,抑制了E-钙黏蛋白的蛋白表达而促进了α-SMA的蛋白表达(P0.05)。TGF-β1刺激16HBE细胞后,AKT和Smad3在30 min磷酸化水平最高,与0 min对照组比较显著增加(P0.05);用siRNA干扰caveolin-1基因后再用TGF-β1刺激16HBE细胞30 min,下游信号蛋白分子AKT和Smad3的磷酸化水平增高,与TGF-β1组比较显著增加(P0.05)。结论:TGF-β1能下调16HBE细胞的caveolin-1表达水平;caveolin-1可能参与了TGF-β1诱导的16HBE细胞EMT过程中TGF-β1/Smad通路和PI3K-AKT通路的活化。     

肾上腺髓质素通过Smad2/3信号途径抑制TGF-β1刺激的肺成纤维细胞前胶原蛋白的合成

目的观察肾上腺髓质素(AM)对转化生长因子β1(TGF-β1)促进肺成纤维细胞1型前胶原蛋白α1(Col1α1)、3型前胶原蛋白α1(Col3α1)基因表达及Smad2/3通路的影响,探讨AM对TGF-β1促肺成纤维细胞胶原合成作用的机制。方法体外原代培养人胚肺成纤维细胞(HFLF),利用反转录PCR(RT-PCR)观察AM及TGF-β1对HFLF的Col1α1、Col3α1 mRNA表达的影响;Western blot法观察AM及TGF-β1对HFLF磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)蛋白表达的影响。结果 TGF-β1可以刺激HFLF的Col1α1、Col3α1 mRNA和p-Smad2/3蛋白表达,AM则可抑制基础条件下TGF-β1促进的Col3α1 mRNA表达,同时也抑制Smad2/3蛋白的表达。结论 AM可能通过Smad2/3信号转导途径,抑制TGF-β1促进的HFLF前胶原蛋白的合成作用。     

小檗碱对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化及TGF-β/Smad通路的影响

目的研究小檗碱(BBr)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化(EMT)及TGF-β/Smad通路的影响。方法常规培养肾小管上皮细胞、传代、分组:1正常对照组;2TGF-β1组(10ng/ml TGF-β1作用48h);3小檗碱作用组(30μM小檗碱作用24h后加10ng/ml TGF-β1作用48h)。采用相差显微镜观察各组细胞表型改变,免疫荧光及Western Blot方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)、Smad2、Smad3、磷酸化的Smad2、3(P-Smad2、3)蛋白表达;应用流式细胞术,采用活性氧自由基(ROS)检测试剂盒检测各组别的ROS蛋白表达情况。结果 TGF-β1处理可导致NRK-52E细胞的α-SMA蛋白表达明显升高,E-cadherin蛋白表达降低。而小檗碱处理能够减少肾小管上皮细胞α-SMA的高表达,提高E-cadherin蛋白的表达;同时,小檗碱可有效降低由TGF-β1引起的NRK-52E细胞中ROS的过多产生。此外,小檗碱可有效抑制Smad2/3的活化。结论小檗碱可逆转TGF-β1所致的肾小管上皮细胞的EMT,其作用机制可能是通过抑制氧化应激及TGF-β/Smad信号通路而发挥作用。     

SIGIRR过表达抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞NF-κB的活化

目的: 研究单免疫球蛋白白介素1受体相关蛋白(SIGIRR)对脂多糖(LPS)刺激的肺泡上皮细胞核因子-κB信号通路的调节作用。方法: 以LPS刺激人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549。将含有SIGIRR cDNA 全长的真核表达载体瞬时转染A549细胞,使SIGIRR在A549细胞过表达。用双萤光素酶报告系统检测LPS刺激后A549细胞NF-κB的转录活性,用ELISA法检测LPS刺激后细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)的水平,对比转染与否对上述因子在A549细胞中释放水平的影响。结果: 在A549细胞中,过表达SIGIRR可显著抑制NF-κB的转录活性,同时抑制LPS诱导的细胞因子IL-1β、TNF-α以及IL-6的表达。 结论: SIGIRR过表达可以抑制LPS触发的肺泡上皮细胞中TLR4信号的转导,从而发挥减轻炎症反应、保护肺泡上皮细胞的作用。     

肝癌细胞自分泌外泌体通过TGF-β1调控自身细胞学行为北大核心CSCD

目的:研究肝癌Huh7细胞外泌体促进自身转移的机制。方法:培养肝癌Huh7细胞,分离提取外泌体并进行鉴定。将分离的外泌体与Huh7细胞共培养,Transwell比较细胞迁移和侵袭能力;检测外泌体中TGF-β1水平;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TGF-β1、SMAD2/3、EMT相关分子表达。结果:提取的外泌体经Western blot检出CD63、TSG101条带;透射电镜检测出双侧膜结构小体;纳米粒径分析显示颗粒大小集中在100 nm左右。外泌体中检出TGF-β1。外泌体与Huh7细胞共培养,免疫荧光显示外泌体成功进入Huh7细胞。与对照组相比,共培养组细胞迁移和侵袭大幅增加,TGF-β/Smad通路相关分子活化,上皮标志物E-钙黏蛋白、p-Smad7表达下降,间充质标志物-波形蛋白表达升高。结论:肝癌Huh7细胞自分泌的外泌体通过运输TGF-β1上调TGF/Smad通路进而影响肝癌转移,探明了肝癌发展机制,为肝细胞癌治疗提供了新思路。     

天龙咳喘灵提取物抑制A549细胞上皮-间质转化中的微RNA表达变化

目的探讨天龙咳喘灵提取物抑制转化生长因子B1（TGF-β1）诱导A549细胞上皮-间质转化（EMT）过程中微RNA（miRNA）的表达变化。方法体外培养A549细胞,TGF—β1刺激A549细胞60min后加入天龙咳喘灵提取物,应用相差显微镜观察A549细胞形态学变化。反转录-PCR、免疫印迹法检测a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）mRNA和蛋白表达。miRNA芯片检测A549细胞EMT前后miRNA表达的变化。结果细胞形态学观察、反转录-PCR及免疫印迹检测均显示,5μg/LTGF-β1可以诱导A549细胞EMT且可以被50mg／L天龙咳喘灵提取物抑制或逆转。miRNA芯片检测显示,与未处理的A549细胞比较,A549细胞EMT后有41种miRNA表达出现显著改变,其中26种表达上调2倍以上,15种表达下调2倍以上;与未处理的A549细胞比较,50mg／L天龙咳喘灵提取物抑制TGF—β1诱导A549细胞EMT后有46种miRNA的表达出现显著变化,其中25种表达上调2倍以上,21种表达下调2倍以上;与TGF-β1诱导A549细胞EMT比较,50mg／L天龙咳喘灵提取物抑制A549细胞EMT时有17种miRNA差异表达,其中13种表达下调2倍以上,4种表达上调2倍以上。结论天龙咳喘灵提取物可以抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT,并参与调控miRNA的差异表达,可能有助于阻止慢性肺部纤维化疾病的进展。     

Napsin A基因转染干预A549细胞的上皮-间质转化

目的 探讨Napsin A基因转染至A549细胞对其上皮-间质转化(EMT)的作用和机制.方法 采用慢病毒载体质粒PLJM1构建重组质粒PLJM1-Napsin A,将Napsin A基因转染至A549细胞染色体中并鉴定.用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激A549细胞构建体外EMT模型,倒置显微镜下动态观察细胞形...     

PI3K/CTGF信号通路在TGF-β1诱导A549细胞表达collagen Ⅰ过程中的作用

目的:研究磷脂酰肌醇3-激酶/结缔组织生长因子(PI3K/CTGF)信号通路在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺腺癌A549细胞表达I型胶原蛋白(collagen I)过程中的分子机制。方法:体外培养A549细胞,予TGF-β1刺激,观察CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表达及PI3K信号通路的活化;PI3K抑制剂LY294002预先处理A549细胞后,观察TGF-β1刺激下CTGF和collagen I mRNA和蛋白表达的变化;CTGF特异性si RNA干扰A549细胞中CTGF的表达后,观察TGF-β1刺激下collagen I mRNA和蛋白表达的变化和PI3K信号通路的活化。结果:TGF-β1可以诱导A549细胞中CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表达以及PI3K信号通路的活化;PI3K特异性抑制剂LY294002可以部分逆转TGF-β1诱导的A549细胞中CTGF和Collagen I mRNA和蛋白表达的升高。干扰CTGF可以降低TGF-β1诱导的A549细胞collagen I mRNA和蛋白表达,而不影响PI3K信号通路的活化。结论:CTGF是TGF-β1/PI3K信号通路调控的即刻早期反应效应蛋白,参与了TGF-β1诱导的A549细胞中collagen I表达。     

丹酚酸B对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响

目的:研究丹酚酸对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响及其机制。方法:培养人肾小球系膜细胞(HGMCs),随机分为正常对照组、高糖组及高糖+丹酚酸B高、中、低剂量组,高糖组和丹酚酸B各组用含高浓度(33.3 mmol/L)葡萄糖的培养基培养72 h,丹酚酸B各组同时加人相应浓度丹酚酸B共同孵育。Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平,ELISA法检测细胞Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)的分泌水平,Western blot法检测转化生长因子β1(TGF-β1)的表达及Smad2和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化水平。结果:高糖孵育72 h后,肾小球系膜细胞α-SMA的蛋白表达水平明显升高,ColⅠ、ColⅢ、FN及LN蛋白的分泌水平显著增加(P 0.01),TGF-β1的表达及Smad2、p38 MAPK的磷酸化水平也明显升高(P 0.01);与丹酚酸B共同孵育可明显降低α-SMA蛋白的表达水平,ColⅠ、ColⅢ、FN和LN的分泌明显减少,TGF-β1的表达及Smad2、p38 MAPK的磷酸化水平显著下降(P 0.01或P 0.05)。结论:丹酚酸B可明显抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化,减少ColⅠ和ColⅢ等细胞外基质分泌,其机制与抑制TGF-β1/Smad信号通路及p38 MAPK活化有关。     

Apelin抑制TGF-β诱导的人肾小管上皮-间充质细胞转换

目的探讨多肽Apelin对转化生长因子β(TGF-β)诱导的人肾小管上皮-间充质细胞转换(EMT)的抑制作用及其机制。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞,分别给予含TGF-β1(2μg/L)和/或不同浓度Apelin-13的培养基孵育细胞48 h,设立6个实验组(每组n=5):对照组、TGF-β组、TGF-β+Apelin(10-8,10-7和10-6mol/L)组和Apelin(10-6mol/L)组。刺激结束后,用免疫荧光染色观察细胞的上皮标志物E-钙黏素(E-cadherin)、间充质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的分布和表达。Western blot检测细胞中E-cadherin、α-SMA及Smads信号通路的主要信号分子p-Smad2/3、Smad2/3和Smad-7的蛋白表达。RT-PCR法检测细胞外基质纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)及细胞自身Apelin和APJ受体的mRNA表达量。结果与对照组相比TGF-β组细胞为长梭形,E-cadherin的表达减少,α-SMA的表达增多,细胞外基质FN和Col-Ⅰ的mRNA表达量也显著升高;TGF-β+Apelin组上述效应被显著抑制,且呈浓度依赖性。与TGF-β组相比,TGF-β+Apelin组细胞活化型Smads的水平降低(P0.05),Smad7的表达增加(P0.05)。TGF-β组细胞自身APJ受体的表达量显著升高(P0.05),TGF-β+Apelin组上述效应受到抑制,且呈浓度依赖性。结论 Apelin干扰TGF-β/Smads信号通路从而抑制肾小管上皮细胞EMT;肾小管上皮细胞自身Apelin/APJ系统可能起到一定的代偿作用。     

土荆皮乙酸通过PI3K/AKT通路抑制肺腺癌细胞A549上皮-间质转化

目的:探讨土荆皮乙酸(PAB)对TGF-β1介导的人肺癌细胞A549上皮-间质转化(EMT)及侵袭能力的影响及作用机制.方法:采用Transwell小室实验检测PAB对A549细胞迁移、侵袭能力的影响.免疫荧光法检测上皮标志蛋白E-钙黏蛋白(E-Cad)表达.Western blot检测上皮相关标志物E-Cad、α-连...     

中性粒细胞胞外诱捕网通过诱导巨噬细胞M2型极化促进非小细胞肺癌增殖和侵袭

目的：探究中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）诱导巨噬细胞极化在非小细胞肺癌（NSCLC）增殖和侵袭中的作用及其相关机制。方法：采集28例NSCLC患者肿瘤组织及其癌旁组织,通过免疫组化检测PAD4和Arg-1表达水平。采用PMA/LPS和PMA/IL-4极化THP-1细胞为M1和M2型巨噬细胞的过程中加入NETs共孵育,qRT-PCR检测巨噬细胞iNOS、IL-6、TNF-α、Arg-1、IL-10和TGF-β表达水平。将各组M2型巨噬细胞与A549细胞共孵育,CCK8检测A549细胞增殖变化,Transwell检测细胞侵袭能力变化,qRT-PCR和Western blot检测细胞VEGF表达水平变化。结果：与癌旁组织比较,NSCLC患者肿瘤组织PAD4和Arg-1表达水平升高。在向M1型巨噬细胞极化过程中,加入NETs后巨噬细胞iNOS、IL-6、TNF-α表达水平降低,Arg-1、IL-10、TGF-β表达水平升高。在向M2型巨噬细胞极化过程中,加入NETs后巨噬细胞Arg-1、IL-10、TGF-β表达水平升高。与Control组比较,M2组A549细胞增殖、侵袭能力和VEGF表达...     

Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞在体外对肝星状细胞TGF-β1信号传导的影响

目的:探讨Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞(Smad7-EGFP-BMSCs)在体外抑制肝纤维化的机制。方法:分离、纯化大鼠BMSCs并经Smad7基因腺病毒质粒(Ad-Smad7-EGFP)转染建立Smad7-EGFP-BMSCs。实验将大鼠肝星状细胞HSC-T6分为A组、B组、C组和D组,分别与Smad7-EGFP-BMSCs、BMSCs、Smad7质粒及PBS进行共同培养72 h,采用ELISA测定培养液中Smad7和TGF-β1的表达,采用Western印迹法和RT-PCR法测定细胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ、α-SMA蛋白和mRNA的表达,采用流式细胞术测定细胞凋亡情况。结果:(1)ELISA结果显示,B组、C组和D组培养液TGF-β1蛋白水平较A组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白水平较A组显著升高(P0.01);D组TGF-β1蛋白水平较B组和C组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白水平较B组和C组显著升高(P0.01);(2)Western印迹法和PCR结果显示,B组、C组和D组TGF-β1、ColⅠ和α-SMA蛋白和mRNA表达水平较A组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白和mRNA表达水平较A组显著升高(P0.01);D组TGF-β1、ColⅠ、α-SMA蛋白和mRNA表达水平较B组和C组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白和mRNA表达水平较B组和C组显著升高(P0.01);(3)流式细胞仪检测结果显示,B组、C组和D组HSC-T6细胞凋亡率较A组显著升高(P0.01),而D组细胞凋亡率较B组和C组显著升高(P0.01)。结论:Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞可通过作用肝星状细胞TGF-β1信号转导通路以及促进星状细胞凋亡而具有抗肝纤维化的作用。     

MG132抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞活化

目的探讨泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺成纤维细胞活化的影响及机制。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),随机分为对照组、TGF-β1组(10μg/L)和MG132(0.5μmol/L)处理组。Western blot法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1A1)的表达;RT-PCR和Western blot法分别检测细胞Smad7、核转录共抑制因子SnoN、TGF-βI型受体(TβRI)、Smad2和Smad3 mRNA及蛋白的表达。结果与对照组比较,TGF-β1促进了α-SMA和COL1A1蛋白表达(P0.05),MG132抑制了TGF-β1的上述作用(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN mRNA表达较对照组增加(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN蛋白表达较对照组减少(P0.05),而MG132组Smad7和SnoN蛋白水平较TGF-β1组增加(P0.05)。结论 MG132可能通过阻止Smad7和SnoN蛋白泛素化降解,抑制TGF-β1诱导人肺成纤维细胞活化。     

积雪草苷对TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞增殖和Vimentin蛋白表达影响

目的:研究积雪草苷对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肺泡上皮细胞增殖和波形蛋白(Vimentin)表达的影响。方法:用5 ng/ml的TGF-β1处理A549细胞,同时分别给予40、80、160μg/ml浓度的积雪草苷处理,以正常培养的细胞作为对照,MTT测定各组细胞增殖情况,Western blot检测细胞中上皮间质转化(EMT)标志蛋白Vimentin、钙黏蛋白E(E-cadherin)的表达水平,同时检测诱导型一氧化氮合成酶(i NOS)蛋白水平。收集各组培养液上清,用ELISA法检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)、血管内皮生长因子(VEGF)含量。结果:TGF-β1培养后的A549细胞增殖活性升高,细胞间质标志物Vimentin蛋白水平升高,上皮标志物E-cadherin蛋白水平降低,同时细胞中i NOS蛋白水平也升高,细胞分泌的IL-6、TNF-α、IL-4、VEGF水平升高,IFN-γ水平降低,与正常培养的对照细胞比较,差异有统计学意义(P0. 05)。40、80、160μg/ml的积雪草苷处理以后的细胞增殖活性降低,细胞中间质标志物Vimentin表达减少,上皮标志物E-cadherin表达增多,i NOS蛋白表达减少,细胞分泌的IL-6、TNF-α、IL-4、VEGF减少,IFN-γ增多,与未用积雪草苷处理的细胞比较,差异有统计学意义(P0. 05)。结论:积雪草苷抑制TGF-β1诱导肺泡上皮细胞增殖活性和EMT,减少细胞分泌炎症因子,调控细胞因子的表达,具有一定的抗肺纤维化作用。