人脐血贴壁细胞生物学特点的观察

为了探讨人脐血贴壁细胞分离培养的可行性，分离人脐血CD34^ 细胞进行Dexter培养，观察贴壁细胞的生物学特点结果表明：Dexter培养9—14天(平均112天)时贴壁细胞集落开始形成。1522天(平均19．6天)时集落数量最多，培养28天贴壁细胞铺满培养皿底。细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、“小圆”类细胞为主。细胞化学染色显示：非特异性酯酶染色(NSE)、糖原染色(PAS)100％为阳性，过氧化物酶染色(POX)为阴性，碱性磷酸酶(ALP)28％为阳性。免疫组织化学染色显示：CD106阳性达96％，CD29阳性为93％。CD44阳性为98％，CD45为阴性，CD50％阳性为62％。纤维粘连蛋白(Fn)：92％阳性；层粘连蛋白(Ln)：74％阳性；胶原Ⅳ：83％阳性。结论：人脐血CD34^ 细胞群中存在造血基质细胞的前体细胞，人脐血贴壁细胞具有造血基质细胞的某些生物学特点。     

人AB型血清培养体系体外培养扩增人脐血源基质细胞的试验研究

目的建立并优化AB型健康成人血清培养体系对人脐血源基质细胞的体外培养条件,观察基质细胞的生物学特性。方法人脐带血标本分离培养人脐血源基质细胞,经密度梯度分离后,在含有15％人AB型血清、bFGF（2．5～20．0μg／L）、10mol／L氢化可的松的DMEM／F12培养液中进行原代培养和传代。倒置显微镜观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态特征,并采用常规HE染色和免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定。结果成功获得人脐血源基质细胞并进行体外扩增培养和传代,培养细胞能形成纤维细胞样集落。优化的培养条件为：DMEM／F12培养基添加15％人AB型血清、10．0μg／LbFGF、10^-6mol／L氢化可的松。免疫细胞化学染色Vimentin＋、CD34＋、TdT-、CD45-、CK-,符合造血基质细胞特点。结论采用人AB型血清培养体系可成功培养扩增人脐血源基质细胞,为下一步临床应用研究打下坚实的基础。     

不同明胶浓度及淋巴细胞分离液对人脐血源黏附细胞原代培养的影响

本研究观察不同明胶浓度及淋巴细胞分离液对人脐血源黏附细胞原代培养的影响。采用3％及6％明胶浓度沉降脐血红细胞并观察分离效果；应用Ficoll及Percoll淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，观察其对人脐血源黏附细胞48小时贴壁率、细胞开始伸展时间、细胞培养成功率的影响，倒置显微镜观察细胞形态及生长状况，用细胞化学、免疫细胞化学进行细胞鉴定。结果显示，6％明胶浓度对红细胞沉降效果明显好于3％的明胶。无论是48小时贴壁率、细胞开始伸展时间、黏附细胞集落开始形成时间、集落数达最高的时间及细胞融合时间，还是细胞培养成功率，Percoll明显优于Ficoll；两种方法分离培养的人脐血源黏附细胞的形态、细胞化学染色及免疫细胞化学染色等生物学特征无差异。结论：6％明胶联合Percoll细胞分离液是理想的人脐血源黏附细胞原代培养分离方法，本研究为人脐血源黏附细胞在临床的早日应用提供了基础信息。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景:在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢?目的:比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法:取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法(A组)、密度梯度离心分离法(B组)、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法(C组)、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法(D组)分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论:36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份(27%)培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或(和)圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

重组人血小板生成素对体外培养基质细胞的影响

本研究观察rhTPO有无促进骨髓纤维化的作用。用改良Dexter培养法进行体外不同浓度rhTPO作用下的基质细胞培养，在培养的不同时间用MTT法检测细胞增殖活性，用光学显微镜和扫描电子显微镜观察细胞形态变化，用细胞化学方法观察细胞ALP、PAS、AS—DNCE及纤维染色的变化，用免疫组织化学方法检测纤维连接蛋白，及层黏蛋白和Ⅳ型胶原的变化，用流式细胞术检测细胞表面抗原。结果表明：rhTPO可刺激基质细胞增殖，且随浓度增加而增高；细胞增殖活性随浓度增加而增强，但不随作用时间延长而增加；培养第3天，各组细胞明显贴壁，细胞呈椭圆形，第7天可见散在分布的梭形细胞，第12—14天，细胞排列呈一定的方向性，似漩涡状，细胞为长梭形，70％-80％的瓶底被细胞覆盖。第16—18天细胞覆盖达90％以上，细胞形态均为螺旋状排列的长梭形，类似成纤维细胞形态，瑞氏-姬姆萨染色显微镜下观察主要为成纤维细胞，还有极小部分巨噬细胞，内皮细胞和脂肪细胞，对照组与实验组之间无明显差异。培养14—42天的贴壁细胞，PAS显示为阳性，ALP染色和氯醋酸AS—D萘酚酯酶染色显示为弱阳性，对照组与实验组之间无明显差异；用Masson氏三色和Gomori染色法染色，胶原纤维和网状纤维显示均为阴性；纤维连接蛋白，层黏蛋白和Ⅳ型胶原染色在对照组与实验纽均显示为阳性，但实验组阳性均似稍强，这种阳性并没有随着培养时间的延长而增强；在扫描电镜下观察到随着培养时间延长，细胞表面的绒毛、纤维从无到有，细胞从单层到多层，并逐渐出现新生成的纤维细胞，但对照组与实验各组之间未见明显差异；rhTPO对CD34、CD45、CD105、CD106、CD166的表达无明显影响。结论：rhTPO不影响基质细胞的组织化学特性，纤维染色和扫描电镜观察也未发现有促进纤?     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法（A组）、密度梯度离心分离法（B组）、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法（C组）、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法（D组）分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份（27%）培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或（和）圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

不同细胞饲养层支持脐血CD34＋细胞体外扩增的效果比较

背景:成纤维细胞饲养层与基质细胞饲养层一样能分泌多种细胞因子,其中包括起正性作用和负性作用的细胞因子,它们对共培养体系内的干/祖细胞起双向调节作用,但何时表现为抑制性或促进性作用目前尚无定论.目的:分析比较骨髓基质细胞及皮肤成纤维细胞饲养层对脐血CD34+细胞体外扩增的影响,以了解共培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成.材料:原代成纤维细胞、骨髓标本由广东医学院附属医院提供,脐血标本由广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科提供.方法:体外分离培养人脐血单个核细胞,应用免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞.设立3组:液体培养对照组为脐血CD34+细胞(3×108L-1)+RPMI 1640培养液(含体积分数为10%牛血清白蛋白、10 μg/L粒-巨噬细胞集落刺激因子、10 μg/L干细胞因子、10 μg/L白细胞介素3),接种于24扎培养板;骨髓基质细胞饲养层组、成纤维细胞饲养层组分别将体外分离培养的第4代人骨髓基质细胞,皮肤成纤维细胞接种于24孔培养板,70%融合时加入等量脐血CD34+细胞及相同成分的RPMI 1640培养液.主要观察指标:脐血CD34+细胞增殖情况与集落形成能力.结果:与骨髓基质细胞饲养层组比较,液体培养对照组、成纤维细胞饲养层组脐血CD34+细胞增殖率及集落形成能力均显著降低(P均＜0.01):后2组间比较差异无显著性意义(P＞0.05).结论:骨髓基质细胞饲养层培养体系能促进脐血CD34+细胞体外扩增,并可以较好地保持脐血CD34+细胞的干细胞特性,效果显著优于成纤维细胞饲养层及液体培养体系.     

非转化集落来源的胎肝基质细胞系的建立及鉴定

为研究胎肝基质细胞在调控造血方面的作用,需要对基质细胞进行分离和扩增。利用早期胎肝细胞原代培养上清液具有刺激基质细胞增殖的活性,得到了4个集落来源的胎肝基质细胞系,其中最长的体外培养时间达3个多月。基质细胞经液氮冻存复苏后能保持生长增殖能力。基质细胞系的细胞化学染色显示碱性磷酸酶阴性(AkP)、酸性磷酸酶阳性(AcP~ )和非特异性酯酶阳性(NSE~ )。基质细胞有吞噬鸡红细胞的功能。免疫细胞化学染色的结果为:波形蛋白阳性(vimentin~ )、巨噬细胞抗体-1阳性(macrophage Ab-1~ ),巨噬细胞抗体-2 阳性(macrophage Ab-2~ ),CD15~-,CD45RA~-,CD71~-,纤连蛋白阳性(fibronectin~ )和胶原IV型阴性(collagen IV~-)。研究表明此基质细胞系的成分为巨噬细胞。建立非转化的、集落来源的胎肝基质细胞系的方法是可重复的。所获得的基质细胞系为研究胎肝造血微环境中基质细胞的作用提供了基础。     

脐血间充质干细胞的体外培养及其表面标志变化

背景:目前有关脐血间充质干细胞的体外培养和大规模扩增方法不一,存在一定困难.目的:观察脐血间充质样干细胞体外分离和培养的方法,并检测其表面分子的变化.方法:取新鲜采集脐带血,用1.077 g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于37℃、含体积分数为5%CO2培养箱内培养.于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况.结果与结论:从脐血中分离出的单个核细胞,培养中先出现大量的造血细胞集落,CFU-GM与BFU-E集落形成最多,集落分别增加了(37.1+2.3)和(10.4+1.7)倍,瑞氏染色显示这些细胞大多数为粒系的集落(80.1±85.2)%,其次为红系的细胞集落(14.2±1.8)%,7d后出现贴壁的扁平状上皮样细胞和长梭形成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂.扩增后第14天经流式细胞仪分析CD38+细胞为1.64%,CD34+/CD38+细胞为1_71%,CD34+/CD38-细胞为0.55%,PI+细胞为0.05%,Annexin-V+细胞为0.18%.随着培养时间的延长,细胞数目不断增加,培养21 d时,单个核细胞扩增了近7.8倍.,第28天增加了1.71倍.经流式细胞仪分析CD38+细胞为74.32%,CD34+/CD38+细胞为1.61%,CD34+/CD38-细胞为0.24%.提示脐血间充质干细胞可以体外培养.     

转基因骨髓基质细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增作用的研究

为探讨转染FL基因的人原代骨髓基质细胞对脐血CD34+ 细胞的体外扩增效应 ,建立了转基因骨髓基质细胞与人脐血CD34+ 细胞共培养体系。采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+ 细胞 ,在不同的体外培养体系中进行培养并取样检测细胞总数 ,CFC和CD34+ 细胞百分率。结果表明 ,在不同组合的培养体系中 ,转基因骨髓基质细胞培养体系较骨髓基质细胞培养体系和无滋养层培养体系对有核细胞总数 ,CFC含量和CD34+ 细胞含量均具有明显的扩增作用 ,分别扩增了 12 2 .5± 4 .3,39.6± 2 .7和 11.8± 0 5 2倍 (P <0 .0 5 )。结论 :转染FL基因的人骨髓基质细胞协同其它细胞因子可增强对人脐血CD34+ 细胞的体外扩增作用。     

人脐带间充质干细胞与肝细胞共培养可分化为肝样细胞

背景：文献报道,从骨髓与脐带中分离获得的间充质干细胞可在体外连续传代培养,仍保持干细胞的特性,并在多种细胞因子的＂鸡尾酒式＂诱导下分化为肝细胞样细胞。目的：进一步验证人脐带间充质干细胞在体外正常人肝细胞共培养体系下是否可分化为肝细胞并探讨其分化方法。方法：采用贴壁法,从脐带中分离培养间充质干细胞,流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面标志。人肝细胞LO2细胞与人脐带间充质干细胞建立共培养体系,不添加外源诱导因子,分别于第7,14,21天,通过RT-PCR法检测肝细胞特异标志物甲胎蛋白、白蛋白、人细胞角蛋白19mRNA的表达,糖原染色进行功能鉴定。结果与结论：从人脐带中可分离得到贴壁生长的间充质干细胞,其中CD29＋细胞比例为96.02%,CD105＋细胞比例为96.6%,CD34-细胞比例为99.65%,CD105＋CD29＋双阳性细胞比例为94.84%。与LO2细胞共培养后第7天仅有甲胎蛋白阳性表达;第14天表达白蛋白、人细胞角蛋白19,第21天时,LO2与人脐带间充质干细胞共培养组未出现甲胎蛋白表达;人细胞角蛋白19和白蛋白的表达比第14天略有增强。共培养21d后,糖原染色呈阳性。结果证实,无需额外添加外源诱导因子,脐带间充质干细胞可在人正常肝细胞共培养的微环境中,向正常肝细胞分化。     

人脐带Wharton′s jelly源性干细胞的分离、培养和表型鉴定

目的：探讨人类脐带Wharton′s jelly来源干细胞的分离、培养和表型鉴定。方法：剔除人类脐带动静脉,获得脐带Wharton′s jelly组织,应用组织块贴壁法进行培养,以流式细胞法行细胞表型鉴定。结果：分离出的人类脐带Wharton′s jelly组织,在培养后3-7 d可见细胞从组织块爬出,主要表现长梭形的成纤维样细胞,2周左右可达80%汇合,这些细胞表达间充质干细胞的标记物CD105、CD73、CD90、CD54、CD44,而不表达造血和内皮标记物CD34、CD45、CD106和CD133。结论：应用组织块贴壁法可以从人脐带Wharton′s jelly中分离、培养出干细胞,它们表达间充质干细胞的标记物。     

人脐带间充质干细胞体外长期培养及向肝样细胞的分化

目的:观察人脐带间充质干细胞体外长期培养的生物学特性,探讨其向肝样细胞分化的可能性.方法:脐带来源于天津市第三中心医院住院的健康足月产妇,采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,待细胞生长至80%-90%融合时传代.取传至第9代细胞接种于12孔板内,调整细胞浓度为5×10~(10)L~(-1),加入含肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、抑瘤素的DMEM培养基,诱导28 d.MTT法测定细胞生长活性,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学染色鉴定诱导后肝细胞特异表面标志物的表达,以及糖原染色结果.结果:从人脐带中分离得到的间充质干细胞贴壁生长,形态类似于成纤维细胞,80%以上处于G_0/G_1期,具有良好的生长活性,可在体外稳定传代20次以上;CD29,CD90,CD105,Vimentin呈阳性表达,基本不表达造血细胞标志CD34和内皮细胞标志CD31.随诱导时间的延长,圆形细胞逐渐增多,形态似肝细胞;诱导1周时细胞开始表达肝细胞表面标志物甲胎蛋白、细胞胶蛋白18、细胞胶蛋白19;诱导3周时开始表达成熟肝细胞标志白蛋白;诱导4周时白蛋白表达增强,且诱导细胞糖原染色呈阳性.结论:从人脐带中可成功分离出间充质干细胞,实现体外长期培养,并可诱导分化为肝样细胞.     

人脐带间充质干细胞体外分化成骨细胞的研究

目的探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的能力。方法人脐带经胶原酶和胰蛋白酶消化后于DMEM/F12培养基中培养,通过传代作纯化和扩增;采用倒置显微镜及电镜观察细胞形态,细胞计数绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型及细胞周期;以含有成骨细胞诱导剂(地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸)的DMEM/F12培养基对传至第3代的细胞定向诱导分化为成骨细胞,并对诱导后细胞作成骨细胞检测。结果经酶消化后,细胞贴壁生长,主要呈"成纤维样",但体积较大、形状不规则、细胞质突起多,细胞核大而疏松,核仁明显;第1、3、5、7代细胞生长曲线基本相同;细胞表面表达CD105、CD90、CD44、CD29及CD13,不表达CD34、CD45、HLA-DR;培养至第4代的细胞约72.724%的细胞处G1期、S期的细胞仅占18.069%,第6代时G1期细胞约为83.875%、S期为9.606%左右;细胞经成骨细胞诱导分化后,细胞形态发生改变,线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构,碱性磷酸酶染色显示呈强阳性,茜苏红染色和Von-Kossa染色显示细胞有钙盐沉积并形成钙结节。结论人脐带中分离及培养扩增细胞具有MSCs的基本特性,具有分化为成骨细胞的能力。     

重型肝病患者血清诱导脐血间充质干细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18

背景:脐血富含间充质干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自分泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:观察肝衰竭患者血清对人脐血间充质干细胞的诱导分化作用。方法:密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离纯化脐血间充质干细胞并鉴定,以20%肝衰竭患者血清诱导培养,培养7,14,21d采用免疫组织化学方法检测白蛋白和细胞角蛋白18的表达。结果与结论:实验分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,人脐血间充质干细胞高表达CD44和CD29,不表达CD34,体外可以分化为脂肪细胞;人脐血间充质干细胞在肝病患者血清的低糖DMEM培养基中形态发生明显改变,镜下观察细胞变得稍大而扁平,呈类上皮样细胞,SP染色显示实验组培养7d时仅少数细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18,培养14,21d,白蛋白和细胞角蛋白18表达阳性率逐渐升高,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)。提示密度梯度离心和贴壁培养法相结合可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,肝衰竭患者血清可诱导间充质干细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18。     

脐血混合培养纯化人间充质干细胞及生物学特性研究

目的探讨体外分离、混合培养纯化人脐血间充质干细胞的适宜体系,观察该人脐血间充质干细胞生物学特性。方法收集孕足月新生儿脐血,每3份脐血[(70—100)ml/份]混合;采用1.077 g/ml的淋巴细胞分离液(Ficoll)以1 500 r/min密度梯度离心法分离脐血中的单个核细胞,在Mesencult培养基中贴壁培养筛选人脐血间充质干细胞,显微镜下观察细胞生长形态变化,细胞计数并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞抗原表达,分析细胞周期;体外诱导脐血间充质干细胞成脂、成骨分化。结果密度梯度离心法所获得的单个核细胞,在培养基中培养约3—5 h开始出现贴壁生长,24 h后贴壁细胞增多,呈明显纺锤状,10 d后开始出现细胞克隆,3周后呈漩涡状生长。原代培养时间为15 d,P1代倍增时间为26 h。流式细胞仪鉴定:贴壁生长的细胞表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45。分化潜能鉴定体外培养细胞可以成脂、成骨分化。结论所贴壁培养出的细胞的生长形态、流式表形、分化潜能具有人脐血间充质干细胞生物学特征,混合培养可以提高间充质干细胞培养成功率,实验中采用的培养体系适宜人脐血间充质干细胞的分离培养。     

人脐带间充质干细胞高效分离的方法

背景：目前利用传统分离提取细胞的方法所获取的人脐带来源的间充质干细胞与脐带组织中所含人脐带来源的问充质干细胞的理论值相差甚远,造成脐带组织的极大浪费,阻碍了间充质干细胞的规模化制备培养。目的：建立一套高效分离人脐带间充质干细胞的方法,为间充质干细胞应用于临床提供技术方案。方法：实验分为4组,以传统酶法（胰酶与Ⅱ型胶原酶）为对照组,在此基础上,针对脐带结构分别逐一加入Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶、DNase来对脐带组织进行消化,各实验组设不同作用时间组,比较不同分离方法、不同作用时间所获得细胞数量、细胞活性、原代细胞贴壁出现时间、融合时间及所获得人脐带来源的间充质干细胞第3代细胞在增殖能力、表面标记与多向分化能力方面的差别。结果与结论：经Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和DNAase联合作用于脐带组织,4h细胞计数达到最高（12．47±0．16）×10^6/cm（P〈0．01）;活力为（75．00±5．07）％（P〈0.01）：收获的混合细胞中CD105阳性率及CD29阳性率均高于对照组;细胞贴壁及细胞团融合时间均较对照组缩短（P〈0．01）;伴随细胞的传代,形态逐渐均一,第3代细胞形态基本达到统一,呈梭形漩涡状生长;实验组P3人脐带来源的间充质干细胞特异性标记CD44,CD105,CD29阳性率阳性率均高于对照组,CD34阳性率低于对照组。向脂肪细胞诱导4周后,油红O染色鉴定可见细胞内大量脂滴：向成骨细胞诱导后,茜素红染色鉴定,大体观察可见阳性钙沉积。实验证明了Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和DNAase四酶联合消化脐带组织作用4h的方法缩短了分离细胞用时并显著提高了细胞产量、细胞活力以及细胞增殖能力,同时缩短原代细胞贴壁时间、融合时间。提取得到的原代细胞中间充质干细胞比例,第3代间充质干细胞细胞纯度较传统方法均有提高。     

人脐血间充质干细胞培养方法的比较

背景：脐血中含丰富的间充质干细胞,可以作为组织工程中一种新的种子细胞来源。目的：应用两种培养基体外培养、扩增、分离纯化脐血间充质干细胞,比较其生物学特性的差异。方法：无菌条件下采取40份足月顺产的脐血,肝素抗凝。应用Ficol 密度梯度离心法分离脐血单核细胞,随机分为两组,其中20份用MesenGro人间充质干细胞培养基进行培养,20份用DMEM培养基进行培养。对比两组梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、培养时间、原代细胞数量。选用生长情况良好的原代脐血间充质干细胞,用流式细胞仪检测间充质干细胞表面特异性标记表达情况。结果与结论：MesenGro组梭形的间充质干细胞平均出现时间、细胞集落平均出现时间、原代细胞平均培养时间、原代细胞平均数量为均优于DMEM组（P 〈0.01）。流式细胞仪检测显示,培养的细胞强表达间充质干细胞表面标志CD73和CD105,阳性率99.1%,不表达造血干细胞表面标志CD45和CD34,阴性率99.3%。结果提示在培养间充质干细胞的数量、形态、生长速度和培养时间诸方面,MesenGro 人间充质干细胞培养基均优于DMEM培养基。选用MesenGro人间充质干细胞培养基可以更纯、更快、更好地从脐血中培养出表达间充质干细胞表面标志的细胞。