肝癌HSV-tk/ACV基因治疗的实验研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－tk基因,自杀基因）与阿昔洛韦（ＡＣＶ）系统对人肝癌细胞的体外杀伤效果。方法：体外培养已感染含ＨＳＶ-tk基因的重组逆转录病毒的PA317-tk细胞,获取含HSV－tk基因的重组逆转录病毒颗粒。用后者感染人肝癌细胞株SMMC－7721,G418培养基筛选抗性克降SMMC-7721-tk,并以PCR技术检测HSV-tk基因判断转染成功与否。用形态学方法和MTT法检测ACV对SMMC－7721－tk细胞的杀伤作用。结果：SMMC－7721－tk细胞经PCR证实含PCR－tk基因。形态学观察显示,ACV浓度在0.01-1μg/ml时,SMMC－7721－tk细胞小部分死亡,在浓度自1μg-1000μg/ml时,细胞大部分死亡;HE染色可见细胞凋亡。MTT法测定显示,ACV浓度自1μg/ml开始即对SMMC－7721－tk细胞产生明显抑制作用,抑制率自49％到78％,作用强度呈ACV浓度依赖性。各种浓度的ACV对SMMC－7721细胞没有或只有轻度抑制作用。结论：HSV－tk/ACV系统体外对肝癌细胞有明显的杀伤作用,有可能成为临床基因治疗方案。     

Nrf3基因对肝癌SMMC7721细胞系的体外研究

目的在体外检测Nrf3基因对肝癌SMMC7721的生长影响作用。方法构建其融合蛋白真核表达载体,脂质体介导该真核表达载体转染肝癌SMMC7721细胞系,FCM观察其在体外对肝癌SMMC7721细胞系细胞周期和凋亡的影响;荧光显微镜观察候选基因亚细胞定位。结果Nrf3在肝癌SMMC7721细胞中表达,荧光显微镜下观察Nrf3定位于细胞核内。FCM分析显示Nrf3影响下肝癌SMMC7721G2/M＋S期细胞所占比例较对照组明显减少,G0/G1细胞所占比例明显增加。证实Nrf3可抑制肝癌SMMC7721的DNA合成和有丝分裂,促使细胞阻滞于G0/G1期,抑制肝癌SMMC7721细胞的体外生长。FCM分析,未观察到明显的＂亚G1＂峰（即凋亡峰）,提示Nrf3在体外对肝癌SMMC7721细胞的凋亡无影响。结论Nrf3在体外具有抑制肝癌细胞增殖的功能,对肝癌细胞的凋亡无影响,为肿瘤抑制基因。     

人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞DNA MTase基因mRNA表达的影响

目的：观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721内源性DNA MTase基因mRNA的表达的影响。方法：将将建的包含正、反义DNA MTase基因片段的真核表达载体用脂质体法将其转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用RT－PCR法观察DNA MTase基因mRNA表达变化。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实证用脂质体法成功将重组载体转染入细胞：RT－PCR法检测DNA MTase基因mRNA表达，显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞中DNA MTase基因mRNA表达下调。结论：人DNA MTase基因反义基因转染是一种有效，可靠的抑制肝癌细胞系SMMC－7721DNA MTase基因表达的方法。它为更多了解DNA MTase在肝癌发生的作用提供了帮助。     

卟啉氮芥对人肝癌细胞SMMC7721的光动力杀伤作用

目的：研究新单体化合物卟啉氮芥的光化疗抗肿瘤作用。方法：用结晶紫色法测定 啉氮芥对人肝癌细胞SMMC7721的光动力抑制效应。用测定培养上清乳酸脱氢酶（LDH）活性方法研究光动力作用对人肝癌细胞SMMC7721细胞膜的作用,用^3H-Td掺入法研究光动力作用对人肝癌细胞SMMC7721DNA合成的影响。结果：卟啉氮芥（5μg/ml,培养1h）可使人肝癌细胞SMMC7721D值明显降低、经光激发可使培养上清LDH活性显升高;可使体外培养从肝癌细胞SMMC7721的^3H-TdR掺入显下降,经光激发可使体外培养人肝癌细胞SMMC7721的^3H-TdR掺入量进一步显下降。结论：卟啉氮芥可显抑制人肝癌细胞SMMC7721DNA的合成;对人肝癌细胞SMMC7721有显的光动力抑制作用,轲破坏肿瘤细胞的细胞膜,抑制肿瘤细胞DNA的合成,提示卟啉氮芥对肿瘤细胞有显的光动力杀伤作用,具有发展为光化疗抗癌新药的前景。     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达.MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用.结果 成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV 可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响.结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞.     

CXCR4基因RNA干扰对人肝癌细胞系SMMC7721体外粘附、迁移的影响

目的研究CXCR4基因RNA干扰对肝癌细胞系SMMC7721体外增殖、粘附能力的影响。方法psiR—NA．CXCR4真核表达载体转染SMMC7721细胞,Trans well法检测细胞的体外迁移能力,12（;5检测细胞的粘附能力。结果psiRNA-CXCR4真核表达载体转染SMMC7721细胞后,明显沉默了SMMC7721mRNA表达,转染后48h抑制效率最高。SMMC7721细胞体外增殖、迁移能力受到抑制（P〈0．05）。结论CXCR4基因RNA干扰在体外可明显沉默肝癌细胞系SMMC7721CXCR4基因的表达,抑制肝癌细胞系SMMC7721的生长和转移。     

慢病毒介导的TSPY1对肝癌SMMC7721和Huh7细胞系增殖的影响

目的：观察转染睾丸特异性蛋白1（ TSPY1）慢病毒表达载体对肝癌细胞SMMC7721和Huh7细胞系增殖能力的影响。方法构建特异性的TSPY1慢病毒过表达载体稳定转染至SMMC7721和Huh7肝癌细胞系,采用荧光定量PCR和蛋白印迹技术检测TSPY1 mRNA和蛋白的表达情况,Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测转染后细胞的增殖情况。结果在转染过表达TSPY1慢病毒的SMMC7721和 Huh7细胞中, TSPY1 mRNA和蛋白的表达均明显上调（ P＜0.01）。 CCK-8细胞增殖实验发现,过表达TSPY1组SMMC7721和Huh7细胞的增殖能力比对照组增强。结论 TSPY1慢病毒表达载体可明显上调TSPY1 mRNA和蛋白表达,并能够促进肝癌SMMC7721和Huh7细胞的增殖。     

人DNA MTase反义基因转染对诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

目的；观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721凋亡的影响。方法：采用脂质体法将构建的包含正，反义DNA MTase基因片段的真核表达载体转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用MTT法绘制生长曲线；流式细胞法和原位末端标记法检测细胞凋亡改变。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实用脂质体法成功将重组载体转染入细胞；生长曲线显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞增殖速度减慢；流式细胞法测得其凋亡率由3．1％增加到13．5％，末端标记法也显示其调亡指数增加。结论：人DNA MTase反义基因转染可诱导肝癌细胞系SMMC－7721凋亡。凋亡基因功能被恢复可能主要原因之一。     

Survivin基因与Bcl-2/bax在不同肝癌细胞中的表达研究

目的:探讨Survivin基因在肝癌细胞中的表达及与Bcl- 2/bax的关系.方法:体外培养的人肝癌细胞SMMC - 7721、Hep - G2及正常肝细胞,采用RT - PCR法,免疫组织化学检测Survivin及Bcl-2/bax基因的表达情况.结果:免疫组织化学法显示肝癌细胞中有Survivin基因表达,且在SMMC - 7721比在Hep - G2表达更明显,而在正常肝细胞中Survivin基因表达不明显;Survivin高表达的细胞,Bcl -2也增高.RT - PCR法显示Survivin基因的表达在肝癌细胞中增加.结论:Survivin基因与人肝癌细胞SMMC -7721及Hep - G2有关,与肝癌细胞的分型相关,由此推断,Survivin基因与肝癌的发生、发展及预后有关.     

融合自杀基因FCU1真核表达载体的构建与表达

目的 构建含有融合自杀基因FCU1的真核细胞表达载体pEGFP-FCU1，并转染肝癌细胞SMMC7721，初步探讨Fcu1／5-氟胞嘧啶(5-FC)系统对体外培养细胞的生长抑制作用。方法 用SmaⅠ，XhoⅠ两种限制性内切酶分别切割质粒pEGFP-C1和pCIneoFCU1，所得载体片断和目的基因片断连接后转化，阳性重组子转染肝癌细胞SMMC7721，以绿色荧光蛋白基因为报告基因，用G418筛选出阳性细胞克隆后，进行体外药物敏感实验。结果 酶切鉴定重组子阳性克隆率约为60％，转染成功的细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光；转染的细胞在5-FC作用下其生长抑制率明显高于未转染细胞的生长抑制率，且旁观者效应显著。结论 自杀基因FCU1真核表达载体构建正确，转染细胞成功并获稳定表达，FCUl／5-FC系统对肝癌细胞SMCC7721具有实验性的基因治疗作用。     

人DNA MTase反义基因转染诱导E-Cadherin基因启动子区域去甲基化

目的：观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721E－Cadherin基因启动子区域甲基化状态的影响。方法：采用脂质体法将已构建的包含正，反义DNA MTase基因片段的真核表达载体转染入肝癌细胞系SMMC－7721；用甲基化特异的PCR法检测E－Cadherin基因启动子区域甲基化状态的改变，结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实用脂体法成功将重组载体转染入细胞，甲基化特异的PCR法检测显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞中的E－Cadherin基因启动子区域呈现去甲基化状态。结论：人DNA MTase反义基因片段可诱导E－Cadherin基因启动子区域去甲基化，实验结果有助于进一步了解DNA MTase在肝癌发展中的作用。     

反义端粒酶RNA抑制肝癌细胞生长的机制

目的：观察反义端粒酶RNA对SMMC－7721肝癌细胞系的作用,探讨抗端粒端治疗在原发性肝癌治疗中的意义。方法：采用脂质体介导的方式将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212/hTP转入SMMC7721细胞中,经潮霉素筛选,克隆细胞株扩增鉴定后,采用TRAP－PCR－ELISA,FCM及电镜检测反义端粒酶RNA对转染细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响;同时进行裸鼠荷瘤生长实验观察。结果：TRAP－PCR－ELISA法检测细胞端粒酶活性的结果为：实验组吸光度值为0．980,对照组吸光度值为2．861;FCM检测细胞凋亡结果为：实验组13．8％,对照组未见有凋亡峰形成,电镜观察发现转染细胞表现出典型的凋亡细胞形态。裸鼠移植瘤生长实验发现,转染细胞生长明显受到抑制作用,说明反义端粒酶RNA显抑制SMMC7721细胞的端粒酶活性,并且对其有显的促凋亡作用。结论：反义端粒酶RNA能有效地抑制肝癌细胞端粒酶活性,同时显促进癌细胞凋亡。     

反义端粒酶RNA与1,25-（OH）2D3抑制肝癌细胞增殖的协同作用

【目的】观察1,25-(OH2)D3对转染反义端粒酶RNA的肝癌细胞增殖的作用。【方法】经脂质体介导,将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212-hTR导入维生素D3受体(VDR)阳性的肝癌细胞株SMMC7721细胞中培养。细胞克隆转移扩大培养,添加1,25-(OH)2D3分别作用于各实验组细胞后,采用四唑蓝比色实验(MTT)和平板克隆形成实验,检测细胞的存活和生长;TUNEL法检测细胞凋亡。【结果】转染组细胞和对照组细胞的端粒酶活性分别为0.686和1.685,说明反义端粒酶RNA可显著降低肝癌细胞端粒酶活性。10 nmol/L浓度的1,25-(OH2)D3对肝癌细胞的增殖具有明显的抑制作用;且较之于单独的1,25-(OH2)D3或转染反义端粒酶RNA对肝癌细胞增殖的抑制作用,在转染反义端粒酶RNA,降低肝癌细胞端粒酶活性后,1,25-(OH2)D3抑制肝癌细胞增殖的作用显著得到增强。各组细胞的凋亡率分别为3.4%、12.2%、8.8%、23.6%。经统计学处理,上述实验结果证实均存在显著的差异(P<0.01)。【结论】在转染反义端粒酶RNA、降低细胞端粒酶活性的基础上,1,25-(OH2)D3抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用进一步得到增强。     

Estabishment of A Human Liver Cancer Cell Line Transfected with IL-2 cDNA and Its Biologic Activity

Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｄｕｃｅａｎｔｉ ｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ ,ｓｃｉ ｅｎｔｉｓｔｓｓｉｎｃｅｌｏｎｇａｇｏｈａｖｅａｔｔｅｍｐｔｅｄｔｏｉｎｔｅ ｇｒａｔｅｃｅｌｌｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｉｎｔｏｔｕｍｏｒｃｅｌｌｖｉａｇｅ ｎｏｍｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｏｍａｋｅｉｔｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙｅｘ ｐｒｅｓｓｌｏｃａｌｌｙ .ＩｎｔｈｉｓｓｕｒｖｅｙｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｃｅｌｌＳＭＭＣ 772 1ｗａｓｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒＬＮＣ ＩＬ2 .Ｔｈｅ…     

siRNA介导的新趋化因子VCC-1沉默对人SMMC7721肝癌细胞生长的影响

 目的 探讨siRNA靶向抑制VCC-1表达对人肝癌细胞株SMMC27721生长的影响。方法 采用脂质体法将siRNA质粒导入SMMC7721细胞,建立VEGF相关的趋化因子1（(VEGF correlated chemokine 1,VCC-1）)VCC-1基因表达沉默的肝癌细胞系,用Western blot检测细胞中VCC-1的表达水平,用MTT法、软琼脂克隆形成实验等研究siRNA靶向抑制VCC-1表达对SMMC7721细胞生长的影响。结果 Western blot 结果显示RNA干扰组（shVCC1-1组）细胞VCC-1蛋白表达水平明显低于对照组（P<0.01）; ,MTT法结果显示shVCC1-1组细胞增殖速度、克隆形成率均低于对照组（P<0.05）。结论 siRNA靶向抑制 VCC-1表达可以抑制人SMMC7721肝癌细胞增殖能力及克隆形成能力。     

红豆杉细胞提取物抑制肿瘤细胞增殖及诱导凋亡的实验研究

目的 研究红豆杉细胞提取物对肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制作用及其机制。方法 运用台盼蓝拒染法测定肿瘤细胞生长曲线，流式细胞仪和Giemsa染色分析肿瘤细胞周期和细胞凋亡。结果 红豆杉细胞二氯甲烷提取物对肝癌细胞SMMC-7721的生长有明显的抑制作用，流式细胞仪分析发现G2／M期肿瘤细胞数量增多，经Giemsa染色发现肿瘤细胞有凋亡发生。结论 红豆杉细胞提取物可以通过诱导细胞发生凋亡而抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长。