siRNA靶向沉默MALAT-1基因对人食管癌EC9706细胞体外侵袭迁移的影响

目的:研究长链非编码RNA MALAT-1对食管癌EC9706细胞系迁移、侵袭能力的影响。方法:化学合成针对MALAT-1的siRNA,脂质体法转染EC9706细胞,转染48h后RT-PCR和Western blot检测各细胞MALAT-1在mRNA和蛋白质水平的表达。Transwell实验检测迁移、侵袭能力改变。结果:小干扰RNA下调MALAT-1表达后,RT-PCR和Western blot证实食管癌EC9706细胞中MALAT-1的表达在mRNA水平和蛋白质水平均明显下调,Transwell实验证实食管癌EC9706细胞迁移、侵袭能力下降。结论:抑制MALAT-1表达能够使食管鳞癌细胞的侵袭转移能力明显降低。     

RNAi技术沉默DKK1基因对食管癌ECA109及EC1细胞系增殖的影响

目的:通过构建DKK1的靶向小干扰RNA(small interfering RNA),探讨干扰DKK1基因的表达和对食管癌ECA109及EC1细胞系增殖的影响.方法:转染DKK1 siRNA于食管癌细胞系ECA109、EC1,应用蛋白免疫印迹方法检测转染前后细胞中DKK1的蛋白表达变化.食管癌细胞系ECA109及EC1成功干扰DKK1表达后,应用CCK-8法检测癌细胞增殖变化,平板克隆法检测癌细胞的克隆形成能力变化.结果:食管癌细胞系转染DKK1 siRNA后,ECA109中DKK1蛋白表达降低48.62％ (P ＜0.01),EC1中DKK1蛋白表达降低50％(P＜0.01).在CCK-8法检测癌细胞增殖变化实验中,DKK1 siRNA转染后24 h、48 h及72 h,相比阴性对照组,细胞增殖能力显著降低.平板克隆实验中,DKK1 siRNA转染后,ECA109细胞克隆均数(77.53±4.948)低于空白对照组(44.2±7.704),克隆率下降42.98％,而EC1细胞克隆均数(71.67±5.239)低于空白对照组(36±2.646),克隆率下降49.76％.结论:干扰DKK1的表达能够抑制食管癌细胞的增殖,DKK1可能成为抑制食管癌增殖的分子靶点.     

桥接整合因子1 去甲基化诱导细胞周期阻滞抑制食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖

目的：分析桥接整合因子1（bridging integrator-1, Bin1）去甲基化对Bin1 基因表达和食管鳞状细胞癌EC109 细胞增殖能力的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法：甲基化特异性PCR（methylation specific polymerase chain reaction, MSP）法检测去甲基化药物5-氮杂-2''脱氧胞苷（5-Aza-2''-deoxycytidine, 5-Aza-dc）处理后EC109 细胞Bin1 启动子区域的甲基化状态,用qPCR、Western blotting 和MTT法分别检测单独5-Aza-dc 和5-Aza-dc 加转染Bin1 基因干扰片段（Bin1 siRNA）处理对EC109 细胞Bin1 mRNA及其蛋白表达和细胞增殖能力的影响,流式细胞术和Western blotting 检测5-Aza-dc 处理后EC109 细胞周期和细胞周期相关蛋白（Cyclin D1 与CDK4）表达的变化。结果：去甲基化药物5-Aza-dc 处理后,EC109 细胞Bin1 基因启动子区域发生去甲基化。5-Aza-dc 处理的Bin1 去甲基化EC109 细胞Bin1 mRNA和蛋白表达明显上调（均P<0.05）,细胞增殖能力明显下降（P<0.05）,细胞阻滞在G0/G1 期,表现为S 期细胞比例显著减少,细胞周期相关蛋白Cyclin D、CDK4 表达均明显下调（均P<0.05）。Bin1 去甲基化EC109 细胞转染Bin1 siRNA后,Bin1 mRNA和蛋白表达明显下调,细胞增殖能力增强（均P<0.05）。结论：Bin1 基因启动子区域在EC109 细胞中呈完全甲基化状态,5-Aza-dc 去甲基化可使食管鳞癌细胞EC109 细胞Bin1 表达升高,通过降低细胞周期相关蛋白表达诱导细胞周期阻滞抑制EC109 细胞增殖。证实表观遗传学变化可能与食管癌细胞恶性增殖有关,可为食管癌治疗提供新的思路。     

HDAC6表达下调对食管鳞癌细胞周期影响的研究

目的:研究HDAC6siRNA对食管鳞癌EC9706细胞中HDAC6的干扰效果,以及HDAC6表达下调对食管鳞癌细胞增殖能力、细胞周期的影响。方法:将食管鳞癌EC9706细胞分为未处理组、对照siRNA组和HDAC6siRNA组3组,后2组分别转染对照siRNA和HDAC6siRNA。采用半定量反转录-聚合酶链反应、蛋白质印迹及免疫细胞化学检测各组食管鳞癌EC9706细胞中HDAC6siRNA对HDAC6的干扰效果;采用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖能力的变化;运用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期的变化。结果:HDAC6siRNA组的HDAC6mRNA表达的相对水平为0.044,HDAC6蛋白表达相对水平为0.114,与未处理组(0.951、0.924)和对照组(0.947、0.905)相比,HDAC6mR-NA和蛋白的表达均显著下调,t值分别为2.24和2.52,P<0.05;细胞增殖明显受抑制,且G0/G1期的比率为(68.55±2.01)%,显著高于未处理组(45.64±1.26)%和对照siRNA组(46.23±1.39)%,S期的比率(25.93±0.73)%显著低于未处理组(33.13±1.02)%和对照siRNA组(32.98±0.91)%,差异均有统计学意义,P<0.05。结论:HDAC6siRNA能有效下调食管鳞癌EC9706细胞中HDAC6mRNA和蛋白的表达;HDAC6表达下调能明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖并能诱导细胞周期静止在G0/G1期。     

siRNA 沉默HIF-1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞VEGF表达的影响

 目的 观察体外乏氧培养条件下食管鳞癌细胞系EC9706中HIF-1α和VEGF的表达，探讨HIF-1α在低氧条件下对食管鳞癌血管生成的调控作用。方法 CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境，RT-PCR、免疫组化法和免疫印迹法分别检测缺氧状态下HIF-1α和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达。采用化学合成小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰技术（RNAi）用siRNA转染EC9706细胞。观察转染后HIF-1α沉默效果。结果 低氧条件下，EC9706细胞HIF-1amRNA水平稳定，蛋白表达显著升高，而VEGFmRNA和蛋白的表达均显著升高。SiRNA转染EC9706后能够显著下调HIF-1α的基因表达，同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论 缺氧促使EC9706细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高，并通过转录激活VEGF的机制调控食管鳞癌血管生成。     

XIAP基因对食管癌细胞黏附、侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨沉默X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）基因表达对食管癌细胞黏附、侵袭和迁移能力的影响及机制。方法:参照LipofectamineTM2000说明将设计合成的XIAP特异性siRNA（si-XIAP）转染人食管癌EC9706细胞,将转染阴性对照siRNA(NC组）和仅加入脂质体的空白细胞作为两个对照组,siRNA转染48 h,通过Western blotting检测XIAP、AKT、p-AKT、E-cadherin和MMP-2蛋白表达;通过MTT法、Transwell法分别检测细胞黏附、侵袭和迁移能力;MTT法检测转染siRNA后24 h、48 h和72 h的细胞增殖。结果:XIAP特异性siRNA转染后,EC9706细胞XIAP表达明显降低,与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组比较,si-XIAP组细胞增殖明显降低,黏附率明显升高,侵袭和迁移能力明显降低,p-AKT和MMP-2表达明显降低,E-cadherin表达明显升高（P<0.05）。结论:沉默XIAP基因可增强食管癌细胞黏附率,抑制侵袭和迁移能力,机制与抑制PI3K/AKT信号通路有关。     

hPTTG1基因沉默下调bFGF表达并抑制A2780细胞侵袭的研究

目的:探讨RNAi技术沉默卵巢癌细胞A2780细胞内hPTTG1表达对其侵袭性的影响及调控机制。方法:利用阳离子转染试剂将hPTTG1 siRNA转染A2780细胞,荧光实时定量PCR检测hPTTG1及bFGF表达水平;MTT基质黏附实验检测细胞黏附能力;细胞侵袭重建基底膜实验测定细胞体外侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;Western blot检测bFGF蛋白表达水平。结果:hPTTG1siRNA转染组hPTTG1mRNA表达下降,抑制率为(76.8±4.1)%;转染hPTTG1siRNA后细胞黏附、侵袭和迁移能力降低;hPTTG1干扰后bFGFmRNA及蛋白表达下降。结论:hPTTG1siRNA能够抑制A2780细胞侵袭,可能是通过下调bFGF表达实现的。     

FOXC2对人食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及相关机制研究

目的: 探讨叉头框（FOX）C2对食管癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响及机制。方法: 选择人食管癌细胞CaES-17,Eca-109,TE13及人食管上皮细胞（HEEC）,选择FOXC2较高表达的食管癌细胞（CaES-17）作为转染细胞,设siRNA FOXC2组、pcDNA-FOXC2组及未转染组和转染阴性对照组。采用qRT-PCR检测细胞FOXC2表达;CCK-8检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;WB检测MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin、p-β-catenin的蛋白表达水平。结果: 食管癌细胞FOXC2蛋白表达明显高于食管上皮细胞;与对照组相比,上调FOXC2表达可使MMP9、Snail表达明显升高,下调FOXC2表达可抑制食管癌细胞增殖,并抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力及降低Wnt3a蛋白表达。结论: 下调FOXC2抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,作用机制可能与调控MMP-9、Snail水平及Wnt/β-catenin通路有关。     

小干扰RNA抑制bcl-xL表达对食管癌细胞化疗敏感性的影响

目的探讨凋亡抑制分子bcl-xL表达下调对食管癌细胞化疗敏感性的影响。方法根据人bcl-xL基因序列设计和合成3对小干扰RNA,将其转染于体外培养的人食管癌细胞株Eca-109,通过RT-PCR和Western-blotting检测bcl-xL的表达情况,筛选出对bcl-xL表达抑制作用最强的小干扰RNA,通过MTT法检测小干扰RNA转染细胞和对照细胞在不同浓度顺铂和紫杉醇作用下的细胞增殖抑制率,计算出半数抑制浓度IC50值并进行对比分析。结果食管癌细胞转染靶向bcl-xL的3种小干扰RNA后,bcl-xL mRNA和蛋白表达均显示出不同程度下调,其中siRNA1对癌细胞bcl-xL表达的抑制作用最强。siRNA1转染食管癌细胞后可使顺铂和紫杉醇对癌细胞的IC50值由转染前的（31.4±4.3）μmol/L和（35.3±6.1）μmol/L下降至转染后的（8.4±3.3）μmol/L和（15.1±4.7）μmol/L（P〈0.01）。结论小干扰RNA抑制bcl-xL表达可增强食管癌细胞对顺铂和紫杉醇化疗的敏感性。     

小干扰RNA抑制bcl-xL表达对食管癌细胞化疗敏感性的影响

目的 探讨凋亡抑制分子bcl-xL表达下调对食管癌细胞化疗敏感性的影响.方法 根据人bcl-xL基因序列设计和合成3对小干扰RNA,将其转染于体外培养的人食管癌细胞株Eca-109,通过RT-PCR和Western-blotting检测bcl-xL的表达情况,筛选出对bcl-xL表达抑制作用最强的小干扰RNA,通过MTT法检测小干扰RNA转染细胞和对照细胞在不同浓度顺铂和紫杉醇作用下的细胞增殖抑制率,计算出半数抑制浓度IC50值并进行对比分析.结果 食管癌细胞转染靶向bcl-xL的3种小干扰RNA后,bcl-xL mRNA和蛋白表达均显示出不同程度下调,其中siRNA1对癌细胞bcl-xL表达的抑制作用最强.siRNA1转染食管癌细胞后可使顺铂和紫杉醇对癌细胞的IC5o值由转染前的(31.4±4.3)μmol/L和(35.3±6.1)μmol/L下降至转染后的(8.4±3.3)μmol/L和(15.1±4.7)μmol/L(P＜0.01).结论 小干扰RNA抑制bcl-xL表达可增强食管癌细胞对顺铂和紫杉醇化疗的敏感性.     

长链非编码RNA HAGLROS在食管鳞癌组织中的表达及其对食管鳞癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨长链非编码RNA HAGLROS在食管鳞癌组织中的表达及其与食管鳞癌患者临床病理参数之间的关系,分析HAGLROS对食管鳞癌细胞增殖及转移的影响.方法 运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HAGLROS在42对食管鳞癌组织与癌旁食管正常组织及食管上皮细胞Het1A及食管鳞癌细胞EC109和KYSE30...     

lncRNA NORAD促进食管鳞状细胞癌EC9706 细胞的增殖和迁移

目的：探讨长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）DNA损伤激活的非编码RNA（non-coding RNA-activated by DNA damage,NORAD）对食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）细胞株EC9706 增殖和迁移能力的影响及其机制。方法：采用RT-PCR 法检测不同ESCC细胞（EC9706、TE1、YES-2、KYSE150）中NORAD mRNA表达水平,通过RNA干扰技术将NORAD的小干扰RNA（siRNA）转染到EC9706 细胞（si-NORAD组）以建立NORAD低表达细胞,另设置空白对照组（Ctrl 组,不转染任何序列）及阴性对照组（NC组,转染siRNA 阴性对照序列）,qPCR验证其转染效果。用MTT、平板克隆形成和划痕愈合实验检测敲低NORAD前后EC9706 细胞增殖和迁移能力的变化,Western blotting 检测敲低NORAD前后EC9706 细胞中上皮钙黏蛋白（E-cadherin）、神经钙黏蛋白（N-cadherin）和锌指转录因子Snail 的表达变化。结果：在4 种ESCC 细胞中NORAD mRNA 均呈高表达状态,同时与TE1、YES-2、KYSE150 细胞相比,EC9706 细胞中NORAD mRNA 呈显著高表达（P<0.01）。与Ctrl 组和NC 组比较,转染NORAD-siRNA 后,si-NORAD 组EC9706 细胞中NORAD 表达水平显著降低（均P<0.01）,EC9706 细胞的增殖和迁移能力显著降低（均P<0.05）;敲低NORAD 表达后,EC9706 细胞中E-cadherin 表达升高而N-cadherin 和Snail 表达降低（均P<0.05）。结论：NORAD 在EC9706 细胞中呈高表达状态,敲低NORAD 表达可通过上调E-cadherin、下调N-cadherin 和Snail表达而抑制EC9706 细胞的增殖和迁移能力。     

Effects of Down-regulation of HDAC6 Expression on Proliferation,Cell Cycling and Migration of Esophageal Squamous CellCarcinoma Cells and Related Molecular Mechanisms

Objective: To study the effects of down-regulation of HDAC6 expression on proliferation, cell cycling andmigration of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) cells and related molecular mechanisms. Methods:ESCC cell line EC9706 cells were randomly divided into untreated (with no transfection), control siRNA(transfected with control siRNA) and HDAC6 siRNA (transfected with HDAC6 small interfering RNA) groups.Effects of HDAC6 siRNA interference on expression of HDAC6 mRNA and protein in EC9706 cells wereinvestigated by semi-quantitative RT-PCR, Western blotting and immunocytochemistry methods. Effects ofdown-regulation of HDAC6 expression on cell proliferation, cell cycle, and cell migration were studied usinga CCK-8 kit, flow cytometry and Boyden chambers, respectively. Changes of mRNA and protein expressionlevels of cell cycle related factor (p21) and cell migration related factor (E-cadherin) were investigated by semiquantitativeRT-PCR and Western blotting methods. Results: After transfection of HDAC6 siRNA, the expressionof HDAC6 mRNA and protein in EC9706 cells was significantly downregulated. In the HDAC6 siRNA group,cell proliferation was markedly inhibited, the percentage of cells in G0/G1 phase evidently increased and thepercentage of cells in S phase decreased, and the number of migrating cells significantly and obviously decreased.The mRNA and protein expression levels of p21 and E-cadherin in the HDAC6 siRNA group were significantlyhigher than those in the untreated group and the control siRNA group, respectively. Conclusions: HDAC6 siRNAcan effectively downregulate the expression of HDAC6 mRNA and protein in EC9706 cells. Down-regulation ofHDAC6 expression can obviously inhibit cell proliferation, arrest cell cycling in the G0/G1 phase and reduce cellmigration. The latter two functions may be closely related with the elevation of mRNA and protein expressionof p21 and E-cadherin.     

RNA干扰HMGB1基因对食管鳞癌细胞X线照射后增殖与迁移能力影响

目的 RNAi技术干扰人食管鳞癌细胞中HMGB1基因表达,观察X线照射后细胞增殖活性、迁移和存活能力及细胞周期分布。方法 RT-PCR和Western blot法检测HMGB1 mRNA和蛋白表达;分别采用MTS和Transwell方法检测食管鳞癌细胞ECA109、KYSE30细胞增殖活性和迁移能力;克隆形成实验检测各组细胞的存活能力;流式细胞术检测照射后各组的细胞周期分布。结果 照射组ECA109、KYSE30细胞中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平较未照射组明显增加(P<0.05),且存在剂量-效应和时间-效应关系;MTS结果显示食管鳞癌细胞的增殖水平在照射后不同时间点均明显降低(P<0.01);HMGB1沉默组细胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表达均明显低于对照组和NC组(P<0.01);克隆形成实验结果显示HMGB1表达降低后,肿瘤细胞的放射敏感性明显增加(P<0.01);Tanswell侵袭小室模型检测显示照射后4 h沉默组穿膜细胞数明显降低(P<0.01),且沉默组G0/G1期比例明显高于对照组和NC组,S期比例显著低于其他组,照射后这种趋势更明显(P<0.01)。结论 RNAi干扰技术降低食管鳞癌细胞中HMGB1的表达,降低了细胞增殖和迁移能力,通过诱导照射后G0/G1期阻滞增加了放射敏感性。     

RNA干扰HMGB1基因对食管鳞癌细胞X线照射后增殖与迁移能力影响

目的 RNAi技术干扰人食管鳞癌细胞中HMGB1基因表达,观察X线照射后细胞增殖活性、迁移和存活能力及细胞周期分布。方法 RT-PCR和Western blot法检测HMGB1 mRNA和蛋白表达;分别采用MTS和Transwell方法检测食管鳞癌细胞ECA109、KYSE30细胞增殖活性和迁移能力;克隆形成实验检测各组细胞的存活能力;流式细胞术检测照射后各组的细胞周期分布。结果 照射组ECA109、KYSE30细胞中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平较未照射组明显增加(P<0.05),且存在剂量-效应和时间-效应关系;MTS结果显示食管鳞癌细胞的增殖水平在照射后不同时间点均明显降低(P<0.01);HMGB1沉默组细胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表达均明显低于对照组和NC组(P<0.01);克隆形成实验结果显示HMGB1表达降低后,肿瘤细胞的放射敏感性明显增加(P<0.01);Tanswell侵袭小室模型检测显示照射后4 h沉默组穿膜细胞数明显降低(P<0.01),且沉默组G0/G1期比例明显高于对照组和NC组,S期比例显著低于其他组,照射后这种趋势更明显(P<0.01)。结论 RNAi干扰技术降低食管鳞癌细胞中HMGB1的表达,降低了细胞增殖和迁移能力,通过诱导照射后G0/G1期阻滞增加了放射敏感性。     

食管鳞癌细胞外泌体中miR-130a对血管新生的作用及其机制

目的 探讨食管鳞癌细胞外泌体中的miR-130a对血管新生的作用及其机制.方法 提取食管上皮细胞HEEC、食管鳞癌细胞TE-13和Eca-109所分泌的外泌体及转染miR-130a mimic、miR-130a inhibitor及其阴性对照(NC)后的Eca-109细胞外泌体,并与人脐静脉血管内皮细胞HUVEC共孵育...     

Silencing of PDK1 Gene Expression by RNA Interference Suppresses Growth of Esophageal Cancer

The current study was conducted to explore the inhibitory effects of a small interfering RNA (siRNA) on3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1) expression in esophageal cancer 9706 (EC9706) cells andthe influence on their biological behavior. After transfection of a synthesized PDK1 siRNA, PDK1 mRNA andprotein expression and the phosphorylation level of the downstream Akt protein were assessed using RT-PCRand Western blot analysis. Proliferation, apoptosis, cell invasion and in vivo tumor formation capacity werealso investigated using MTT, flow cytometry, Transwell invasion trials, and nude mouse tumor transplantion,respectively. PDK1 siRNA effectively suppressed PDK1 mRNA and protein expression, and down-regulated thephosphorylation level of the Akt protein in the EC9706 cells (P < 0.05). It also inhibited cell proliferation andinvasion, and promoted apoptosis; such effects were particularly obvious at 48 h and 72 h after transfection (P< 0.05). Growth of transplanted tumors was inhibited in nude mice, with decreased PDK1 expression in tumortissues. PDK1 may be closely correlated with proliferation, apoptosis and invasion of esophageal cancer cellsand thus may serve as an effective target for gene therapy.