基于matK基因的高良姜及其同属混伪品的分子鉴别

目的:建立基于matK基因的高良姜及其同属混伪品的分子鉴别方法。方法:采用通用引物对高良姜样品matK基因进行PCR扩增和双向测序,并从Gen Bank下载10种同属混伪品的matK基因序列。采用Clustal X、MEGA软件进行序列比对分析、计算遗传距离以及构建聚类树。结果:获得的高良姜及其同属混伪品matK基因序列长度为732 bp,变异位点41个。高良姜种内遗传距离为0.000,与混伪品之间的最小遗传距离为0.003。基于matK序列构建的系统发生树显示高良姜样品聚在一起,能直观地与混伪品区分。结论:matK基因可以有效地鉴别高良姜及其同属混伪品。     

巴戟天与常见混伪品的rDNA-ITS序列分析及其分子鉴定

目的比较巴戟天与常见混伪品之间的rDNA-ITS碱基序列的差异及其规律,同时为巴戟天及混伪品的指纹图谱鉴别提供分子标记。方法对巴戟天及其常见混伪品的rDNA-ITS进行了PCR扩增、测序,并运用CLUSTALX、MEGA软件对该区进行序列分析。结果测定了巴戟天及其混伪品的rDNA-ITS区序列,包括ITS1、5.8S和ITS2全长序列以及18S、26S部分序列。巴戟天与假巴戟天、羊角藤在ITS1和ITS2区的差异性分别为2.9%~5.8%和2.9%~4.2%,而与虎刺在ITS1和ITS2区的差异性则为21.2%和18.9%。根据ITS序列特征构建的系统树,混伪品假巴戟天与羊角藤首先聚类,然后与巴戟天聚在一起,而虎刺则单独聚为一支。结论rDNA-ITS序列可作为巴戟天与混伪品的一种较好的分子指纹图谱的标记方法。     

凉茶药材鸡蛋花及其混伪品的DNA条形码鉴定

该研究应用ITS2序列作为DNA条形码鉴定凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,共收集48份药材和基原植物样本,提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,经CodonCode Aligner拼接注释获得序列,然后应用MEGA5.0比对ITS2序列,计算种内和种间遗传距离,构建系统进化NJ树进行鉴定。结果表明,鸡蛋花ITS2序列长度为244 bp,种内遗传距离为0~0.016 6,远小于其与混伪物种间的遗传距离0.320 8~0.650 4,NJ树结果显示鸡蛋花与其混伪品均可准确区分。因此,应用ITS2条形码能够准确、有效地鉴别凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,为鸡蛋花药材的鉴定提供了一种新的分子手段,为其使用安全提供了有力保障。     

基于ITS2序列鉴别前胡和紫花前胡药材及其混伪品

为应用ITS2序列对前胡、紫花前胡药材及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究,该文依据国家药典委员会公布的《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》,PCR扩增前胡、紫花前胡及其混伪品的ITS2序列并进行双向测序。经CodonCode Aligner V 3.7.1对测序峰图进行校对拼接,采用MEGA5.0软件分析相关数据。结果表明:前胡药材的ITS2序列长度为229~230 bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为0.005。紫花前胡药材的ITS2序列长度为227 bp,种内无变异。前胡、紫花前胡药材与其混伪品的种间平均K2P遗传距离分别为0.044,0.065。紫花前胡的种间最小K2P遗传距离明显大于其种内的最大K2P遗传距离。最小距离法和NJ树鉴定结果表明前胡、紫花前胡均能与其混伪品明显区分。因此,ITS2序列可有效鉴别前胡、紫花前胡药材及其混伪品。     

基于ITS2序列鉴别牡丹皮药材及其混伪品

该研究应用ITS2序列鉴别牡丹皮药材及其混伪品,以期探索牡丹皮药材准确鉴别的新方法。提取牡丹皮及其混伪品的DNA,目标片段经PCR扩增后测序,通过CodonCode Aligner V3.7.1对测序序列进行质量分析和拼接,基于MEGA 5.0中的K2P模型计算牡丹皮与其混伪品的种内、种间遗传距离及构建系统聚类树。牡丹皮ITS2序列长度为227 bp,种内最大K2P距离为0,它与各混伪品的种间最小K2P距离为0.041,种间平均K2P距离为0.222。由NJ树可知：不同产地来源的牡丹皮药材个体聚为一支,自展支持率为99%,呈现出明显的单系性,能很好地与其混伪品芍药、川赤芍、白鲜皮、朱砂根区分开来。应用ITS2序列可以准确鉴别牡丹皮药材及其混伪品,该方法可以作为传统鉴别方法的有效补充。     

基于ITS2序列的朱砂根及其混伪品分子鉴定

目的:应用ITS2序列对朱砂根及其混伪品进行鉴定研究,为中药临床准确用药、市场规范化管理等提供依据和保障。方法:对朱砂根及其混伪品进行DNA提取、PCR扩增ITS2序列、双向测序,对序列进行比对、计算遗传距离。结果:朱砂根ITS2序列长度为217 bp,种内有10个变异位点,有9种单倍型,平均G+C含量为59.1%,除变种红凉伞外,朱砂根与其各混伪品的种间最小遗传距离均大于朱砂根种内最大遗传距离,所以利用ITS2序列可以鉴别朱砂根及其混伪品。结论 :实验结果表明ITS2序列可以鉴别朱砂根及其混伪品,但对于其与变种的关系需进一步研究。     

基于ITS2序列的羌活及其混伪品的DNA条形码鉴定

目的对羌活及其混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效。方法利用PCR测序法,对样品进行核基因ITS2片段扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建邻接(NJ)树。利用已建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。结果羌活与宽叶羌活ITS2序列长度均为228 bp,二者种内平均K2P(Kimura-2-parameter)遗传距离均远远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离;由所构建的系统聚类树图可以看出,羌活与宽叶羌活均表现出了单系性,而同时又与其他混伪品明显分开;比较ITS2二级结构发现,羌活基原植物与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别羌活及其混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。     

基于ITS2条形码的两面针药材及其混伪品的鉴别

目的 利用ITS2条形码鉴别两面针药材及其混伪品,为两面针药材鉴定提供新方法.方法 采用PCR法扩增ITS2(转录第二间隔区)序列,双向测序后运用CodonCode Aligner、MEGA软件进行数据处理,构建系统聚类树(NJ树).结果 两面针药材及其混伪品基因组DNA降解明显,但不影响ITS2条形码的PCR扩增和测序,ITS2条形码序列分析表明种内与种间遗传距离具有较大差异,基于ITS2条形码构建NJ树可鉴别两面针药材及其混伪品.结论 ITS2条形码适用于两面针药材及其混伪品的鉴别,为两面针药材快速、准确鉴定提供新方法;为两面针基原研究提供重要的分子鉴定证据;同时为DNA条形码技术应用于其他根、茎类中药材的鉴定提供了示范作用.     

应用ITS2条形码鉴定藏药镰形棘豆

目的对藏药镰形棘豆及其易混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量及临床疗效。方法提取样本基因组DNA,对核基因ITS2片段进行PCR扩增并测序,并对所得序列进行同源性比较,利用MEGA软件进行相关数据分析,并构建基于ITS2序列的邻接(NJ)树。结果镰形棘豆物种种内K2P遗传距离为0,与其他混伪品的K2P遗传距离分布于0.068~0.084,构建的NJ树表明ITS2序列能够区分镰形棘豆与其他易混伪品。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别镰形棘豆及其易混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。     

山茱萸药材及其混伪品的ITS／ITS2序列鉴定研究

利用DNA条形码技术准确快速鉴定山茱萸药材及其混伪品。方法：提取山莱萸及其混伪品的基因组DNA,利用PCR技术扩增它们的ITS序列。所得序列经双向测序后用CodonCode AlignerV3．5．4软件进行拼接和质量评估,用MEGAV5．0计算种内、种间的遗传距离,构建NJ（邻接）树鉴定山茱萸药材及其混伪品。结果：山茱萸药材的ITS序列长度均为659bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为O．005,远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离0．357。不同来源的山茱萸药材ITS2序列无变异,长度均为250bp,其与混伪品的种间平均K2P遗传距离为0．571。ITS／ITS2序列的NJ系统聚类树和BLAST比对结果均可明显区分山茱萸药材及其混伪品,表现出良好的单系性。结论：ITS／ITS2序列可准确有效鉴定山茱萸药材,为临床安全用药奠定了基础,也为其它药材的分子鉴定提供了新的思路。     

基于ITS2条形码的市售延胡索鉴别

目的：利用DNA条形码技术对市售的经过蒸煮等加工的延胡索饮片进行分子鉴定,以评价内转录间隔区2 (internal transcribed spacer 2,ITS2)序列对延胡索饮片的鉴别能力。方法：采用改良后的试剂盒法提取样品DNA,用ITS2序列引物进行PCR扩增后测序,采用CodonCode Aligner软件对测序峰图进行拼接、校对,采用MEGA 7.0软件进行种内、种间变异比对及Kimura 2-parameter (K2P)遗传距离分析,并基于邻接法构建系统聚类树。结果：约80%的样品的ITS2序列被成功扩增与测序,系统聚类树显示,所得延胡索ITS2序列和参考序列紧密聚合,具有良好的单系性,能够明显区分混伪品。结论：ITS2条形码可以准确鉴别延胡索不同加工品及其常见混伪品,为延胡索的鉴定提供分子生物学依据。     

鸡血藤及其混伪品的DNA条形码分子鉴定研究

目的采用分子生物学鉴定技术,筛选合适的DNA条形码序列,建立快速、准确鉴定鸡血藤的方法。方法采集72份鸡血藤及其混伪品的样本,分别提取样品DNA,对ITS2、matK、psbA-trnH、ITS和rbcL序列扩增、测序;计算各序列扩增成功率和测序成功率,利用MEGA7.0分析比对序列特征;基于Kimura-2-Parameter(K2P)双参数模型计算种内、种间的遗传距离评估Barcoding gap;利用Phylosuite软件构建ITS2、matK和psbA-trnH和多基因(I-M-P)联合系统发育树。结果 ITS2的扩增成功率和测序成功率最高,均为100%,matK和psbA-trnH的测序成功率亦有94.4%、91.7%,而rbcL和ITS仅为69.4%和61.1%;ITS2较其他条形码序列具有明显的Barcoding gap,且种内、种间重叠少;系统发育树显示,ITS2和psbA-trnH可将鸡血藤及其混伪品明显聚为不同分支,matK不能把滇鸡血藤和南五味子分开;I-M-P系统发育树同ITS2和psbA-trnH结果相同。结论以ITS2为主、psbA-trnH序列为辅的鉴定方法能够对鸡血藤及其混伪品进行快速、准确的鉴定,为鸡血藤临床用药的安全性和合理使用的准确性提供依据。     

基于ITS2序列的杜仲及其主要混伪品的鉴定

目的 分析杜仲及其混伪品的ITS2条形码序列,探讨杜仲及其混伪品鉴定的新方法,为杜绝市售商品药材混乱现象提供技术支撑。方法 提取样品DNA,利用PCR方法对样品进行核基因ITS2 片段扩增,采用DNA克隆测序技术对ITS2基因进行双向测序,所得序列经Seqman程序拼接后,用软件MEGA 4.1进行相关数据分析,并构建邻接（Nighbor-joining, NJ）树。利用网站已建立的ITS2数据库预测ITS2二级结构。结果 杜仲种内最大K2P遗传距离远远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离;由构建的系统聚类树图可以看出,不同来源的杜仲样品聚成一支,表现为单性系,并与其他混伪品明显分开;比较ITS2二级结构发现,杜仲与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以有效地鉴别杜仲及其混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。     

基于ITS2序列及二级结构的维吾尔族药材孜然及其混伪品鉴别

目的 应用DNA条形码技术,建立维吾尔族药材孜然及其混伪品小茴香、芫荽子的分子鉴别方法。方法 提取38批孜然及其混伪品的基因组总DNA,聚合酶链式反应（PCR）扩增内转录间隔区2（ITS2）序列并双向测序,测序结果经CodonCode Aligner软件进行序列拼接,利用MEGA软件分析序列特征,计算种内、属间遗传距离,构建邻接（neighbor-joining,NJ）系统聚类树,预测其ITS2二级结构。结果 孜然药材ITS2序列中主体单倍型为A₁,序列长度均为226 bp,鸟嘌呤（G）+胞嘧啶（C）占比为47.79%~48.23%;小茴香ITS2序列中,主体单倍型为B₁,序列长度均为224~227 bp,G+C占比为53.30%~55.36%;芫荽子ITS2序列中,主体单倍型为C₁,序列长度均为220~227 bp,G+C占比为56.82%~56.83%。孜然的种内遗传距离明显小于属间遗传距离。二级结构表明,孜然及其混伪品螺旋区的茎环大小、数目、位置及螺旋角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确地鉴别孜然及其混伪品药材,为保障孜然临床安全用药提供了有效技术手段。     

基于ITS2序列的中药材苍术种苗DNA条形码鉴定

目的:建立基于DNA条形码技术的中药材苍术种苗鉴定方法。方法:收集中药材苍术及其易混品原植物样品28份,构建苍术种苗鉴定参考核糖体内部转录间隔区2(ITS2)条形码数据库。从河北、山东、山西、内蒙古、辽宁及湖北等苍术主产地收集苍术种苗52份。通过提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序获得其ITS2条形码序列。应用PUAP 4.0软件计算种内、种间遗传距离,利用MEGA 7.0软件构建邻接树,对中药材苍术种苗进行DNA条形码鉴定。结果:中药材苍术及其易混品原植物ITS2条形码序列具有稳定的序列差异,邻接树呈现单系性,可以明显区分苍术及其易混品;基于标准参考数据库,42份苍术种苗为朝鲜苍术(80.8%),7份苍术种苗为苍术(13.5%),3份苍术种苗为白术(5.7%)。结论:基于ITS2序列可以准确区分中药材苍术及其混伪品种苗。苍术种苗基原物种鉴定结果以朝鲜苍术为主,提示苍术临床用药存在潜在安全风险。     

基于ITS2序列的市售木通药材及其混伪品的分子鉴定

目的 建立基于核糖体内部转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列的木通药材DNA条形码鉴定方法,对市售木通药材进行物种分析。方法 收集河北、安徽、贵州等地的样品总计45份,其中木通药材及其混伪品的原植物样品18份,市售木通药材样品27份。通过提取DNA、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增、双向测序获得ITS2序列,基于邻接（neighbor joining,NJ）系统发育树和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）位点进行物种鉴定分析。结果 基于木通药材及其混伪品原植物ITS2序列构建的NJ树分析结果表明,木通药材正品及其混伪品在NJ树上聚为独立的分支,木通药材正品及其混伪品在NJ树上可明确区分;基于NJ树对27份市售木通药材的物种分析表明,市售样品中仅有4份为正品木通,2份为小木通,21份为粗齿铁线莲,正品率为14.8%。结论 基于ITS2序列的DNA条形码技术可以准确区分中药材木通及其混伪品,市售木通药材物种较混乱。     

地龙及其混淆品原动物的形态及DNA双重条形码鉴定

目的基于线粒体cytochrome coxidase I(CO I)和16 S rRNA基因开发DNA双重条形码鉴定方法,由此验证并补充形态鉴定,以期建立一种准确、有效地鉴定地龙及混淆品原动物的方法。方法对收集到的66份样品依据形态特征进行初步鉴定,使用优化后的引物同时扩增CO I和16 S rRNA序列。优化一步法双重PCR实验条件。用MEGA 5.1计算地龙及其混淆品的种内、种间遗传距离,基于K2P模型构建NJ树。结果 CO I和16 S rRNA双重DNA条形码鉴定与形态鉴定结合,可准确鉴别地龙及混淆品原动物。结论形态鉴定是分子鉴定的基础,分子鉴定是形态鉴定的有力补充。二者结合可最大程度地实现地龙及其混淆品原动物的准确鉴定。DNA双重条形码鉴定方法也可为地龙药材鉴定以及其他动物药材的分子鉴定提供参考。     

川续断种质资源遗传多样性的SRAP分析

目的 开展川续断种质资源的遗传多样性研究,为合理利用川续断种质资源提供理论依据.方法 运用SRAP分子标记方法对川黔境内川续断的遗传多样性进行分析.结果 10对引物共检测到124个位点,其中102个位点具有多态性,多态位点百分率(PPL)为82.26％.川续断总的Nei's基因多样性指数(H)为0.280 0,Shannon's多态性信息指数(D为0.435 3;居群水平上川续断的PPL为53.92％,H为0.121 2～0.244 0、I为0.179 6～0.361 1,其中5个高海拔、小生境特征的居群遗传多样性指标较高.居群间的基因分化系数Gst为0.293 0,基因流(Nm)为1.206 4.基于遗传相似度,14个居群可聚为3类.结论 川续断居群的遗传多样性水平丰富,遗传变异主要存在居群内,地理位置(海拔)和气候是川续断居群遗传多样性较高的影响因素,而地理隔离(小生境)是造成居群内遗传变异高于居群间的另一因素.     

基于ITS2条形码的五加皮基原植物及其易混品的鉴定△

目的:对五加皮基原植物及其易混品进行分子鉴别,为临床用药提供科学依据。方法:从GenBank数据库下载五加皮基原植物及其易混品的ITS2序列,经CodonCode Aligner,MEGA4.0等软件进行序列拼接和分析,构建NJ(邻接)、ME(最小进化)树,并应用Koetschan等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构辅助分析。结果:基于ITS2序列的两种系统聚类树都易于将五加皮基原植物细柱五加与其易混品鉴别开;比较与细柱五加亲缘关系较近的同属易混品二级结构可以看出,细柱五加在螺旋区茎环的数目、大小、位置以及螺旋臂由中心环伸出时的转角等方面,与其易混品间具有较明显区别。结论:ITS2序列可以将五加皮基原植物及其易混品区分开,在药用植物基原鉴定方面具有重要应用价值。     

应用种子形态及DNA条形码技术鉴定黄芪及混伪品种子

目的 采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术对黄芪及混伪品种子进行鉴定。方法 收集黄芪及混伪品种子、市售黄芪种子样品共58份,利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重;提取单粒种子的基因组DNA,PCR扩增、双向测序获得ITS2及psbA-trnH序列。使用邻接法（neighbor joining,NJ）构建系统发育树,kimura二参数（kimura two-parameter,K2P）模型计算遗传距离,进行物种鉴定分析。结果 黄芪及混伪品种子在颜色、形状、长、宽、厚度及千粒重等方面存在细微差别;ITS2的测序成功率为100%,黄芪种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离;ITS2序列构建的NJ系统进化树将蒙古黄芪A.mongholicus var. mongholicus聚为独立一支,并将蒙古黄芪Astragalus membranaceus、紫花苜蓿Medicago sativa、锦鸡儿Caragana sinica、蜀葵Althaea rosea及黄芪属其他物种分开,可进行黄芪及其混伪品种子的鉴定。基于外观形态和ITS2条形码序列鉴定发现12份市售黄芪种子中有1份为斜茎黄芪。结论 基于种子形态鉴定和ITS2条形码相结合的方法可以准确鉴定黄芪及混伪品种子,为规范黄芪种源及种植生产,进而保障黄芪药材质量提供科学依据。