蒙古黄芪和膜荚黄芪种子酯酶同工酶的研究

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus m embrana-ceus(Fisch·)Bge·var·mongholicus(Bge·)Hsiao或膜荚黄芪A·m embranaceus(Fisch·)Bge·的干燥根[1]。二者的化学成分有差异导致其药效不同[2],蒙古黄芪的药效更佳,膜荚黄芪不仅药效,而且栽培管理技术、产值均不如蒙古黄芪[3]。二者在植物形态特征和生物学特征方面有明显区别,但其种子外形比较相近,肉眼难以区别。本研究利用种子酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳快速简便的鉴别了....     

蒙古黄芪、膜荚黄芪及混伪品种子的位点特异性PCR鉴别

目的 基于特异性聚合酶链式反应（PCR）建立一种可以准确、快速鉴别蒙古黄芪、膜荚黄芪种子的方法。方法 利用叶绿体基因组综合数据库（CGIR）及IdenDSS软件分别获取蒙古黄芪、膜荚黄芪的DNA特征片段，在此基础上筛选获得蒙古黄芪与膜荚黄芪的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据该位点设计蒙古黄芪特异性鉴别引物对MG-F/MG-R和膜荚黄芪特异性鉴别引物对MJ-F/MJ-R。分别建立蒙古黄芪和膜荚黄芪特异性PCR鉴别方法，优化PCR反应体系，并对该方法的专属性和适用性进行考察。结果 蒙古黄芪特异性PCR鉴别方法，采用引物对MG-F/MG-R、退火温度62 ℃、循环次数28次，经PCR扩增和凝胶电泳后蒙古黄芪在约220 bp处得到特异性条带，而膜荚黄芪和其他混伪品种子无条带；膜荚黄芪特异性PCR鉴别方法，采用引物对MJ-F/MJ-R、退火温度58 ℃、循环次数28次，经PCR扩增和凝胶电泳后膜荚黄芪扩增得到约150 bp的条带，而蒙古黄芪及混伪品无扩增产物。结论 该研究建立的特异性PCR鉴别方法，可以准确、快速对蒙古黄芪、膜荚黄芪进行种源鉴别，为黄芪种子的分类与准确鉴定提供了一定的科学依据。     

蒙古黄芪与膜荚黄芪种子形态特征及其鉴别方法的研究

目的为黄芪种子鉴定提供方法,为按中药材GAP原则制定相关标准操作过程(SOP)提供基础研究资料。方法采用肉眼直接观察、光学显微镜观察和电子显微镜进行扫描观察,比较蒙古黄芪和膜荚黄芪两种药用黄芪的种子形态特征和微观结构;通过萌发试验,比较二者的差异。结果通过肉眼和光学显微镜观察,两种黄芪种子的形态差异不明显,在电子显微镜下观察,两种黄芪种子的萌发孔形状、种脐和种皮的微观结构有明显差异;蒙古黄芪较膜荚黄芪种子硬实率高,萌发不整齐,萌发高峰滞后。结论在电子显微镜下能够对两种黄芪种子准确地做出鉴定,种脐、萌发孔、种皮的微观结构可作为鉴别两种黄芪种子的指标;种子硬实率和萌发动态规律可用于两种黄芪种子的辅助鉴别。     

一年生膜荚黄芪白粉病发病情况

白粉病是黄芪常见易发病害,严重影响黄芪的生长和药材质量。为了细致地观察黄芪白粉病中后期的病情发展情况以及研究验证常用杀菌剂甲基托布津对黄芪白粉病的抑制效果,作者对一年生膜荚黄芪做了详细的调查研究记录,对黄芪白粉病中后期发展的情况以及药物防治的效果进行了研究,为今后黄芪白粉病的研究提供了重要的参考资料。     

膜荚黄芪中黄芪甲甙的含量测定

黄芪甲甙是近年来从中药膜荚黄芪中提取得到的新三萜类化合物,具有多种生理活性。本文采用香草醛-硫酸比色法测定其含量,对其吸收波长,试剂浓度,反应温度等条件进行了选择。测定波长为544nm,其浓度范围在50～300μg符合比尔定律,并测定了江苏五个不同产地的膜荚黄芪中黄芪甲甙的含量。     

膜荚黄芪叶黄酮类成分的研究

目的研究膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.叶黄酮类成分。方法膜荚黄芪叶75%乙醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇部位采用硅胶、ODS、制备型HPLC柱进行分离纯化,根据波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果从中分离鉴定出13个化合物,分别为槲皮素(1)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(2)、鼠李柠檬素-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)、rhamnocitrin-3-O-β-neohesperidoside(4)、rhamnocitrin-3-O-β-D-glucopyranoside(1→2″)-β-D-apiofuranosyl(5)、沙苑子苷(6)、黄豆黄素(7)、4',7-二羟基-3'-甲氧基异黄酮(8)、染料木素(9)、芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷(10)、染料木苷(11)、黄豆黄苷(12)、银椴苷(13)。结论化合物5、8、13为首次在黄芪属植物中分离得到,化合物2为首次在该植物中分离得到。     

膜荚黄芪化学成分研究

目的研究膜荚黄芪Astragalus membranaceus根的化学成分。方法采用硅胶、ODS、聚酰胺、Sephadex LH-20等柱色谱方法对化合物进行分离,运用核磁共振波谱方法鉴定化合物的结构。结果从膜荚黄芪根的乙醇提取物中分离得到23个化合物,包括14个黄酮类化合物:2′-methoxyisoliquiritigenin(1)、刺甘草查耳酮(2)、甘草查耳酮B(3)、3′,4′,7-trihydroxyflavone(4)、4′,7-dihydroxyflavone(5)、3′,7,8-trihydroxy-4′-methoxyisoflavone(6)、毛蕊异黄酮(8)、芒柄花素(9)、2′,4,4′-trihydroxychalcone(10)、pendulone(11)、liquiritigenin(12)、pratensein(13)、毛蕊异黄酮苷(14)、芒柄花苷(15),8个三萜皂苷类化合物:黄芪甲苷(16)、cyclocanthoside E(17)、异黄芪皂苷II(18)、黄芪皂苷II(19)、黄芪皂苷III(20)、异黄芪皂苷I(21)、brachyoside B(22)、cycloaraloside A(23)及1个苯丙酸类化合物:4-hydroxycinnamic acid(7)。结论化合物1~7为首次从该属植物中分离得到。     

一种膜荚黄芪凝集素的分离纯化研究

目的从膜荚黄芪根中分离纯化一种凝集素。方法通过硫酸铵分级沉淀和ConA-Sepharose4B亲和色谱从膜荚黄芪根浸提液中分离纯化一种凝集素。结果经过上述两步纯化得到电泳纯的凝集素,SDS-PAGE和Superdex75凝胶过滤色谱测定该凝集素的相对分子质量分别为3.15×104和3.35×104,糖蛋白染色显示其为糖蛋白,总糖的量为10.7%。结论从膜荚黄芪根中分离纯化得到一种凝集素,该蛋白为单亚基糖蛋白,具有对兔血红细胞的凝集活性,凝集活性的比活力为391.9U/mg。     

膜荚黄芪3个苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

目的克隆膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因家族成员,分析它们在不同组织中的表达模式与毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量变化,为揭示膜荚黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累的分子机制提供理论依据。方法以膜荚黄芪总RNA为模板,采用同源克隆法和RACE技术克隆PAL基因并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术测定PAL基因在根、茎、叶中的表达量;采用HPLC法测定了根、茎、叶中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。结果从膜荚黄芪中克隆了3个PAL基因Am PAL1、Am PAL2、Am PAL3,Genbank登陆号分别为KY086279、KY086280、KY086281。Am PAL1、Am PAL2和Am PAL3的全长c DNA长度分别为2 508、2 401、2 498 bp,均含有2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸。蛋白质序列分析表明,它们均含典型的PAL酶活中心序列,与植物PAL蛋白同源,且与同属于豆科的植物PAL蛋白相似性最高。系统进化树表明,Am PAL1与Am PAL2和Am PAL3聚为不同的亚类。实时荧光定量PCR分析发现,这些基因在根、茎、叶中表达模式不同,在检测的所有组织中Am PAL1的表达量最高、Am PAL2的表达量次之、Am PAL3的表达量最低,只有Am PAL2的表达水平与毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累变化一致(即根茎叶)。结论从膜荚黄芪中克隆的Am PAL1、Am PAL2和Am PAL3是典型的PAL基因家族成员,推测它们在膜荚黄芪各组织发育过程中起着不同的作用,且Am PAL2可能参与了毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累。     

膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析。方法应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法,以膜荚黄芪根总RNA为模板克隆PAL基因。结果所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为AmPAL,Genbank登录号为EF567076。序列分析表明,AmPAL全长为2650bp,含有一个完整的2154bp开放读码框。AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,相对分子质量为7.805×104,等电点为5.96,与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且相似性都大于80%。结论首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础。     

蒙古黄芪的化学成分研究

目的:研究豆科植物蒙古黄芪的醇提取物的化学成分。方法:采用各种色谱技术对蒙古黄芪化学成分进行分离纯化,并通过理化性质和各种现代波谱技术来确定其结构。结果:从蒙古黄芪醇提物中分离得到了12个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇(1),胡萝卜苷(2),芒柄花素(3),千层纸素-A(4),汉黄芩素(5),毛蕊异黄酮(6),腺嘌呤核糖核苷(7),毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(8),(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷(9),黄芪皂苷Ⅱ(10),异黄芪皂苷Ⅱ(11),D-3-甲氧基-手-肌醇(12)。结论:化合物4和5为首次从蒙古黄芪中分离获得。     

移栽密度对蒙古黄芪生长发育及产量质量的影响

目的:黄芪是药食同源的重要中药材品种之一,为了实现黄芪规范化栽培,提高栽培成效,在黄芪道地产区甘肃省陇西县试验基地行距30 cm条件下,分别采用8,10,12,14,16 cm不同的株距栽培蒙古黄芪。方法:通过测定返青株生长发育动态及药材产量和质量,利用隶属函数综合评价,旨在确定合理的移栽密度,探寻规范的蒙古黄芪生产技术。结果:在行距30 cm条件下,移栽株距对蒙古黄芪的生长发育具有显著影响;随着株距的增大,蒙古黄芪地上部分生物量减小,根冠比增大,但单位面积药材产量下降,药材外观性状随着移栽密度的减小有所改善。在株距14 cm的栽培密度下,黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量均最高。株距8~16 cm栽培密度条件下,黄芪药材浸出物含量均优于2015年版《中国药典》标准,各株距处理综合评价指数依次为14 cm> 16 cm> 10 cm> 8 cm> 12 cm。结论:结合产量与经济效益综合评判,最优移栽株行距30 cm×14 cm(密度23.81万株/hm^2),该密度下蒙古黄芪生长发育健壮,主茎较粗,根冠比较大,产量较高,质量优异。     

黄芪花营养成分分析与资源价值评价

目的明晰黄芪花中资源性化学成分组成,探讨其资源潜在利用价值。方法采用分光光度法对黄芪花中总多糖、水溶性蛋白进行分析评价;采用HPLC-PDA/ELSD法对黄芪花中单糖寡糖组成及含量进行分析;采用GC-MS法对黄芪花中挥发性成分及脂肪酸类成分和含量进行分析;采用UPLC-TQ-MS法对黄芪花中核苷类及氨基酸类组成及含量进行分析。结果黄芪花中含有多糖类(47.02 mg/g)、水溶性蛋白质(470.66 mg/g)、果糖(45.46 mg/g)、葡萄糖(8.71 mg/g)、蔗糖(1.05 mg/g)营养物质;检测出黄芪花中32种挥发性成分,其中以含氧衍生物为其主要组成成分;6种核苷类和15种游离氨基酸类资源性化学成分,总量分别达2.77和6.52 mg/g。在黄芪花中还检出8种脂肪酸类成分,其中肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸为其主要组成成分。结论阐明了黄芪花中各类型营养成分的组成及含量,为黄芪花的系统利用与精细化开发提供了科学依据。     

蒙古黄芪中2种具有免疫活性的可溶性粗蛋白提取工艺优选

目的优选蒙古黄芪Astragalus membranaceus mongholicus中2种免疫活性蛋白Am PR10-16k Da和HQGP-2的最佳提取工艺。方法以蒙古黄芪中所含可溶性蛋白Am PR10-16k Da和HQGP-2二级结构的圆二色性对提取温度和提取溶剂种类进行考察;对该2种蛋白提取条件进行单因素考察,并采用L9(34)正交试验设计法,采用Image凝胶图形分析软件以Am PR10-16k Da和HQGP-2在SDS-PAGE凝胶图中的蛋白条带灰度值(峰面积)为指标,考察提取温度、料液比、提取时间、提取溶剂(p H值)、药材粒度、提取次数对Am PR10-16k Da和HQGP-2蛋白条带灰度值的影响,从而确定Am PR10-16k Da和HQGP-2的最佳提取工艺,辅以其免疫抑制率(CCK-8法)和可溶性蛋白定量测定(BCA法)作为佐证。结果建立了蒙古黄芪中Am PR10-16k Da和HQGP-2的最佳提取工艺:向药材粉末(过4号筛)5.0 g中加入16倍量Tris-HCl,在温度40℃条件下恒温提取60 min,以100 r/min搅拌。蒙古黄芪蛋白质提取率为65 mg/g,且质量浓度为90μg/m L粗蛋白的免疫抑制率为90.90%。结论优化的提取工艺能正确反映Am PR10-16k Da和HQGP-2收率的最高相对量,为Am PR10-16k Da和HQGP-2的进一步研究提供了稳定、合理、可行的提取工艺。     

蒙古黄芪药材、生饮片及其炮制品质量差异性研究

目的对蒙古黄芪原药材、生饮片及其炮制品进行质量差异性研究。方法选取道地蒙古黄芪的药用部位根,制备成生饮片及炮制品,进行炮制前后黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、总多糖、总黄酮和总皂苷量的比较研究,分析质量差异性原因。结果成分量由高到低分别为黄芪甲苷:原药材生饮片蜜炙品酒炙品盐炙品炒制品;毛蕊异黄酮苷、芒柄花素和总多糖:原药材生饮片酒炙品盐炙品蜜炙品炒制品;总黄酮:原药材酒炙品生饮片盐炙品蜜炙品炒制品;总皂苷:原药材蜜炙品生饮片酒炙品盐炙品炒制品。结论温度和辅料保护可能是影响蒙古黄芪原药材、生饮片及其炮制品质量差异的主要因素。     

纳米黄芪粉的显微结构和有效成分溶出的研究

目的对黄芪药材进行纳米级粉碎的研究。方法采用HSCS超细粉碎机进行纳米粉碎,Zeta PALS光散射粒度分布及电位分析仪进行粒度分析和Zeta电位测定,并采用显微观察法对药物组织结构进行显微特征的观察。结果纳米黄芪悬浮液中固体颗粒平均粒径为81.7 nm,大部分细胞壁被破碎,黄芪皂苷和多糖直接进入水中。结论黄芪纳米化后可促进有效成分的溶出。     

不同产地蒙古黄芪茎叶UPLC指纹图谱建立及化学模式识别研究

目的 建立蒙古黄芪Astragalus membranaceus茎叶UPLC指纹图谱及含量测定方法,并对不同产地多个批次蒙古黄芪茎叶样品进行比较分析,为蒙古黄芪茎叶资源的利用与质量控制提供参考。方法 采用ACQUITY^TM UPLC BEH C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）,以0.1%甲酸水-乙腈为流动相,梯度洗脱,检测波长为350 nm,建立蒙古黄芪茎叶指纹图谱;采用电喷雾离子源-四极杆-飞行时间质谱（ESI-Q-TOF/MS）对共有峰进行鉴定;同时建立其含量测定方法。结合聚类分析和主成分分析法,对不同批次蒙古黄芪茎叶进行质量评价。结果 建立了蒙古黄芪茎叶UPLC指纹图谱,共标定了25个共有峰,并鉴定了其中13个色谱峰,均为黄酮类成分;建立了异槲皮苷、紫云英苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量测定方法;17批黄芪茎叶的相似度在0.933～0.987;通过聚类分析将样品分为2大类;主成分分析与聚类分析结果一致。结论 通过UPLC指纹图谱结合化学模式识别方法,建立了一种快速、有效的蒙古黄芪茎叶品质评价方法,可为蒙古黄芪茎叶的资源化利用提供客观依据。     

一株恒山产蒙古黄芪内生真菌Penicillium griseofulvum次生代谢产物的分离和菌种鉴定

目的:研究恒山黄芪内生真菌的次生代谢产物。方法:采用反复硅胶柱色谱法结合羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)色谱法等进行分离纯化,并通过理化常数测定和光谱分析鉴定其化学结构。结果:从恒山黄芪内生真菌Penicillium griseofulvum的发酵液中分离得到8个次生代谢产物,经结构解析,分别为23-methylergosta-7,22-diene-3β,5α,6α-triol(1),5α,8α-epidioxy-ergosta-6,9(11),22-trien-3β-ol(2),cyclotryprostatins A(3),cyclotryprostatins C(4),trypacidin(5),monomethylsulochrin(6),fumiquinazoline D(7)和fumiquinazoline J(8)。结论:所有化合物均首次从恒山黄芪内生真菌中分离得到。     

不同生长年限子洲黄芪休眠期的质量差异

目的：比较不同生长年限子洲黄芪休眠前期和休眠后期的有效成分含量,揭示子洲黄芪在休眠期各有效成分的变化规律,确定子洲黄芪的最适采收期。方法：采用随机取样法收集8批不同生长年限休眠前期及休眠后期的子洲黄芪,以黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和水溶性浸出物质量分数为指标,结合聚类分析法分析其质量差异。结果：各指标含量测定结果显示,随生长年限的增加,各成分含量呈规律性动态变化。黄芪甲苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量分数均在生长5年时达到最高值,分别为0.166%、0.079%;水溶性浸出物质量分数在生长7年时达到最高值,为21.290%。对不同生长年限休眠前期和休眠后期的各成分含量进行对比发现,休眠后期黄芪甲苷质量分数显著下降,且下降幅度逐年增大,生长7年时下降幅度最大,为54.09%;毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量分数增加,生长5年时增幅最大,为145.83%;水溶性浸出物质量分数生长7年时增幅最大,为18.40%。结论：子洲黄芪有效成分积累受生长年限及采收时间的影响,且变化趋势不一致,如以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为指标,宜在生长5年休眠后期采收;如以黄芪甲苷为指标,宜在生长5年休眠前期采收;若综合考虑黄芪甲苷及毛...     

应用种子形态及DNA条形码技术鉴定黄芪及混伪品种子

目的 采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术对黄芪及混伪品种子进行鉴定。方法 收集黄芪及混伪品种子、市售黄芪种子样品共58份,利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重;提取单粒种子的基因组DNA,PCR扩增、双向测序获得ITS2及psbA-trnH序列。使用邻接法（neighbor joining,NJ）构建系统发育树,kimura二参数（kimura two-parameter,K2P）模型计算遗传距离,进行物种鉴定分析。结果 黄芪及混伪品种子在颜色、形状、长、宽、厚度及千粒重等方面存在细微差别;ITS2的测序成功率为100%,黄芪种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离;ITS2序列构建的NJ系统进化树将蒙古黄芪A.mongholicus var. mongholicus聚为独立一支,并将蒙古黄芪Astragalus membranaceus、紫花苜蓿Medicago sativa、锦鸡儿Caragana sinica、蜀葵Althaea rosea及黄芪属其他物种分开,可进行黄芪及其混伪品种子的鉴定。基于外观形态和ITS2条形码序列鉴定发现12份市售黄芪种子中有1份为斜茎黄芪。结论 基于种子形态鉴定和ITS2条形码相结合的方法可以准确鉴定黄芪及混伪品种子,为规范黄芪种源及种植生产,进而保障黄芪药材质量提供科学依据。