改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞

背景：乳牙牙髓干细胞具有极强的增殖活力,可以在短期内获得组织工程需要的细胞量。 目的：比较传统酶消化法和改良酶消化法获取人乳牙牙髓干细胞的成功率及生物学特性。 方法：取无龋滞留乳切牙12 颗,随机数字表法均分为两组,分别应用传统酶消化法和改良酶消化法分离获取乳牙牙髓细胞,在不同代次细胞中检测细胞扩增天数、收获量、生长曲线、倍增时间、克隆形成率、细胞表面特异标记物STRO-1、CD146、CD34 和CD45 的表达。细胞成骨、成脂诱导分化能力及通过检测碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白表达水平,判定细胞牙向分化潜能。 结果与结论：两组细胞生长曲线,扩增天数、细胞收获量及细胞倍增时间相比,差异有显著性意义(P <0.05);牙向分化实验结果显示,改良酶消化法碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白较传统酶消化法和对照组而言呈强阳性表达。然而,两组在克隆形成率、细胞表面特异标记物及多项诱导分化等方面差异无显著性意义(P > 0.05)。说明改良酶消化法与传统酶消法相比,可在较短时间内完成同源乳牙牙髓干细胞体外扩增培养,可为牙齿再生治疗提供高质量种子细胞,是乳牙牙髓干细胞体外培养的可靠方法。     

酶解组织块法原代培养人牙周膜干细胞和牙髓干细胞

背景：酶解组织法是一种高效的原代细胞培养方法,利用该法可提高牙周膜干细胞和牙髓干细胞的培养成功率。 目的：比较牙周膜干细胞和牙髓干细胞的原代培养成功率、细胞形态、生长特征,并对其进行多种细胞标志的鉴定。 方法：取因正畸需要拔除健康牙20颗,其中16颗用于牙周膜干细胞原代培养,4颗用于牙髓干细胞培养。酶解组织块法培养两种细胞,MTT法检测两种细胞的生长曲线,利用RT-PCR法、细胞免疫组化法、细胞免疫荧光法鉴定两种细胞的标志。 结果与结论：牙髓干细胞的原代培养成功率明显高于牙周膜干细胞,显示更快的生长能力。通过酶解组织法分离纯化的两种干细胞均显示正常的细胞形态和生长特征,表达相应的细胞标志CD105,CD73,波形丝蛋白vimitin,Stro-1,不表达角蛋白CK-17和CD45。提示酶解组织块法是一种高效的原代培养牙周膜干细胞和牙髓干细胞的方法。     

冷酶消化法在分离和培养新生大鼠Schwann细胞的应用

Schwann细胞(SCs)是公认的周围神经组织工程的种子细胞,在周围神经损伤后的再生中扮演着重要的角色。为了快速分离和培养大量的SCs,本研究采用冷酶消化法对Wister乳鼠坐骨神经的细胞进行分离和培养,结果得到的细胞数量超过106,经S-100蛋白免疫组化染色鉴定,SCs的纯度超多了90%。从培养细胞的形态和生长曲线可见,冷酶消化法是一种简单快捷地分离SCs的方法,使用该法得到的SCs具有良好的生物学特性,并在细胞的分离时间、数量、纯度以及生物活性等方面,均达到了实用要求。     

冷酶消化法分离和培养新生大鼠许旺细胞

背景：常规酶消化法在许旺细胞分离培养实验中应用较多,但由于胰蛋白酶在37 ℃超过30 min对细胞有毒性作用,会对许旺细胞的数量和纯度有一定的影响。 目的：探索快速分离和培养大量许旺细胞的新方法。 方法：采用4 ℃胰蛋白酶消化剥离好的乳鼠坐骨神经6~18 h分离许旺细胞,培养一段时间,进行MTT实验绘制细胞生长曲线和苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观察许旺细胞的形态,并对阳性细胞进行计数。 结果与结论：结果得到的细胞数量超过1×10⁶,经抗S-100蛋白免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,细胞纯度达到90%以上。从培养的细胞形态和细胞生长曲线可见,冷酶消化法是一种简单快捷的方法,其细胞具有良好的生物学特性,在分离时间、细胞数量和纯度、细胞的生物活性均达到临床上的要求。     

毛囊干细胞的分离及培养方法研究

目的建立一种分离效率高、创伤小的毛囊干细胞分离方法，筛选毛囊干细胞体外培养的最优条件，考察毛囊干细胞的体外增殖活性。方法获取兔胡须部皮肤全层，比较2种不同分离方法获得细胞的贴壁、增殖及克隆形成情况。通过免疫组化的方法检测毛囊干细胞β1整合素、CK19表达情况。选用MTT法和乳酸脱氢酶来间接反映毛囊干细胞的增殖能力。分析细胞周期考察细胞增殖过程中各期细胞的分布。观察血清浓度梯度条件培养液对毛囊干细胞增殖的影响。结果“两步酶”法的分离能获得大量细胞且细胞迅速贴壁，克隆迅速形成。获取的毛囊干细胞胞浆中有β1整合素、CK19的阳性表达。毛囊干细胞生长曲线及细胞周期都表明毛囊干细胞有高增殖能力。毛囊干细胞增殖表现出血清浓度的依赖。结论“两步酶”法是一种分离效率高、创伤小的方法，能够获取大量高表达β1整合素、CK19的毛囊干细胞。毛囊干细胞在适当条件下表现为高增殖能力，其生长有一定的血清依赖性。     

骨组织块法和酶消化法联合培养人成骨细胞

背景：成骨细胞培养难度大,不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。 目的：探讨理想的人成骨细胞体外培养的方法。 方法：取人髂骨松质骨,同时结合骨组织块法和酶消化法分离培养人成骨细胞。 结果与结论：分离培养的人成骨细胞生长状态良好,纯度较高。细胞贴壁生长,形态多样化,多呈多边形、纺锤型、梭形、三角形,胞浆丰富向外伸展出生长突,具有典型的成骨细胞形态特征;细胞增殖良好,碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色阳性。说明联合骨组织块法和酶消化法可成功分离培养人成骨细胞,是进行人成骨细胞体外培养较为理想的方法。 关键词：成骨细胞;原代培养;碱性磷酸酶;组织块法;酶消化法 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.07.002     

组织块法与酶消化法培养大鼠毛囊干细胞的比较

背景：研究证实毛囊干细胞比毛囊间表皮干细胞更有增生能力,近年来受到广泛关注,成为种子细胞的研究热点。 目的：比较组织块法和两步酶法培养大鼠毛囊干细胞的生物学特性。 方法：体式显微镜下分离大鼠触须部的毛囊,分别用组织块法和两步酶法培养毛囊干细胞,利用反复差速贴壁法纯化细胞,定期观察细胞生长状况及形态,流式细胞仪检测第3代毛囊干细胞CD34、β1整合素的表达。 结果与结论：两步酶法获得的细胞生长速度快,获得的细胞量多,而组织块法获得的细胞生长速度较慢,获得的细胞量也少。流式细胞仪分析显示酶消化法培养组PE-CD34、FITC-β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46±4.73)%,组织块法培养组相应为(19.20±11.53)%和(363.57±14.42)%,两组间差异有显著性意义(P < 0.05)。总的来说,两种方法均能培养出实验所需毛囊干细胞,可根据不同实验需求选择恰当的培养方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

人胚心肌细胞的分离与体外培养

由于在体内研究人心肌细胞具有一定的局限性，因此心肌细胞的分离与体外培养成为一项重要技术。把成年大鼠心肌细胞分离并维持原代培养已有20多年的历史。但是，由于成熟心肌细胞为终末分化细胞，并且以往的分离和培养方法很不理想，存在着分离步骤烦琐、培养液复杂和纯度不高及细胞不能增殖等问题，而人胚心肌细胞的分离和体外培养的方法未见系统报道，因此我们对此进行描述。     

肝干细胞分离培养技术的研究进展

干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,存在于许多组织中;肝干细胞在肝脏的形成和再生中有重要作用,可以分化为肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞等.随着对其特性的深入了解,它将代替肝细胞移植和肝脏移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源,在体外对肝干细胞进行分离纯化和培养扩增,将对肝的细胞移植、组织工程和基因治疗等有重要作用.     

无血清悬浮分离培养法分离、培养、鉴定脊髓源性神经干细胞

背景：目前临床上尚未发现完全治愈脊髓损伤,使其达到结构及功能恢复的治疗方法。已有的神经营养因子治疗方法促进神经细胞再生的效果有限,而干细胞移植治疗可能是现阶段修复脊髓损伤的有效方法之一。 目的：无血清悬浮分离培养法培养胎鼠脊髓源性神经干细胞,采用形态学、免疫荧光技术和多向分化能力进行神经干细胞鉴定。 方法：应用悬浮分离培养法,培养纯化孕13.5 d C57BL/6胎鼠的脊髓源性神经干细胞。倒置显微镜观察细胞形态学变化;CCK-8法检测细胞的增殖能力。免疫荧光技术检测Nestin和Sox2表达;使用自然分化法验证第4代脊髓源性神经干细胞多向分化特性,明确其分化能力。 结果与结论：采用无血清悬浮分离培养法可以顺利获取脊髓源性神经干细胞。培养的脊髓源性神经干细胞增殖活性良好,高表达Nestin和Sox2,且两种标记物与DAPI核染高度均匀吻合,说明细胞纯度高。进一步诱导分化显示,细胞可以向GFAP和Tuj1阳性细胞分化,证明脊髓源性神经干细胞分化潜能较好。该实验可建立一套体外培养脊髓源性神经干细胞分离、培养、纯化及鉴定体系,为后续神经干细胞的应用研究奠定基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程      

改良原代培养方法提高人胎盘绒毛膜间充质干细胞的产量

目的 建立获得大量P0代人胎盘绒毛膜间充质于细胞(hpcMSCs)培养方法.方法 从胎盘绒毛膜分离出hpcMSCs,经初次培养和再次培养7d后,将原培养瓶中培养基、未贴壁组织和冲洗生理盐水离心后分别进行再次培养和第3次培养.用倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8测定细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面标记,成脂、成骨诱导分化试剂盒鉴定细胞的分化潜能.结果 获得的hpcMSCs均为成纤维细胞样贴壁细胞,每例胎盘获得(25.54±3.38)×106个P0代细胞,初次培养、再次培养和第3次培养获得的细胞数分别为(11.73±2.09)×106、(11.12±1.42)×106和(2.69±0.71)×106,培养时间分别为(12.00±0.64)d、(8.87±0.63)d和(12.33±0.80)d.再次培养时间和获得细胞数同初次培养、第3次培养差异均有统计学意义(均P＜0.05),初次培养和第3次培养的时间差异无统计学意义(P＞0.05),但第3次培养有时间延迟的趋势.3次培养的每培养瓶获得细胞数分别为(1.12±0.15)×106、(2.10±0.16)×106和(1.04±0.16)×106,再次培养获得细胞数同初次培养、第3次培养差异均有统计学意义(均P＜0.05),初次培养和第3次培养获得细胞数差异无统计学意义(P＞0.05),但第3次培养有细胞数量减少的趋势.3次培养的细胞生长曲线和表面标记的表达率无差异,成骨、成脂诱导分化检测均呈阳性.结论 一份绒毛膜标本,通过3次培养,获得的P0代hpcMSCs细胞数量比初次培养翻倍,本方法可为再生医学提供足够的种子细胞.     

低氧时脂肪间充质干细胞如何向跟腱细胞分化

背景：脂肪间充质干细胞在跟腱组织工程再生领域越来越受到重视,研究其诱导分化的有利环境(氧体积分数)尤为必要。 目的：将脂肪间充质干细胞与跟腱细胞在不同氧体积分数条件下间接共培养,比较氧体积分数对脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化能力的影响。 方法：无菌条件下获取SD大鼠跟腱细胞。SD大鼠脂肪间充质干细胞直接购买,经培养传至第1代后,与跟腱细胞一起在常氧(体积分数20%)和低氧(体积分数2%)条件下经Transwell间接共培养体系共培养。在培养7,14和21 d,实时荧光定量PCR检测跟腱细胞的特异指标胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ,Tenomodulin,Thrombospondin-4,Scleraxis基因相对表达量,免疫荧光染色法检测胶原蛋白Ⅰ和Thrombospondin-4蛋白表达量。 结果与结论：脂肪间充质干细胞与跟腱细胞经间接共培养后,低氧组检测到的跟腱细胞的相关特异指标在基因和蛋白水平上表达水平均高于常氧组。提示氧体积分数可显著影响脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化的潜能,低氧是脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化的有利条件之一。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

人子宫内膜干细胞的分离、培养及鉴定

目的 分离、培养子宫内膜干细胞并进行鉴定.方法 采用酶消化和机械方法相结合分离人子宫内膜细胞,两次滤网过滤分离基质细胞和上皮细胞.采用有限稀释法培养基质细胞和上皮细胞,观察细胞的形态及生长特性,免疫荧光检测波形蛋白和细胞角蛋白表达情况.原代培养15 d后,计算细胞克隆形成率,流式细胞术检测抗原CD133、CD34、CD45、CD90、CD73及CD29表达.结果 基质细胞呈纤维样细胞形态,排列呈辐射状,免疫荧光显示其波形蛋白表达阳性;原代培养15 d后,细胞克隆形成率达(1.34±0.44)％.上皮细胞呈多角形或椭圆形,免疫荧光显示其细胞角蛋白表达阳性;原代培养15d后,未发现克隆形成.流式细胞术检测克隆形成的基质细胞CD29、CD90、CD73表达阳性,CD34、CD45、CD133表达阴性.结论 人体存在少量具有克隆形成能力和高度增生潜能的子宫内膜干细胞,这些干细胞也可能来源于骨髓间充质干细胞.     

猴表皮干细胞的分离和培养

目的： 探索猴表皮干细胞分离纯化和培养方法。 方法: 将猴皮肤标本剪成皮条,加入0.25％胰酶浸泡过夜；然后去除角质层，刮上皮面获取表皮细胞进行培养。取第2-4代的细胞,经消化后，用Ⅳ型胶原黏附法获得为快吸附的表皮细胞。对快吸附的表皮细胞行流式细胞仪、免疫组化和RT-PCR检测。 结果: 快吸附细胞从mRNA转录水平及蛋白表达水平均呈现表皮干细胞的特性：β1整合素、K15和α6整合素阳性，而CD71和K1/K10阴性。 结论: 所采用的分离纯化方法和培养条件适合猴表皮干细胞的分离纯化及生长。     

人视网膜母细胞瘤肿瘤干细胞的分离培养

目的：体外分离培养人视网膜母细胞 瘤肿瘤干细胞（RTSC），建立RTSC的鉴定方法。方法：新鲜Rb组织经酶消化法获取单个瘤细胞，接种于无血清化学限定培 养基培养。对培养7-15 d的神经样球体，分别进行克隆形成、增殖能力、分化能力等干细 胞特性鉴定；采用RT-PCR及免疫荧光等方法对RTSC及其分化细胞的特性进行鉴定。结果:Rb肿瘤在无血清培养基中可以形成神经球体样肿瘤球体，后者可以多次传代，具有自我再续 能力。RTSC来源的神经球体表达神经干细胞或视网膜早期发育的相关基因Nestin、CD133、B mi-1、Pax6、RX及Chx10。在分化培养基上，肿瘤球体内细胞可以向神经元和胶质细胞分化 ，形成神经网络样结构，该分化细胞部分表达GFAP、MAP2、GAP43、PKC-a、Syntaxin及Reco verin等。RTSC分化后的神经样细胞为谷氨酸能神经元细胞。 结论：本结果揭示Rb中存在具有自我增殖及分化能力的视网膜前体细胞样 的肿瘤干细胞。此类细胞可能是Rb恶性增殖的根源，也将成为Rb治疗的新靶点。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

背景：目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。 目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。 方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞,通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化,在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。 结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出的细胞CD34阳性率为17.5%,CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%,与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法,两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞,CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

两种方法分离子宫内膜干细胞的比较

背景：目前国内外尚无统一方法分离培养子宫内膜干细胞,实验重复性较差。 目的：寻找一种方便、高效、科学的体外分离子宫内膜干细胞的方法。 方法：采用混合法(机械和酶消化相结合)及胶原酶Ⅰ法分离子宫内膜干细胞,比较两种方法分离所得活细胞数及细胞生长周期的差异;并采用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测CD90和CD117的表达情况。 结果与结论：经过15 d的原代培养后,子宫内膜干细胞形态呈圆梭形,细胞贴壁平铺生长,具有成纤维细胞形态,细胞排列无极性;细胞化学染色及RT-PCR法均检测到干细胞标志物CD90和CD117表达,证明培养的细胞具有干细胞特性。混合法获得的活细胞数多于胶原酶Ⅰ法,其差异有显著性意义 (P < 0.01),两种方法分离所得的细胞具有相同的生长周期。结果说明混合法是一种方便、高效、科学的体外分离子宫内膜干细胞的方法。