高糖通过ERK1/2通路对人肾小管上皮细胞脂联素表达的影响

目的通过体外培养人肾小管上皮细胞(human proximal tubular epithelial cells,HK-2),观察高糖对HK-2脂联素(adiponectin,ADPN)表达水平的影响并探讨其可能机制。方法将培养的HK-2细胞分为4组:①低糖对照组(5.6 mmol/L葡萄糖);②PD98059(职K1/2信号传导通路的抑制剂)组(5.6 mmol/L葡萄糖+50μmol/L PD98059);③高糖组(30 mmol/L葡萄糖);④高糖+PD98059组(30 mmol/L葡萄糖+50μmol/L PD98059)。各组分别培养48 h后荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测HK-2细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activator receptor,PPAR-γ)及脂联素mRNA的表达,免疫印迹(Western blotting)法检测各组脂联素蛋白的表达水平。结果 HK-2细胞表达脂联素;PD98059组与低糖对照组相比,PPAR-γmRNA及脂联素的mRNA和蛋白表达的差异均无统计学意义(均P0.05);与低糖对照组相比,高糖组PPAR-γmRNA及脂联素mRNA和蛋白表达均显著降低,差异均有统计学意义(均P0.05);与高糖组相比,高糖+PD98059组PPAR-γmRNA及脂联素mRNA和蛋白表达均显著升高,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论高糖可以降低HK-2细胞脂联素mRNA和蛋白的表达;高糖作用于HK-2细胞可能是通过激活ERK1/2信号传导通路降低PPAR-γ的表达,从而影响其脂联素的表达。     

姜黄素通过PPAR-γ途径促进人肾癌细胞的调亡

目的观察姜黄素对人肾癌细胞株A498细胞增殖和凋亡的影响,并探讨PPAR-γ途径在其中的作用。方法姜黄素(10、50、100μmol/L)处理A498细胞12、24、48h。采用MTT法测定细胞活力,并计算肿瘤细胞抑制率,流式细胞术测定细胞凋亡。实时定量PCR和Western Blot分别检测Bcl-2、Bax及PPAR-γmRNA和蛋白的表达。观察PPAR-γ阻断剂GW9662对姜黄素作用的影响。结果姜黄素(10、50、100μmol/L)分别处理人肾癌细胞株A498细胞24、48、72h后,以浓度和时间依赖的方式抑制细胞增殖促进细胞凋亡,同时以浓度依赖的方式下调了A498细胞中Bcl-2的表达,增加了Bax和PPAR-γ的表达。GW9662部分地消除了姜黄素对A498细胞增殖和凋亡的影响。结论姜黄素抑制人肾癌细胞增殖促进其凋亡,其机制涉及到PPAR-γ途径。     

厄贝沙坦对高糖诱导的小鼠足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6表达的影响

目的研究血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(angiotensinⅡreceptor blockers,ARB)厄贝沙坦对高糖诱导的条件永生化小鼠足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel,TRPC6)表达的影响。方法首先体外培养条件永生化小鼠足细胞,分为高渗对照组(甘露醇30 mmol/L+葡萄糖5 mmol/L),正常对照组(葡萄糖5 mmol/L)、实验组(葡萄糖浓度分别为15 mmol/L、25 mmol/L和35 mmol/L),免疫细胞化学检测小鼠足细胞TRPC6分布,Western Blot和RT-PCR分别检测小鼠足细胞TRPC6蛋白和mRNA的表达;其次使用高糖(25 mmol/L)在不同时间点(0 h,12 h,24 h,48 h)作用于足细胞,Western Blot和RT-PCR分别检测小鼠足细胞TRPC6蛋白和mRNA的表达;最后将细胞分为5组:正常对照组、高糖组、高糖+厄贝沙坦组(10~(-7)mol/L)、高糖+厄贝沙坦组(10~(-6)mol/L)、高糖+厄贝沙坦组(10~(-5)mol/L),倒置显微镜下观察不同浓度厄贝沙坦对高糖诱导的足细胞形态学变化,Western Blot和RT-PCR分别检测小鼠足细胞TRPC6蛋白和mRNA的表达。结果①免疫细胞化学检测可见,随着葡萄糖浓度的增加,TRPC6主要集中表达于足细胞胞膜,沿足突分布更加明显;Western Blot和RT-PCR检测到TRPC6蛋白和mRNA表达量逐渐增加,以25 mmol/L变化最明显。②高糖刺激足细胞后,与0h比较,随着刺激时间的延长,足细胞TRPC6蛋白和mRNA表达量明显增加(P0.05),在48 h达到高峰,呈一定的时间依赖性。③与正常对照组比较,高糖诱导的TRPC6表达明显增高(P0.05)。与高糖组比较,高糖+厄贝沙坦组随厄贝沙坦浓度的增加,TRPC6蛋白和mRNA表达量明显下调(P0.05),呈浓度依赖性。结论高糖可诱导足细胞TRPC6表达增加,厄贝沙坦对高糖诱导的足细胞损伤具有保护作用,其机制可能是通过下调足细胞TRPC6的表达来实现的。     

脂联素及其受体对糖尿病肾病大鼠的保护作用

目的 探讨脂联素（ADPN）及其受体（AdipoR）对糖尿病肾病的保护作用及其可能机制。 方法 （1）64只雌性SD大鼠被随机均分入对照组和实验组：实验组一次性空腹腹腔注射链脲菌素（STZ) 60 mg/kg,诱导糖尿病大鼠模型;对照组腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液。于糖尿病大鼠成模后第2、6、10、12周两组分别测体质量、肾质量、空腹血糖、24 h尿白蛋白排泄量;心内采血检测空腹血清胰岛素;ELISA法检测血、尿脂联素浓度;取肾脏常规制作PAS染色,免疫组化SP法检测肾脏脂联素受体1和2（AdipoR1和AdipoR2）的表达。（2）将NRK-52E细胞分别用含5 mmol/L葡萄糖（正常对照组）、30 mmol/L葡萄糖（高糖组）、30 mmol/L葡萄糖+不同浓度ADPN（终浓度分别为1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L）培养,12 h后RT-PCR法检测单核细胞趋化蛋白1（MCP-1） mRNA表达。 结果 （1）造模成功后6、10、12周实验组血清和尿ADPN水平均高于对照组（P < 0.01）,并随着肾脏病变进展而逐渐升高。（2）实验组各时期AdipoR1和AdipoR2在肾脏的表达高于对照组,并随时间逐渐增强,其与血清脂联素水平呈正相关（r = 0.666,P < 0.01;r = 0.684,P < 0.01）。（3）MCP-1 mRNA在高糖组表达较高,加入脂联素以后MCP-1 mRNA表达显著减少（P < 0.05）。 结论 血和尿脂联素水平随糖尿病肾病病程进展而升高,与AdipoR1和AdipoR2的表达亦呈正相关,推测脂联素通过AdipoR直接作用于肾小管,通过减少MCP-1的表达对肾脏起保护作用。     

高糖对大鼠肾系膜细胞泛素及泛素化蛋白表达的影响

目的 探讨高糖对大鼠肾系膜细胞泛素及泛素化蛋白表达的影响。 方法 将大鼠HBZY-1肾系膜细胞进行体外培养,高糖作为刺激因子,分别设正常对照组(5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖组（10、20、30 mmol/L葡萄糖）、甘露醇组。刺激12、24、48 h后,分别用实时定量PCR法和Western印迹法检测各组系膜细胞泛素mRNA和泛素化蛋白的表达。 结果 泛素化蛋白多以大分子蛋白为主。与正常对照组比较,30 mmol/L葡萄糖刺激24 h和48 h后泛素化蛋白的表达分别增加36％和52％（均P ＜ 0.01）;20 mmol/L和30 mmol/L葡萄糖作用48 h泛素化蛋白的表达分别增加31％和52％（均P ＜ 0.01）;高糖作用24、48 h,泛素mRNA的表达显著增加（均P ＜ 0.05）。 结论 高糖呈时间浓度依赖性地促进大鼠肾系膜细胞泛素mRNA及泛素化蛋白的表达,增加泛素蛋白酶体途径活性。     

过氧化物酶体增殖物活化的受体γ对肝星状细胞作用机制的研究

目的探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)对肝星状细胞(HSC)生物学特性的影响及其作用机制。方法用MTT法和流式细胞仪检测对照组、罗格列酮组、GW9662+罗格列酮组、GW9662组大鼠肝星状细胞的增殖和凋亡情况;采用RT-PCR方法检测各组PPARγ及Ⅰ型前胶原mRNA表达;用免疫组织化学法和Western blot法检测PPARγ及Ⅰ型胶原蛋白表达;结果罗格列酮组的肝星状细胞增殖率MTY(0．49±0．06)较对照组(1．00±0．045)、GW9662组(0．89±0．043)和罗格列酮+GW9662组(0．78±0．049)明显减弱,凋亡率明显增高(P<0．05);罗格列酮组PPARγmRNA表达(1．63±0．179)显著高于对照组(0．46±0．021)、GW9662组(0．41±0．01)和罗格列酮+GW9662组(0．45±0．20)(P<0．05),罗格列酮组Ⅰ型前胶原mRNA表达(0．32±0．02)与对照组(1．61±0．09)、GW9662组(1．81±0．22)和罗格列酮+GW9662组(1．37±0．01)相比显著降低(t值分别为15．59,14．68,8．07,P<0．01);其他各组之间PPAR-γ和Ⅰ型前胶原mRNA的表达差异无统计学意义(P>0．05)。PPARγ及Ⅰ型胶原蛋白表达所得结果与RT-PCR结果相一致。结论PPARγ特异性激动剂罗格列酮可以增加PPARγ的表达。抑制HSC表达Ⅰ胶原,抑制HSC增殖,诱导HSC凋亡,PPARγ配体对于缓解肝脏纤维化具有一定的作用。     

血管紧张素1-7对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响及其机制

目的 研究血管紧张素1-7（Ang 1-7）对高糖诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响及其可能机制。 方法 培养HK-2细胞分组如下：对照组（N组）、高糖组（H组）、高糖+Ang 1-7组（A组）、高糖+Ang 1-7+A779组（D组）、高糖+吡格列酮组（P组）。Western印迹检测各组HK-2细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的蛋白表达;实时定量PCR检测HK-2细胞PPAR-γ及α-SMA的mRNA表达;免疫荧光检测α-SMA表达。 结果 Ang 1-7可上调高糖刺激下HK-2细胞PPAR-γ蛋白及mRNA表达（P < 0.05）;抑制高糖刺激的α-SMA蛋白及mRNA表达（P < 0.05）。这种作用与PPAR-γ激动剂吡格列酮类似。给予Mas受体抑制剂A779后,Ang 1-7的上述作用可被部分抑制。 结论 Ang 1-7在体外可通过上调PPAR-γ表达,从而部分抑制高糖诱导的α-SMA表达,实现其抑制转分化的作用,而这种作用部分通过Mas受体所介导。     

MiR-4429/NQO1对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤及炎症因子分泌的影响

目的探讨miR-4429与依赖还原型辅酶/醌氧化还原酶1(NADH quinone dehydrogenase 1,NQO1)对高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡、炎症因子分泌的影响及其作用机制。方法体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,用30 mmol/L葡萄糖处理24 h,制备糖尿病肾病肾小管上皮细胞损伤模型,记作高糖组;用含有5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h,记作正常对照组;用含有50 mmol/L甘露醇的培养基培养24 h,记作高渗对照组;分别将miR-4429抑制剂(anti-miR-4429)、anti-miR-4429阴性对照序列(anti-miR-NC)、anti-miR-4429与NQO1小干扰RNA(si-NQO1)、anti-miR-4429与si-NQO1阴性对照序列(si-NC)转染至HK-2细胞,使用含有30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h,分别记作HG+anti-miR-4429组、HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-4429+si-NQO1组、HG+anti-miR-4429+si-NC组。检测各组细胞miR-4429、NQO1 mRNA的表达水平,并检测各组细胞存活率、细胞凋亡率、Caspase-3蛋白水平、NQO1蛋白水平、丙二醛(malondialedhyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)含量、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量。采用双荧光素酶报告实验验证miR-4429过表达对野生型和突变型NQO1荧光素酶活性的影响。结果高糖处理后,miR-4429、Caspase-3的表达水平显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著升高(P0.05),MDA含量与IL-1β、TNF-α水平显著升高(P0.05),但NQO1 mRNA的表达水平显著降低(P0.05),细胞存活率与SOD活性显著降低(P0.05);抑制miR-4429表达后细胞凋亡率与Caspase-3表达量显著降低(P0.05),MDA含量与IL-1β、TNF-α水平显著降低(P0.05),细胞存活率显著升高(P0.05),SOD活性显著升高(P0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-4429能够抑制NQO1的3′-UTR区荧光素酶活性(P0.05);抑制NQO1的表达可明显减弱miR-4429的表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用。结论 miR-4429可靶向调控NQO1的表达从而促进高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡,降低细胞存活率,加重细胞氧化损伤与炎性损伤。     

戊糖多硫酸钠通过抑制P38MAPK通路的激活干预高糖刺激下肾小管上皮细胞的增殖

目的观察戊糖多硫酸钠是否通过调控P38MAPK干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞的损伤。方法利用不同浓度(10 mmol/L~50 mmol/L)葡萄糖刺激人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cells,HK-2)48 h,应用CCK-8比色法检测肾小管上皮细胞增殖的改变。利用不同时间段(0~48 h)葡萄糖刺激细胞,用Western blot法检测P38MAPK蛋白的表达水平,分为正常对照组(CON组)、高糖组(high glucose,HG组,葡萄糖30 mmol/L)、戊糖多硫酸钠(pentosan polysuflate,PPS)组(PPS 200μg/ml)、高糖+戊糖多硫酸钠组(HG+PPS组),P38抑制剂组(SB 202190,20μmol/L),p38抑制剂+高糖组(SB+HG组)、p38抑制剂+戊糖多硫酸钠组(SB+PPS),刺激48 h后检测HK-2细胞增殖的改变,刺激6 h后检测HK-2细胞P38MAPK蛋白的表达水平。结果高糖刺激下HK-2细胞增殖在30 mmol/L的浓度最高。与HG组相比,加用戊糖多硫酸钠干预能明显抑制HK-2的增殖,差异有统计学意义(P均0.01);与正常对照组相比,高糖刺激HK-2细胞6 h后磷酸化(p)p38MAPK蛋白表达水平明显增加(P均0.01);与HG组相比,HG加戊糖多硫酸钠干预6 h后HK-2细胞p-p38MAPK蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P均0.05)。应用p38MAPK抑制剂SB202190(20μmol/L)处理细胞,与HG组相比,HG加用SB202190干预能明显抑制p-p38MAPK蛋白表达及HK-2细胞的增殖(P均0.05);与PPS组相比,PPS加SB202190干预后p-p38MAPK蛋白表达降低及HK-2细胞数目减少(P均0.05)。结论戊糖多硫酸钠可能通过抑制p38MAPK的表达,减少肾小管上皮细胞的增殖而对糖尿病肾病起保护作用。     

色素上皮衍生因子对高糖诱导人肾小球系膜细胞p38丝裂原活化蛋白激酶-cAMP反应元件结合蛋白通路及纤连蛋白的影响

目的 探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对高糖条件下人肾小球系膜细胞( HMC )p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)及细胞外基质成分纤连蛋白(FN)的影响.方法 体外予正常糖(5.6 mmol/L)、甘露醇(24.4 mmol/L)、高糖(30 mmol/L)、高糖+PEDF(30 mmol/L葡萄糖+10 nmol/L、40 nmol/L、100 nmol/L PEDF)培养基培养HMC 24 h,观察p38MAPK、CREB活性(Western印迹)及FN mRNA( RT-PCR)和蛋白( ELISA)的变化.结果 与正常糖及甘露醇组相比,高糖组p-p38MAPK、p-CREB、FN的表达均显著升高(均P＜ 0.01);与高糖组相比,PEDF干预组上述指标的表达均显著下降(均P＜0.05).结论 PEDF可能通过p38MAPK-CREB通路抑制糖尿病肾病的纤维化.     

激活素A在高糖诱导的人肾小管上皮细胞中的表达变化

目的 通过体外高糖刺激的人近端肾小管上皮细胞株(HK-2),探讨激活素A(ACT A)的表达变化及卵泡抑素(FS)的干预作用.方法 HK-2细胞生长于DMEM培养基,待细胞生长至亚融合状态时,更换为无血清DMEM培养基使细胞生长同步化24h,然后将细胞分为以下5组:正常对照组(NG,5.5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇对照组(MG,5.5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇)、高糖组(HG,25 mmol/L葡萄糖)、HG+FS100组(25 mmol/L葡萄糖+100 μg/L FS)、HG+FS500组(25 mmol/L葡萄糖+500 μg/L FS).12、24、48 h后收集各组细胞及细胞上清液.Western印迹法检测各组细胞ACT A和p-Smad2/3的表达;ELISA检测各组细胞上清液转化生长因子β(TGF-β)和纤连蛋白(FN)的含量.结果 NG组细胞ACT A有微量表达,而HG组表达显著增加(P＜0.05),呈时间依赖性.与HG组相比,FS干预组ACT A表达显著减少(P＜0.05),呈剂量依赖性.与NG组相比,p-Smad2/3在HG组培养24 h后表达显著增加(P＜0.05);FS可抑制p-Smad2/3的高表达(P＜0.05).ELISA检测结果显示,与NG组相比,HG组培养12 h后TGF-β表达即显著增加(P＜0.05),呈时间依赖性,FS干预对高糖诱导的TGF-3高表达没有影响.与NG组相比,HG组培养24h后FN表达显著增高(P＜0.01),FS对此有明显抑制作用,呈剂量依赖性(P＜0.01).结论 高糖能刺激HK-2细胞ACT A表达增加,从而促进肾小管上皮细胞FN的合成;FS可通过阻断ACT A的活化,减轻肾小管上皮细胞FN的合成.     

高糖刺激对人THP-1巨噬细胞肝X受体和三磷酸腺苷结合盒转运子A1表达的作用

目的 探讨高糖对人THP-1巨噬细胞肝X受体（LXR）和三磷酸腺苷结合盒转运子A1（ABCA1）表达的影响。 方法 人THP-1单核细胞经佛波脂（PMA）诱导转化成巨噬细胞。用CD68检测巨噬细胞表面标志物表达。以不同浓度葡萄糖（5.6、11.1、22.2、33.3 mmol/L）和不同时间（0、0.5、2、6、12、24、48、72 h）刺激巨噬细胞,用实时荧光定量PCR法检测其LXRα、LXRβ、ABCA1 mRNA表达;Western 印迹法检测LXRα、LXRβ和ABCA1蛋白的表达,并分析其相互间作用。 结果 PMA诱导72 h后,TPH-1细胞CD68呈阳性表达。与正常浓度糖（5.6 mmol/L）刺激比较,高糖刺激24 h后,TPH-1巨噬细胞LXR和ABCA1 mRNA和蛋白表达均下调。高糖刺激30 min后, LXRα、LXRβ和ABCA1 mRNA和蛋白表达上调;2 h后开始下调,随着时间延长而逐渐减少。 结论 高糖可能通过抑制LXR和ABCA1的表达,参与了动脉粥样硬化的发生和发展。     

高糖通过转化生长因子β信号诱导肾小球内皮细胞向肌成纤维细胞转分化

目的 探讨高糖(HG)能否通过转化生长因子β(TGF-β)途径诱导大鼠肾小球内皮细胞向肌成纤维细胞转分化(EndMT).方法 体外培养大鼠肾小球内皮细胞(GEnC),分为正常对照组(NG,5.5 mmol/L)、高糖组(HG,15、30 mmol/L)、TGF-β抑制剂组(HG+LY36,30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L LY364947)以及高渗对照组(M,5.5 mmol/L葡萄糖+25.5 mmol/L甘露醇)和溶剂对照组(D,5.5 mmol/L葡萄糖+1 ml/LDMSO).采用Western印迹法检测各组细胞内皮细胞标志物claudin5和肌成纤维细胞标志物α-SMA表达变化;实时定量PCR法检测细胞TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达改变;免疫荧光法观察细胞形态学变化以及血管内皮细胞标志物VE-cadherin和肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达.结果 与NG组比较,HG组claudin5蛋白的表达量随葡萄糖浓度增加而降低(P＜0.05),α-SMA蛋白表达量随葡萄糖浓度增加而升高(P＜0.05),TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达均升高(P＜0.05).与HG组比较,TGF-β抑制剂组claudin5蛋白表达量升高(P＜0.05),α-SMA蛋白表达降低(P＜0.05).高渗对照组和溶剂对照组改变差异无统计学意义.激光共聚焦免疫荧光结果显示,高糖处理可引起细胞形态由卵圆形向梭形改变,VE-cadherin表达减少,α-SMA表达增加;TGF-β抑制剂组细胞形态无明显改变.与HG组比较,TGF-β抑制剂组VE-cadherin表达增加,α-SMA表达降低(P＜0.05).结论 高糖诱导大鼠肾小球内皮细胞TGF-β表达增加及内皮细胞-肌成纤维细胞转分化.抑制TGF-β可抑制高糖引起的转分化,提示TGF-β参与了高糖引起的肾小球内皮细胞转分化过程.     

促红细胞生成素对高糖培养小鼠肾足细胞整合素及整合素连接激酶的影响

目的:探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对高糖培养小鼠足细胞整合素及整合素连接激酶的影响。方法:体外培养和分化小鼠足细胞,分为对照组(葡萄糖5. 6 mmol/L)、高渗对照(葡萄糖5. 6 mmol/L+甘露醇24. 4 mmol/L)、高糖1组(葡萄15 mmol/L)、高糖2组(葡萄糖30 mmol/L),分别以以0 U/ml、10 U/ml、20 U/ml、50 U/ml浓度的重组人促红细胞生成素(环尔博)进行干预24 h,以Western blot法检测integrinβ_1、ILK、α-SMA表达的情况。结果:western blot结果:在高糖环境中ILK表达上调,当EPO浓度为10 U/ml、20 U/ml、50 U/ml浓度时ILK表达依次下调且有显著意义(P 0. 05)。integrinβ_1表达在高糖环境中表达下调,在高糖环境中当EPO浓度为10 U/ml、20 U/ml、50 U/ml浓度时integrinβ_1表达均上调(P 0. 05),以EPO浓度为10 U/ml时上调明显。α-SMA在高糖环境中表达上调,应用EPO浓度为10 U/ml、20 U/ml、50 U/ml浓度时表达下调,以高糖1组下调明显(P 0. 05)且有显著意义。结论:EPO对高糖环境中的ILK、α-SMA表达上调有抑制作用,对integrinβ_1表达有上调作用。     

高糖对大鼠肾间质成纤维细胞PINCH-1表达的影响

目的研究高糖对大鼠肾间质成纤维细胞(NRK49F)表达PINCH-1(Particulary interesting new cysteine-histicline rich protein-1)和整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)的影响,探讨PINCH-1在糖尿病肾病中的作用机制。方法 (1)体外培养大鼠NRK49F细胞,分别采用高糖(25 mmol/L)和低糖(5.5 mmol/L)培养基培养6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后,检测各组细胞不同时间点PINCH-1、ILK、α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)mRNA及蛋白表达的动态变化,ELISA法检测各组细胞上清液纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原(collagen type I,Col I)的表达。(2)采用不同浓度葡萄糖(5.5 mmol/L、15.0 mmol/L、25.0 mmol/L)作用于大鼠NRK49F细胞48 h后,检测各组细胞PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA及蛋白的表达。结果 (1)与低糖组相比,高糖组PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA及蛋白的表达明显上调,高糖刺激早期呈一定时间依赖性增加,FN、Col I蛋白的分泌水平随着高糖刺激时间的延长,呈持续升高,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)不同浓度葡萄糖培养大鼠NRK49F细胞48 h后,PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA及蛋白的表达呈浓度依赖性增加,FN、Col I的分泌水平随着葡萄糖浓度的增加持续升高。结论高糖能够促进NRK49F中调节蛋白PINCH-1和ILK的表达,促进肾脏成纤维细胞表型转化以及纤维化蛋白FN、Col I的分泌。PINCH-1可能通过与ILK相互作用,在糖尿病肾病肾间质纤维化的发生发展中发挥重要的作用。     

罗格列酮对多囊肾囊肿衬里上皮细胞p38促分裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

目的 探讨罗格列酮对多囊肾囊肿衬里上皮细胞p38促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的作用。 方法 分别用罗格列酮（RGZ,10 μmol/L）、过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）抑制剂GW9662（10 μmol/L）、RGZ（10 μmol/L）+GW9662（10 μmol/L）、p38MAPK特异性抑制剂SB203580（10 μmol/L）、SB203580（10 μmol/L）+RGZ（10 μmol/L）处理体外培养的多囊肾囊肿衬里上皮细胞（PKD细胞）2 h后,再用表皮生长因子（EGF）刺激不同时间,另设置空白对照组和单独EGF刺激组。采用Western印迹方法检测p38MAPK、磷酸化p38MAPK（p-p38）、增殖细胞核抗原（PCNA）表达;RT-PCR检测p38 mRNA表达;免疫细胞化学检测c-fos和c-jun的表达。 结果 (1) 与空白对照组相比,EGF显著上调p-p38、PCNA、 c-fos和c-jun的表达（P ＜ 0.01）。(2) 与EGF单独刺激相比,RGZ显著降低p38活化和基因表达（均P ＜ 0.01）。RGZ组、SB203580+RGZ组p-p38、PCNA、c-fos、c-jun表达明显下调（P ＜ 0.01）,两组间差异无统计学意义。(3) 与RGZ组相比,RGZ+GW9662组部分阻断RGZ的下调作用（P ＜ 0.05）。 结论 罗格列酮抑制多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖的作用机制可能与其降低p38MAPK活性,继而抑制PCNA、c-fos及c-jun表达有关。这种抑制作用是部分非PPARγ依赖的。     

虫草素通过下调TGF-β抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化

目的：探讨虫草素对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞株）,分为正常对照组（葡萄糖5.5 mmol/L,NG组）、高糖组（葡萄糖30 mmol/L,HG组）、高糖＋虫草素组（葡萄糖30 mmol/L＋虫草素10μg/ml,HG＋C组）。分别于刺激12 h,24 h,48 h后收集细胞。应用定量RT-PCR测定NRK52E TGF-β,E-cadherin,α-SMA mRNA的表达;Western印迹方法检测TGF-β、E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果：高糖刺激后NRK52E细胞的TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达明显高于正常糖组（P〈0.01）,而虫草素组TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达显著低于高糖组（P〈0.05）;高糖诱导的NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平明显降低（P〈0.01）;而虫草素组NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平显著高于高糖组（P〈0.05）。结论：虫草素可以明显抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化,其机制可能是通过下调TGF-β实现。     

罗格列酮对盲肠结扎穿孔脓毒症大鼠肺损伤的影响

目的 观察过氧化物酶体增殖子激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)激动剂罗格列酮对盲肠结扎穿孔(cecal ligation puncture,CLP)所致脓毒症大鼠肺损伤的影响. 方法 80只健康雄性Wistar大鼠,采用随机数字表法分为5组(每组16只):假手术组(SHAM组);盲肠结扎穿孔组(CLP组);罗格列酮组(ROSI组),CLP前30 min静脉注射罗格列酮0.3 mg/kg;PPARγ拮抗剂GW9662组(GW组):CLP前30 min静脉注射GW9662 0.3 mg/kg; GW9662+罗格列酮组(GW+ROSI组):依次于CLP前30 min静脉注射GW9662 0.3 mg/kg、CLP前15 min静脉注射罗格列酮0.3 mg/kgo于CLP后6、24 h各组随机抽取8只大鼠处死并留取血液及肺组织.测定各组肺组织湿/干质量比(wet/dry ratio,W/D);肺组织髓过氧化物酶(myeloproxidase,MPO)活性;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定血浆肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)测定肺组织高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)mRNA水平. 结果 CLP组、ROSI组、GW组、GW+ROSI组大鼠W/D比、MPO活性、TNF-α水平以及HMGB 1mRNA水平在CLP后6、24 h增加,均高于SHAM组.CLP后6 h,CLP组、ROSI组、GW组、GW+ROSI组大鼠W/D比、MPO活性、TNF-α 水平以及HMGB1 mRNA水平分别为(5.31±0.14)、(3.15±0.47) U/g、(15.064±0.448) μg/L、(0.758±0.130);(4.33±0.21)、(2.21±0.31) U/g、(3.334±0.212) μg/L、(0.422±0.124); (4.93 ±0.14)、(3.13± 0.28) U/g、(15.001±0.343) μg/L、(0.732±0.198);(4.87±0.13)、(3.08±0.35) U/g、(14.866±0.412)μ g/L、(0.763±0.0 17),均高于SHAM组的(3.98±0.17)、(0.67±0.43) U/g、(0.452±0.033) μg/L、(0.244±0.053) (P＜0.05).CLP后24 h,CLP组、ROSI组、GW组、GW+ROSI组大鼠W/D比、MPO活性、TNF-α 水平以及HMGB1mRNA水平分别为(10.23± 0.19)、(3.61±0.82) U/g、(1.542± 0.193) μg/L、(2.413± 0.211);(6.39 ±0.18)、(2.17±1.02) U/g、(0.947±0.281) μg/L、(1.517±0.076); (10.08±0.26)、(3.45±0.36) U/g、(1.513± 0.210) μg/L、(2.385±0.323); (10.15±0.18)、(3.53 ±0.32) U/g、(1.524±0.180) μg/L、(2.404±0.135),均高于SHAM组的(4.02±0.20)、(0.68±0.34) U/g、(0.429±0.021)μg/L、(0.232± 0.032) (P＜0.05).ROSI组大鼠W/D比、MPO活性、TNF-α 水平以及HMGB1 mRNA水平在CLP后6、24 h与CLP组、GW组、GW +ROSI组分别比较均显著降低(P＜0.05). 结论 罗格列酮可以降低CLP脓毒症大鼠TNF-α水平以及HMGB1mRNA水平,减轻肺水肿程度及炎症损伤程度,对肺损伤具有保护作用.     

P38 MAPK抑制剂在高糖诱导系膜细胞CTGF表达和基质蛋白分泌中的作用

目的:探讨P38 MAPK抑制剂SB203580在高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞对丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)与结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达和细胞外基质蛋白分泌的作用。方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞分为4组:正常对照组(NG组,5. 5 mmol/L葡萄糖);渗透压对照组(NG+M组,5. 5 mmol/L葡萄糖+24. 5 mmol/L甘露醇);高糖组(HG组,30 mmol/L葡萄糖);高糖+SB203580组(HG+SB203580组,30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L SB203580),分别给予不同刺激。48 h收集细胞,分别提取系膜细胞蛋白、RNA及细胞上清液。采用Western blot检测MKP-1、p38 MAPK及磷酸化p38MaPK的表达; RT-PCR检测p38 MAPK、MKP-1、CTGF和FN mRNA的表达; ELISA法测定细胞上清CTGF和纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)含量,放免法测定细胞上清液Ⅳ型胶原的含量。结果:与NG组相比,HG组系膜细胞MKP-1表达下调,p38 MAPK蛋白表达无明显差别,但磷酸化的p38 MAPK表达明显升高,MKP-1 mRNA表达下降,p38 MAPK、CTGF和FN mRNA的表达增加,细胞上清液中CTGF、FN和Ⅳ型胶原含量增加;与HG组相比,HG+SB203580组MKP-1表达升高,p38 MAPK蛋白表达无明显差别,但磷酸化的p38MAPK表达明显下降,p38 MAPK、CTGF和FN mRNA的表达下降,系膜细胞上清液中CTGF、FN和Ⅳ型胶原含量下降。结论:p38 MAPK抑制剂SB203580通过增强MKP-1的表达,增强p38 MAPK去磷酸化,使p38 MAPK活性下降,从而阻断CTGF的合成和细胞外基质蛋白表达,在糖尿病肾病细胞外基质重构中发挥保护作用。     

P38MAPK 信号通路在高糖导致人腹膜间皮细胞 PARP -1激活、细胞外基质聚集及转分化的作用

目的：探讨人腹膜间皮细胞株 HMrSV5在高糖刺激下,P38MAPK 信号通路的活化情况及 PARP -1的蛋白表达情况。探讨 P38MAPK 抑制剂对腹膜间皮细胞外基质聚集及细胞转分化的作用及对 PARP -1的活性变化。方法：无血清培养 HMrSV5细胞株16~24 h 后,分别用高糖（终浓度138 mmol/ L 葡萄糖）刺激0 m、5 m、30 m、1 h、2 h、8 h、24 h,并选择等渗的甘露醇作为对照用。Western Blot 分别检测不同时间总的 P38MAPK 及磷酸化的 P38MAPK 的蛋白表达水平。同时用Western blot 检测在不同时间点 PARP -1的蛋白表达情况。无血清培养 HPMCs16~24 h 后,分为4各组：（1）低糖组（5．6 mmol/ L 葡萄糖）;（2）刺激组（138 mmol/ L 葡萄糖）;（3）抑制剂组（138 mmol/ L 葡萄糖＋ SB203580P38抑制剂,浓度为10μmol/ L）;（4）DMSO 对照组。在24 h 收取细胞用 Western blot 检测 P38MAPK、PARP -1、FN、PAI -1、E - cadherin 及α-SMA 的蛋白水平变化。结果：高糖以时间依赖的方式刺激 HPMCs 后,磷酸化的 P38MAPK 表达增加。PARP -1的表达在高糖刺激下也呈时间依赖性增高,24 h 已很明显。用 P38MAPK 抑制剂 SB203580后,PARP -1及 FN、PAI -1及α- SMA 也下调,E - cadherin 表达上调,差异有统计学意义（P 〈0．05）。结论：高糖可使得人腹膜间皮细胞 P38MAPK 通路的活化。运用P38的抑制剂,均能使得 PARP -1活性下调,同时逆转腹膜间皮细胞外基质聚集及 HPMCs 转分化。这提示在高糖刺激腹膜间皮细胞时,P38MAPK 参与了 PARP -1的活化,并参与腹膜间皮细胞外基质聚集及人腹间皮细胞转分化。