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1.
目的构建湖北钉螺被日本血吸虫毛蚴侵袭前、后差异表达cDNA文库,筛选湖北钉螺免疫相关分子,为探讨病原与中间宿主的相互作用奠定基础。方法提取被日本血吸虫毛蚴侵袭前、后湖北钉螺的头足部组织总RNA,纯化mR-NA,反转录合成cDNA。分别以被日本血吸虫毛蚴侵袭前湖北钉螺(未处理组)和被日本血吸虫毛蚴侵袭后湖北钉螺(处理组)的头足部组织作为检测方(Tester)和驱动方(Driver),利用PCR方法选择cDNA杂交试剂盒分别进行正向和反向抑制性消减杂交。将获得的正向抑制性消减杂交产物克隆入pGEM-T载体,重组质粒转入E.coliDH5α,对菌液用PCR法扩增鉴定其中的插入片段。随机抽取354个阳性克隆进行DNA序列分析,将所得表达序列标签(ESTs)序列在线进行BLAST分析。结果从正向文库随机挑取的354个阳性克隆中测得350个ESTs序列,生物信息学分析发现了34个湖北钉螺新基因,其中1个与已知基因部分同源。结论成功建立了被日本血吸虫侵袭前、后湖北钉螺差异表达片段cDNA消减文库,发现了湖北钉螺新基因,为筛选与湖北钉螺天然免疫相关的分子、进一步探讨中间宿主与病原的相互作用及筛选血吸虫病传播阻断疫苗候选分子奠定了基础。  相似文献   

2.
目的克隆、鉴定湖北钉螺(Oncomelania hupensis)髓样分化因子88(MyD88)基因,并通过观察感染日本血吸虫前后钉螺各组织中MyD88 m RNA表达水平的变化,探讨其在抗血吸虫感染固有免疫中的地位。方法通过c DNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)获取湖北钉螺MyD88全长c DNA序列,预测其蛋白结构域,并进行多序列比对及保守区域分析,构建系统进化树。使用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)技术检测MyD88基因在血吸虫感染前后钉螺各组织中的表达变化。结果湖北钉螺MyD88全长c DNA开放阅读框(Open reading frame,ORF)1 406 bp,编码468个氨基酸,蛋白N端和C端分别存在死亡结构域和TIR(Toll/interlrukin-1 receptor,TIR)结构域。与其他软体类MyD88氨基酸序列比对,相似性为38%~52%;系统进化树提示钉螺MyD88和光滑双脐螺MyD88起源于共同的祖先基因。q PCR结果显示,检测的所有组织中均有MyD88 m RNA的表达,其中血淋巴细胞中表达最为丰富。感染日本血吸虫后,除钉螺头足外,MyD88 m RNA在肝脏、生殖腺、血淋巴细胞等组织中均有上调表达,以血淋巴细胞中上调表达最显著。结论湖北钉螺存在依赖MyD88的TLRs(Toll-like receptors,TLRs)信号通路,MyD88分子可能在钉螺对抗日本血吸虫感染的固有免疫中发挥重要作用。  相似文献   

3.
目的探索日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(chymotrypsin-like protease)在终宿主体内的基因表达、定位和潜在功能,评估该蛋白在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护力。方法利用软件分析日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(Sj CTRL)基因(Gen Bank登录号为FN317561.1)的理化特性,及与其他物种同源基因的种系发生关系。采用整体原位杂交法定位Sj CTRL基因转录本在d26成虫中的表达部位。利用实时定量荧光PCR方法监测感染后14、18、22和26 d等4个发育时期雌雄虫的Sj CTRL基因转录水平。制备Sj CTRL-ds RNA,采用体外浸泡法对d26合抱雌雄虫进行RNA干扰,并利用共聚焦显微镜观察被干扰虫体的形态学变化。设计特异性引物扩增去除跨膜结构的编码基因序列,并克隆至p ET-28a原核表达载体,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)后进行原核表达。将纯化重组蛋白免疫C57BL/6小鼠,用尾蚴(40±2条/鼠)攻击感染进行动物保护性实验。同时设对照组。感染后35 d收集虫体和肝脏,统计减虫率、每克肝组织减卵率。结果原位杂交定位结果显示,该基因转录本位于雌虫后段肠道。Sj CTRL基因仅在d26雌虫体内有较高的转录本丰度。Sj CTRL-ds RNA干扰后雌虫相应基因转录本的相对表达量降至25.7%(P0.05),但未有可观察到的形态学变化。构建了p ET-28a/Sj CTRL重组质粒,诱导表达获得不可溶重组蛋白。免疫保护试验结果显示,减虫率为25.4%,减卵率为80.5%。结论初步探明日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因仅在d26雌虫的后段肠道高转录,体外干扰可降低Sj CTRL基因的转录本水平,该蛋白可一定程度上减少感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠的成虫数和肝脏虫卵数。  相似文献   

4.
目的 对羊种布鲁氏菌的转录本进行测序,鉴定基因组中新的转录本和非编码RNA。方法 提取羊布鲁氏菌的总RNA,去除rRNA后连接接头逆转录成cDNA,PCR扩增后进行测序,以羊布鲁氏菌16M的基因组序列为参照对测序得到的reads进行比对作图,通过生物信息学方法进行新转录本和非编码RNA的鉴定。结果 测序数据分析显示,reads在基因组上覆盖度较好。与现有注释基因相比,有773个基因的5'或3'端在基因组的原有位置基础上发生了延伸,并发现了16个新的转录本。根据测序结果,共鉴定出241条候选的非编码RNA(sRNA),进一步的RT-PCR验证结果显示,预测的sRNA在体外条件下有表达。结论 布鲁氏菌基因组中存在除了预测以外的新的转录本,布鲁氏菌中存在非编码RNA且在不同条件下有差异表达。  相似文献   

5.
目的制备日本血吸虫自杀性RNA颗粒抗原,并研究其在真核细胞内的表达,以期探讨新型抗原的研制方法,为制备抗血吸虫疫苗奠定基础。方法将编码日本血吸虫主要抗原GST、Sj23及编码两种抗原的嵌合基因(GST-Sj23)分别克隆到自杀性RNA疫苗载体SFV3.spider内,以体外转录法制备编码上述三种抗原的mRNA。同法合成编码SFV病毒表膜蛋白质(S蛋白质和C蛋白质)的mRNA,然后将编码上述三种抗原的mRNA分别与编码病毒膜蛋白质的mRNA混合,以电穿孔法导入BHK21细胞,制备含有日本血吸虫GST、Sj23抗原及GST-Sj23嵌合体抗原mRNA的假病毒颗粒。最后,对制备出的假病毒颗粒进行真核细胞感染实验,以间接免疫荧光法验证上述抗原的真核表达情况。结果三种RNA颗粒对BHK21细胞均具有很好的感染性,所编码的蛋白质在BHK21细胞内鉴定高效表达。  相似文献   

6.
胰腺癌是一种侵袭能力强、生存率极低的恶性肿瘤.最近研究显示长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)的异常表达与胰腺癌有关.lnc RNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子,他不编码蛋白质,在转录水平、转录后、表观遗传学等水平调控基因的表达,参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移过程,本文就lnc RNA在胰腺癌中的异常表达及机制研究做一综述,为胰腺癌的诊治提供新思路.  相似文献   

7.
目的 利用全转录组测序技术研究日本血吸虫感染及吡喹酮治疗过程中长链非编码RNA(lncRNA)⁃微小RNA(miRNA)⁃信使RNA(mRNA)的交互作用,分析其中发挥调控作用的关键基因网络。方法 110只C57BL/6小鼠随机分为对照组、感染组和治疗组,感染组和治疗组以腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴后,第3、6、8周分别取10只小鼠肝脏组织;治疗组在第8周后开始吡喹酮治疗,治疗后第2、4、6、8、10周分别取10只小鼠肝脏组织。所有肝脏样本提取总RNA并构建转录组文库,进行全转录组高通量测序,对显著变化的差异表达基因进行功能注释、基因本体(GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。应用R语言中Corrplot包和Himsc包对肝脏标本进行相关性分析,利用R语言中的MixOmics包和Himsc包对lncRNA⁃miRNA⁃mRNA进行多组学交互网络分析。结果 感染组与对照组间共有差异表达miRNA基因 1 176个、差异表达mRNA基因5 270个、差异表达lncRNA基因 2 682个;治疗组与感染组间共有差异表达miRNA基因1 289个、差异表达mRNA基因7个、差异表达lncRNA基因69个;治疗组与对照组间共有差异表达miRNA基因1 210个、差异表达mRNA基因4 456个、差异表达lncRNA基因2 016个。相关性分析显示,治疗组与对照组基因表达相关性更高。主成分分析显示,感染组与治疗组出现了明显分别聚类。具有显著相关性的基因主要富集在花生四烯酸代谢、异生分解代谢、不饱和脂肪酸代谢、异生代谢、长链脂肪酸代谢等24个GO条目和胆固醇代谢、酪氨酸代谢、亚油酸代谢、雷丁醇代谢、类固醇激素生物代谢等8条KEGG代谢途径。结论 Cyp2b9等23个mRNA和 Rmrpr等14个lncRNA处于基因调控网络核心位置,可能在血吸虫感染及吡喹酮治疗过程中发挥关键调控作用;miR⁃8105等9个miRNA具有作为血吸虫感染诊断分子标志物的潜力。  相似文献   

8.
叶巢外睾吸虫感染钉螺对钉螺体内日本血吸虫发育的影响   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 探讨在日本血吸虫中间宿主湖北钉螺体内叶巢外睾吸虫和日本血吸虫的对抗性。 方法 通过叶巢外睾吸虫和日本血吸虫对湖北钉螺的双重感染 ,计算血吸虫的感染率和尾蚴逸出量 ,常规石蜡切片观察钉螺组织学变化。 结果 钉螺在感染血吸虫 37d后再感染外睾吸虫 ,经一定时间后检查发现 ,血吸虫的感染率为 5 2 9% ,显著低于同时单独感染日本血吸虫对照组的感染率 (75 9% ) ;先感染叶巢外睾吸虫 ,经 10、 32、6 0、 10 0和 12 0d不同的时间间隔后再感染日本血吸虫的钉螺 ,血吸虫感染率分别为 6 4 %、 6 6 7%、 6 5 2 %、5 6 4 %和 5 7 1% ,而单独感染日本血吸虫对照组钉螺血吸虫感染率为 90 5 % ,经统计检验 ,各双重感染实验组血吸虫与对照组的感染率间差异具有显著或非常显著性意义 (P <0 0 5或P <0 0 1)。对各试验组及对照组钉螺逸出尾蚴试验发现 ,试验组钉螺血吸虫尾蚴逸出量均显著低于对照组的逸出量。组织学观察发现各双重感染组钉螺消化腺萎缩 ,消化腺盲囊间隙只有少量血吸虫子胞蚴 ,血吸虫子胞蚴皱缩、变形及不规则 ,且子胞蚴中只含稀疏的尾蚴胚球 ,有的子胞蚴中已无胚球 ;而单独感染血吸虫的对照组中血吸虫均发育到成熟的子胞蚴或尾蚴。 结论 钉螺体内叶巢外睾吸虫和日本血吸虫之间存  相似文献   

9.
中国日本血吸虫地域株基因差异的研究   总被引:3,自引:1,他引:3       下载免费PDF全文
目的 研究中国日本血吸虫各地域株基因差异。 方法 收集湖南、安徽、湖北、四川及江苏 5省的阳性钉螺 ,将逸出的日本血吸虫尾蚴感染昆明小鼠 ,42d后 ,用灌注法获取成虫 ,用PCR扩增成虫线粒体NADH (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 )脱氢酶 1(ND1)和细胞色素C氧化酶 1(CO1)基因片段 ,克隆于质粒载体后测序并用MEGA软件分析。 结果 各地域株日本血吸虫成虫的ND1和CO1基因长度分别为 476bp和 10 33bp ,ND1和CO1基因序列分别存在 2个单倍体 (Ⅰ型 ,Ⅱ型 ) ,其差异分别为 4.0 %和 3.4%。从分子发生树看 ,各地域株日本血吸虫ND1和CO1基因分别存在 2个不同基因型。在ND1基因中呈现Ⅰ型的 ,CO1基因中也为Ⅰ型 ,反之 ,均为Ⅱ型。 结论 研究区域湖南、安徽、湖北、四川及江苏 5省的日本血吸虫株ND1和CO1基因存在 2个不同基因型。  相似文献   

10.
湖北钉螺先感染外睾吸虫后再感染日本血吸虫,血吸虫幼虫在其体内被击杀(唐崇惕等,2008;2009),本文用日本血吸虫毛蚴分别接触已感染外睾吸虫21d的钉螺和阴性钉螺,观察血吸虫幼虫在此2组实验钉螺体内发育情况。从感染外睾吸虫钉螺再感染血吸虫的28个(73.7%)阳性螺,查获4~82d血吸虫幼虫共300条(侵入率26.74%),全部虫体结构异常停留在早期母胞蚴阶段。从单独感染血吸虫的25粒(69.4%)阳性螺,查获5~61d正常血吸虫母胞蚴67条(侵入率13.96%)和许多不同发育期子胞蚴,感染后75d阳性螺含血吸虫成熟子胞蚴和尾蚴。单独感染血吸虫钉螺的血淋巴细胞增生情况与双重感染外睾吸虫和血吸虫的钉螺存在差异。  相似文献   

11.
目的:探讨从日本血吸虫大陆株成虫及其中间宿主湖北钉螺头足部分离的天然原肌球蛋白(分别称为SjcTM和OhTM)免疫小鼠后对日本血吸虫尾蚴攻击感染的保护作用。方法:参照Cote和Smilie文献改进的方法从日本血吸虫大陆株成虫及其中间宿主湖北钉螺头足部分别提取天然原肌球蛋白(TM)抗原,用SDS-PAGE分析其纯度和分子量,并以所提纯之TM抗原加福氏佐剂皮下多点注射免疫C57BL/6雌性小鼠,共免疫3次,攻击感染后6wk解剖小鼠,门脉灌注收集成虫,并分类计数小鼠肝脏和肠组织内的未成熟和成熟虫卵。同时设立佐剂对照组。结果:日本血吸虫大陆株成虫和湖北钉螺TM分子量相似约40kDa。与佐剂对照组相比,日本血吸虫和湖北钉螺TM 免疫组: 减虫率分别为21.1% 和28.2%; 平均每对成虫肝脏减卵率分别为20.1%和52.2% , 肠组织减卵率分别为32.8% 和28.1%; 肝脏成熟虫卵减少率分别为25.9% 和46.8% ,在肠组织的减少率分别为39.7% 和66.8%。结论: 日本血吸虫和湖北钉螺TM 抗原具明显的免疫原性, 免疫小鼠后具有抗感染和抗血吸虫病免疫的作用。可作为血吸虫病候选疫苗分子作进一步研究。  相似文献   

12.
目的 为了寻找日本血吸虫病新的免疫学候选分子,克隆日本血吸虫钙网蛋白(calreticulin,CRT)编码基因,并进行表达、鉴定.方法 以日本血吸虫cDNA为模板,PCR扩增SjCRT编码基因,并与pGEM-T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与表达载体pET28a(+)连接,PCR和双酶切鉴定后测序.IPTG诱导表达重组质粒pET28a-SjCRT,进行SDS变性蛋白质电泳和Western-blot分析,用亲和层析纯化获得重组蛋白.结果 成功地构建了重组质粒pET28a-SjCRT,SDS变性蛋白质电泳显示可见一与预期分子量大小相符的特异蛋白条带的表达.Western blotting分析表明,该重组蛋白能被血吸虫感染小鼠阳性血清识别.亲和层析纯化获得SjCRT重组蛋白.结论 重组质粒SjCRT的构建和重组蛋白的表达和纯化,为进一步探讨其在血吸虫病疫苗和诊断中的应用奠定了基础.  相似文献   

13.
目的探索重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)荧光法用于日本血吸虫感染性钉螺早期检测的可行性。方法用日本血吸虫毛蚴人工感染200只湖北钉螺,随机分为阳性对照组和实验组各100只,另取100只未感染钉螺作为阴性对照组。将阳性对照组钉螺饲养至70 d,通过逸蚴法观察感染情况并计算阳性率。实验组钉螺分别在3 h以及5、20、40、70 d随机取20只,压碎镜检,同时提取钉螺软体DNA,进行荧光RAA法检测,获得不同时间点的阳性率,并与阳性对照组相比较。通过二代测序法对RAA检测阳性的特异性扩增产物进行测序鉴定。结果毛蚴感染后3 h、5 d、20 d、40 d、70 d实验组钉螺RAA法检测阳性率分别为60%、60%、65%、60%、70%,压碎镜检的阳性率分别为0、0、0、15%、65%,除70 d外其余时间点两种检测方法的阳性率差异均有统计学(χ^2=17.14,χ^2=17.14,χ^220 d=19.26,χ^2=8.64,均P<0.01);各时间点间阳性率差异无统计学意义(χ^2=0.68,P>0.05),各时间点阳性率与阳性对照组阳性率64.6%比较差异均无统计学意义。RAA扩增产物经二代测序后与数据库比对,确认为血吸虫特异性基因片段。结论 RAA荧光法敏感、特异,可用于日本血吸虫感染性钉螺的早期检测。  相似文献   

14.
血吸虫磷酸丙糖转移酶基因的克隆及表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 对血吸虫磷酸丙糖转移酶基因进行克隆及原核表达 ,以寻找新的预防日本血吸虫感染的疫苗候选分子。方法 用血吸虫病人阳性混合血清经大肠杆菌预吸收后对日本血吸虫童虫cDNA文库进行免疫学筛选 ,所获阳性克隆测序后 ,送GenBankBLAST进行蛋白质序列同源性比较 ,证实与其它物种的磷酸丙糖转移酶有很高的同源性。将其克隆入 pGEM-T载体质粒 ,再定向亚克隆入pBK -CMV表达质粒载体上经IPTG诱导表达后 ,用SDS -PAGE和Western -blot分析和鉴定表达产物。结果 用PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定均证实TPM基因的重组成功 ,表达产物为 32kD的融合蛋白 ,表达产物可被免疫阳性血清识别。结论 首次成功构建编码日本血吸虫磷酸丙糖转移酶基因表达载体克隆 ,为进一步研究其作为疫苗分子的可能性奠定基础  相似文献   

15.
目的探索重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)荧光法用于日本血吸虫感染性钉螺早期检测的可行性。方法用日本血吸虫毛蚴人工感染200只湖北钉螺,随机分为阳性对照组和实验组各100只,另取100只未感染钉螺作为阴性对照组。将阳性对照组钉螺饲养至70 d,通过逸蚴法观察感染情况并计算阳性率。实验组钉螺分别在3 h以及5、20、40、70 d随机取20只,压碎镜检,同时提取钉螺软体DNA,进行荧光RAA法检测,获得不同时间点的阳性率,并与阳性对照组相比较。通过二代测序法对RAA检测阳性的特异性扩增产物进行测序鉴定。结果毛蚴感染后3 h、5 d、20 d、40 d、70 d实验组钉螺RAA法检测阳性率分别为60%、60%、65%、60%、70%,压碎镜检的阳性率分别为0、0、0、15%、65%,除70 d外其余时间点两种检测方法的阳性率差异均有统计学(χ■=17.14,χ■=17.14,χ~220 d=19.26,χ■=8.64,均P0.01);各时间点间阳性率差异无统计学意义(χ~2=0.68,P0.05),各时间点阳性率与阳性对照组阳性率64.6%比较差异均无统计学意义。RAA扩增产物经二代测序后与数据库比对,确认为血吸虫特异性基因片段。结论 RAA荧光法敏感、特异,可用于日本血吸虫感染性钉螺的早期检测。  相似文献   

16.
目的在原核系统中克隆表达日本血吸虫肌球蛋白调节轻链(SjMRLC)并分析其基因的虫期转录特异性。方法根据SjMRLC的核苷酸序列(GenBank登录号为AY815219)设计特异性引物,PCR扩增目的基因,并克隆入原核表达载体pGEX4T-3;转至大肠埃希菌BL21株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;蛋白质印迹分析(Western blotting)鉴定表达产物;提取日本血吸虫各虫期总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增分析SjMRLC基因的虫期转录特异性。结果构建pGEX 4T-3/SjMRLC重组质粒,测序表明插入的外源基因片段正确,诱导表达获得带有GST标签的可溶性蛋白(Mr49000);虫期转录特异性分析显示该基因在日本血吸虫各个虫期均有转录,且水平一致。结论成功获得可溶性的带有GST标签的SjMRLC;SjMRLC是管家基因。  相似文献   

17.
<正>长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度>200nt的RNA分子,结构上类似mRNA,但序列中不存在开放阅读框[1]。与编码RNA相比,lncRNA并不编码蛋白质,而是通过基因印记、染色质重构、细胞周期调控、剪接调控、mRNA降解和翻译调控等在表观遗传学、转录及转录后水平等多种层面调控基因的表达,参与调控机体生长发育、细胞凋亡、增殖、分化等多种生理功能[2]。近期研究发现,lncRNA和疾  相似文献   

18.
长链非编码RNA是一类转录本长度超过200 nt、不编码蛋白质的功能性RNA分子.研究表明长链非编码RNA可通过与核内外结构相互作用调节基因的表达,如基因印记、染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控、mRNA降解和翻译调控等.虽然长链非编码RNA的功能及其作用机制尚未完全阐明,但一些研究显示长链非编码RNA功能的变化与临床疾病表型的改变相关.现就长链非编码RNA的调节机制、主要功能及其在心血管疾病研究中的最新进展做一综述.  相似文献   

19.
本文进行了安徽贵池、湖北监利、广西桂平、四川天全、云南洱源及福建福清6地日本血吸虫和钉螺的人工交互感染实验。结果表明各地日本血吸虫与钉螺呈现不同的相容性。湖北、安徽两地的血吸虫幼虫与钉螺的相容性无差别。湖北、安徽两地血吸虫幼虫很难在云南、四川两地钉螺体内发育成熟逸出尾蚴:反之,云南、四川两地血吸虫幼虫与湖北、安徽两地钉螺却可相容。广西的血吸虫幼虫或钉螺与安徽的钉螺或幼虫亦可交互感染而相容,但尾蚴逸出前期均较感染本地钉螺的为长;广西的血吸虫幼虫与四川、云南、福建的钉螺并不相容。福建的钉螺与安徽、云南两地血吸虫幼虫均可相容。本文还提出了在研究日本血吸虫与钉螺的相容性时,必须包括逸出尾蚴的钉螺感染率和尾蚴逸出前期的数据,才能正确评价两者的相互关系。  相似文献   

20.
日本血吸虫的不同地域株对湖北钉螺各亚种的感染率不同,各个地域株对其流行区的钉螺易感,而对非流行区钉螺感染较差或不感染。本文进一步研究了东方各种血吸虫与其各种螺蛳中间宿主间的交叉感染。用日本血吸虫(中国株和菲律宾株)、类日本血吸虫(S.japonicum-like,马来西亚)、湄公血吸虫(老挝)、中华血吸虫(泰国),分别与湖北钉螺(中国安徽)、湖北钉螺夸氏亚种(菲律宾)、Roberstiella kaporensis(马来西  相似文献   

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