超声破坏载pcDNA3-bFGF-NGF基因纳泡治疗糖尿病大鼠创面的实验研究

摘要： 目的：研究超声破坏纳泡介导pcDNA3-bFGF-NGF基因转染对糖尿病大鼠创面的治疗作用。 方法：首先将磷脂、甘油、全氟丙烷等混合制备成纳米级气泡,将制备的bFGF和NGF的基因质粒通过静电作用吸附于纳泡表面,从而得到载pcDNA3-bFGF-NGF基因脂质纳泡,并检测其基本特性。采用MTT法观察其对细胞活性的影响。观察超声基因转染仪作用前后载基因纳泡增强超声显影情况,研究超声破坏载pcDNA3-bFGF-NGF基因纳泡定位释放、增强转染及对大鼠创面的治疗效果。 结果：所制得的载基因pcDNA3-bFGF-NGF纳泡呈球形,大小较均一,粒径约 450nm,表面电位12.7mV, 具有良好的生物相容性,对细胞无明显毒性。载基因纳泡能显著增强超声显影,经超声基因转染仪破坏后,可定位释放基因,且基因转染效率明显提高,对大鼠创面有较好的治疗效果。 结论：超声破坏纳泡可显著提高pcDNA3-bFGF-NGF基因转染效率,可为糖尿病创面治疗提供一种新手段。 关键词：纳泡,质粒,基因转染,蛋白生成,超声成像     

载自杀基因的靶向微泡联合超声抑制视网膜母细胞瘤的实验研究

目的 探讨载自杀基因的靶向微泡联合超声对视网膜母细胞瘤（RB）的抑制作用。方法 制备携带单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（HSV1-tk）质粒和VEGFR2抗体的靶向微泡,分为空白对照组、细胞+质粒组、细胞+质粒+SonoVue组、细胞+靶向微泡组、细胞+质粒+超声辐照组、细胞+质粒+SonoVue+超声辐照组和细胞+靶向微泡+超声辐照组进行实验。荧光显微镜观察基因转染情况,流式细胞仪检测转染率,加入丙氧鸟苷（GCV）后,检测细胞的抑制率。结果 细胞+靶向微泡+超声辐照组的转染率为（24.78±1.04）%,较细胞+质粒+SonoVue+超声辐照组（14.31±0.69）%高。随着GCV浓度的增加,培养时间的延长,各组的抑制率逐渐升高。当GCV浓度在100 mg/l,培养96h后,细胞+靶向微泡+超声辐照组对RB细胞的抑制率达（92.91±1.71）%。结论 在加入GCV后,携带HSV1–tk的靶向微泡联合超声能有效的抑制RB细胞。     

超声靶向微泡破坏技术介导基因转染的研究进展

基因转染技术的高速发展不仅革新了生物学和医学许多基本问题的研究,也推动了诊断和治疗的进步。基因作为核酸类生物活性大分子,极易在体内降解,因此传递基因的载体尤为重要。超声靶向微泡破坏(UTMD)技术利用超声波和微泡之间的相互作用,以及其产生的生物学效应,使微泡携基因进行转染,并与多种载体联合应用,为疾病的治疗提供了有效手段。本文就UTMD技术介导基因转染的研究进展进行综述。     

载黑色素脂质纳泡的制备及体外多模态显像实验研究

目的 制备一种包载黑色素的多模态脂质纳泡（MNBs）造影剂,观察其体外超声、光声、MR显影效果。方法 采用三氯甲烷注入—冷冻干燥—全氟丙烷充气法制备MNBs和普通脂质纳泡（NBs）,检测MNBs的一般特性（形态、粒径、黑色素装载量、稳定性）,对不同浓度MNBs进行体外超声、光声、MR成像并进行定量对比分析。结果 MNBs形态规则,粒径分布均匀,透射电镜显示MNBs成功包裹黑色素颗粒。黑色素的载药量为90.53 μg/mg。体外显影实验示随MNBs和NBs浓度的增加,超声造影效果明显增强,MNBs和NBs的超声造影表现无明显差异,相对信号强度差异无统计学意义（P > 0.05）;随MNBs浓度的增加,光声和MRI显影效果增强,NBs无光声和MRI显影效果。结论 成功制备出一种包载黑色素的多模态脂质纳泡造影剂,可明显增强超声、光声、MR显影效果。     

携galectin-7-siRNA 超声纳泡靶向治疗大鼠心脏移植急性排斥反应的实验研究

目的采用超声靶向微泡破坏技术介导galectin-7-siRNA转染,抑制大鼠移植心脏galectin-7表达,以达到靶向治疗心脏移植后急性排斥反应的目的。方法制备携galectin-7-siRNA的ICAM-1靶向纳泡;构建大鼠同系移植(ISO)及异系移植(ALLO)心脏模型,并分为4组:ISO+磷酸盐缓冲液(PBS)组、ALLO+PBS+低功率聚焦超声(LIFU)组、ALLO+微泡(NBs)组及ALLO+NBs+LIFU组。于移植后第1、3、5、7天分别行超声靶向微泡定位释放治疗,治疗后取材比较各组心脏galectin-7表达及急性排斥反应分级。结果制备的纳泡平均粒径(221.25±34.21)nm,平均电位(51.32±2.21)m V;galectin-7-siRNA携带率71.0%。ALLO+NBs+LIFU组galectin-7蛋白表达均低于ALLO+PBS+LIFU组和ALLO+NBs组(均P<0.05),ALLO+NBs+LIFU组急性排斥反应分级均明显低于ALLO+PBS+LIFU组及ALLO+NBs组(均P<0.05)。结论超声引导下携galectin-7-siRNA靶向微泡爆破治疗能降低大鼠移植心脏galectin-7表达,抑制急性排斥反应发生。     

超声微泡促进TDL复合物介导基因转染的体外实验

目的 研究超声微泡促进TDL复合物介导的肝细胞生长因子(HGF)基因在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的转染效果.方法 将HUVEC接种在24孔板中,随机分为以下5组:(1) 空白对照组;(2) TDL复合物组;(3) TDL复合物 微泡组;(4) TDL复合物 超声组;(5) TDL复合物 微泡 超声组.荧光显微镜及流式细胞仪检测pIRES2-EGFP/HGF在细胞内的表达及转染效率.MTT法检测该方法对HUVEC生长活性的影响.RT-PCR及Western Blot检测HGF的mRNA及蛋白的表达.结果 TDL复合物 超声 微泡组的绿色荧光强度及转染率均高于其它各组,并对细胞活性无明显影响.TDL复合物 超声 微泡组的HGF mRNA及HGF蛋白的表达也均高于各组.结论 超声微泡可提高TDL复合物介导的基因在体外培养HUVEC的转染效率,并对细胞活性无明显影响,该方法为提高非病毒载体的转染效率提供一个新策略,可能成为缺血性心脏病基因治疗的有效手段之一.     

载基因微泡介导β-galactosidase质粒转染心肌细胞的对照研究

目的　观察不同的载基因微泡介导体外培养心肌细胞报告基因转染与表达,探讨微泡性质 与浓度在超声破裂微泡介导基因转染过程中的效应。方法　以β galactosidase质粒为报告基因,制备两 种不同性质的载基因微泡,利用诊断性超声破裂微泡进行体外心肌细胞基因转染,测定β galactosidase表 达水平并进行细胞活性检测。结果　超声载基因破裂氟烷气体微泡(PESDA)转染组心肌细胞β galactosidase表达约为单纯质粒转染组80倍(P<0.01),并在一定范围内随微泡浓度增加而增高。超声 破裂载基因PESDA转染组基因表达水平明显高于超声破裂载基因声振白蛋白微泡(ASDA)转染组(P< 0.05),而两组对细胞活性影响却无明显差异(P>0.05)。结论　超声微泡性质及浓度对超声破裂微泡介 导基因转染效率具有重要影响,低能量诊断性超声破裂载基因PESDA较超声破裂载基因ASDA能更为 有效地介导基因转染,是一种安全高效的基因传输方法。     

超声辐照微泡声学造影剂增强脂质体介导肝细胞基因转染的体外实验研究

目的研究超声破坏微泡声学造影剂提高脂质体介导肝细胞生长因子质粒（plRES—EGFP—HGF）在肝细胞中转染率的可行性。 方法将培养的肝细胞分为4组：（1）单纯对照组，（2）脂质体转染组，（3）超声辐照脂质体转染组，（4）超声辐照微泡＋脂质体转染组。第（4）组按照每孔加入造影剂剂量又分为1）10μl组，2）20μl组，3）30μl组，4）40μl组4亚组。超声辐照微泡＋脂质体转染组在脂质体介导肝细胞生长因子转染肝细胞1h后，在24孔板中每孔加入微泡声学造影剂10，20，30或40μl，超声辐照60s。24h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况、MTT法检测肝细胞增殖率和流式细胞仪检测基因转染率。 结果超声频率1MHz，功率0．5W／cm。辐照60S，每孔加入造影剂30μl时肝细胞基因转染效率最高，与脂质体转染组比较有显著性。 结论在一定条件下，超声辐照微泡声学造影剂可明显提高脂质体介导肝细胞基因转染效率，为基因治疗提供了新的思路。     

超声波与微泡声学造影剂增强基因定位转染动物实验研究

目的观察经静脉注射基因与微泡声学造影剂,同时经皮超声辐照肝脏方式能否增强小鼠肝脏基因定位转染及其转染效率.方法昆明种小白鼠24只,随机分为4组,每组6只.第1组为单纯质粒转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg乙型肝炎核心抗原(pcDNA3.1/HBV)质粒的生理盐水溶液.第2组为单纯微泡转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的微泡声学造影剂.第3组为单纯超声转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的生理盐水溶液,同时采用频率为1 MHz、声强为0.5 W/cm2的超声波经小白鼠体表肝区辐照1 min.第4组为超声与微泡转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的微泡声学造影剂,同时经小白鼠体表肝区局部采用相同剂量超声辐照1 min.7天后处死小鼠,分别取肝、肾、肺、心、脾、骨骼肌组织进行pcDNA3.1/HBV免疫组化检测,记录不同组织每高倍视野(×400)pcDNA3.1/HBV表达阳性细胞数.结果第1、2组肝、肾组织内偶见pcDNA3.1/HBV表达弱阳性细胞,肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达阳性细胞.第3组肝组织内可见少量pcDNA3.1/HBV阳性细胞,每高倍视野表达阳性细胞(26.5±3.9)个.肾、肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达.第4组肝组织内pcDNA3.1/HBV表达最强,每高倍视野表达阳性细胞(84.2±4.4)个,为第3组的约3.2倍.肾、肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达.结论静脉注射黏附质粒的微泡声学造影剂同时经体表给予一定强度的超声辐照,能显著增强辐照部位局部组织的基因转染与表达,有望成为一种安全、高效的体内基因定位转染新技术.     

超声波与微泡声学造影剂增强体外培养肿瘤细胞基因转染实验研究

目的观察超声波与微泡声学造影剂能否增强体外培养肿瘤细胞基因转染及其转染效率,初步摸索适宜的超声辐照条件.方法将培养的HepG2细胞分为3组,第1组为单纯造影剂转染组:加入5 μg绿色荧光蛋白质粒(PEGFP-C1)与微泡声学造影剂混合液进行转染;第2组为脂质体转染组:用相同浓度PEGFP-C1质粒进行常规脂质体转染;第3组为造影剂加超声辐照转染组:加入5 μg PEGFP-C1质粒与微泡声学造影剂混合液,然后分别用0.25 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2超声波经培养板底部辐照10 s.24 h后用荧光显微镜观察各转染组细胞荧光蛋白表达情况,计录每高倍视野(400×)荧光蛋白表达阳性细胞数.结果单纯造影剂转染组未见荧光蛋白表达阳性细胞,造影剂加超声辐照转染组可见不同程度荧光蛋白表达,其中以0.5 W/cm2超声辐照组表达最强,每高倍视野绿色荧光蛋白表达阳性细胞数为(20.7±3.2)个/HP,高于0.25 W/cm2与1.0 W/cm2超声辐照组[分别为(4.8±1.9)个/HP;(9.9±2.3)个/HP],与脂质体转染组[(22.1±3.5)个/HP]比较无显著差异(P>0.05).结论微泡声学造影剂加一定强度的超声辐照能显著增强体外培养肿瘤细胞的基因转染与表达,超声辐照条件是影响转染率的重要因素,适宜条件时其转染效率与常规脂质体转染方法无显著差异.     

超声微泡介导野生型P53联合RB94基因转染HXO-Rb44细胞的实验研究

目的探讨超声微泡介导抑癌基因wtp53和Rb94基因转染对视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞的生长抑制作用。方法以一定能量的超声介导wtp53、Rb94单独或联合转入视网膜母细胞瘤细胞株HXO-Rb44中,RT-PCR证实外源目的基因的表达后,MTT法检测不同基因转染后细胞的生长情况;转染48 h后流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测细胞bax蛋白表达。结果 RT-PCR结果显示单独或联合转染两基因的细胞,转入的外源性基因均被表达。与未转染的空白组HXO-Rb44细胞相比,联合转染wtpP53及Rb94基因的细胞生长速率明显降低,细胞增殖受抑制最明显,细胞凋亡率最高,凋亡相关蛋白bax表达量最多。结论超声微泡联合转染wtp53及Rb94基因比单独转染wtp53或Rb94基因在抑制HXO-Rb44细胞生长效应方面效果更强。     

超声介导脂膜微泡靶向传输绿色荧光蛋白基因的体内实验研究

目的探讨超声（US）对裸鼠人宫颈癌（Hela）皮下移植瘤绿色荧光蛋白（EGFP）基因传输和定位的作用以及脂膜微泡（LSMB）对转染的增强作用。方法将LSMB和质粒经裸鼠尾静脉注入,并予以超声辐照（LSMB＋US）,辐照条件为：2.0W/cm^2,20%占空比,2min,以仅质粒注射（P）、质粒注射加超声辐照（US＋P）、LSMB和质粒注射（LSMB＋P）作为对照,行冰冻切片和组织学检查,通过荧光评分评估EGFP表达,并对表达持续时间和靶向性进行分析。结果注射质粒和LSMB联合超声辐照可明显增加基因转染效率,LSMB＋US组的裸鼠皮下移植瘤内有显著的EGFP表达,均高于P组、US＋P组或LSMB＋P组（P〈0.01）;基因表达的最佳时间是第3天（P〈0.01）;无论有否超声照射,裸鼠其他器官组织中均无明显的EGFP表达,且未观察到明显的组织损伤。结论超声辐照联合LSMB和质粒注射的方法能显著增加裸鼠移植瘤的基因转染,而无明显的副作用,是一种高效的非病毒基因传输方法,为目前的基因治疗提供新思路。     

超声联合微泡介导神经营养因子-3基因转染神经干细胞实验研究

目的探讨体外利用超声联合微泡介导神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)基因转染神经干细胞的有效性和适宜超声参数。方法体外培养神经干细胞,在24孔板中加入200μl微泡(3×10~8/ml)和20μl pEGFP-NT 3基因重组质粒(1μg/μl),再加入500μl神经干细胞悬液(5×10~5/ml),在不同的超声条件下(声强分别为1、1.5、2 W/cm~2,照射时间分别为30、60、90、120、150 s),用1 MHz非聚焦探头辐照上述混合液,转染后在荧光显微镜下观察重组质粒转染效率,锥虫蓝染色检测神经干细胞活性。空白对照组为无超声辐照的质粒与神经干细胞的混合物。结果 (1)转染48 h后绿色荧光表达最强;(2)声强1.5 W/cm~2、照射时间60 s为本实验适宜的超声条件,此时神经干细胞基因转染率最高,且细胞活性较高。结论超声联合微泡介导NT 3基因转染神经干细胞具有可行性,为神经干细胞基因转染提供了新方法 。     

超声微泡破碎技术与基因转染研究进展

基因治疗是21世纪最具革命性的治疗手段,其用于人类各种疾病有许多潜在的优势,但基因治疗用于临床进展缓慢。问题在于缺乏安全有效的靶向性基因输送系统,且不能保证基因表达的长效性和稳定性。目前的载体中病毒载体转染效率高,但具有致突变性和免疫原性等潜在威胁,质粒和脂质体毒性低但转染效率低。近几年有报道证实超声微泡破碎技术（ultrasound microbubble destruction,UTMD）能有效增强基因转染效率。2000年有学者首次报道用超声微泡进行基因转染。     

超声微泡造影剂对心肌组织毛细血管通透性的影响实验研究

目的　研究超声破坏微泡造影剂对靶区内心肌组织毛细血管通透性的影响 ;探讨超声微泡造影剂增强基因转染的机制。方法　 2 4只健康雄性 Wistar大鼠 ,取 15只分为 3组 ,第 1组经静脉输入含有伊文思蓝 (Evans blue,EB)的微泡造影剂 ,并采用超声波在鼠胸壁辐照约 6 min破坏心肌组织内造影剂 ;第 2组采用超声照射 ,同时经静脉单纯输入 EB溶液 ;第 3组单纯经静脉输入 EB作为对照。照射完毕 2 h后放血处死大鼠 ,使用标准曲线和分光光度法测量各组大鼠心肌组织中 EB含量 (作为反映血管通透性的指标 )。另 9只大鼠随机分为 3组 ,每组 3只。第 1组经静脉输入微泡造影剂 ,并采用超声波在鼠胸壁辐照约 6 min破坏心肌组织内造影剂 ;第 2组单纯采用超声照射 ;第 3组不加任何处理 ,作为对照。照射完毕即刻处死大鼠 ,取心肌组织进行电镜观察毛细血管的改变。结果　采用超声照射 ,并经静脉输入微泡造影剂的大鼠 ,心肌组织中 EB含量为 (75 .33± 16 .80 )μg/ g,比单纯超声照射[(32 .2 1± 9.5 3)μg/ g]及心肌正常组织 EB含量 [(37.16± 7.98)μg/ g]明显增加 (P<0 .0 5 )。电镜结果显示超声破坏微泡后 ,能使毛细血管破裂 ,红细胞溢出于毛细血管外。结论　超声波触发破坏微泡造影剂后能使心肌组织毛细血管通透性增加 ,可     

超声微泡介导EGFP转染正常大鼠关节滑膜组织的研究

目的 探讨超声微泡介导EGFP转染大鼠关节滑膜组织的可能性.方法 24只正常清洁级Wister大鼠;4只为单纯对照组,20只为实验组.实验组根据质粒的剂量又分4组,每组5只(10个膝关节),1组:超声+微泡+1μg EGFP;2组:超声+微泡+5μgEGFP;3组:超声+微泡+10μg EGFP;4组:超声+微泡+15μg EGFP.将300μl SonoVue与EGFP混合,注射入大鼠关节腔内,超声持续照射10 min.3 d后取大鼠膝关节滑膜组织,直接贴在载玻片上,在荧光显微镜480 nm波长激发状态下观察EGFP转染效果.结果 1μg和5μg EGFP组与单纯对照组比较,荧光强度稍有增强,但是不明显;而10μg和15μg组荧光强度与单纯对照组比较均有明显增强.结论 超声介导微泡可以实现EGFP质粒对正常大鼠关节滑膜组织的转染,10μg EGFP是本实验的最佳剂量.     

亚微米级超声微泡造影剂的制备及体外基因转染效率的实验研究

目的 探索制备亚微米级超声微泡造影剂的方法 ,以GFP作为目的 基因验证其作为一种新型基因载体的可行性.方法 以高剪切分散法制备超声微泡造影剂,透射电镜及激光粒度分析仪检测其形态及粒径;将超声微泡造影剂与不同剂量的绿色荧光蛋白质粒PShuttle-IRES-hrGFP-1结合后转染HepG2细胞,利用荧光显微镜观察并检测其基因转染效率.结果 自制超声微泡造影剂为均匀分散的圆泡,粒径分布在282.2～415.7 nm之间,平均值为(335±5)nm,达到亚微米级;该微泡能将GFP基因成功转运到HepG2细胞内并高效表达,转染效率达32.61%±3.42%.结论 自制亚微米级超声微泡造影剂粒径小、分散均匀,并能成功转运外源DNA进入细胞内,可作为一种新型基因载体.     

评价超声联合白蛋白微泡造影剂实现基因转染靶向性的研究

目的 评价超声联合白蛋白微泡造影剂实现基因转染的靶向性.方法 选择增强型绿色荧光蛋白质粒为报告基因,经股静脉输入黏附质粒的白蛋白微泡的同时在大鼠背部脊斜肌区域经皮辅予一定强度的超声照射对大鼠脊斜肌行基因转染,转染7 d后,取脊斜肌、肝、肾、心肌组织快速冷冻切片,荧光显微镜下观察各组织内的荧光表达.结果 脊斜肌组织中可见较多特异性绿色荧光,多位于微血管周围,荧光强度较其余组织明显增强(P<0.05),肝脏、肾脏组织中见少量特异性绿色荧光,肝脏荧光强度约为肾脏的4倍(P<0.05),心肌组织中未见特异性绿色荧光.结论 静脉注射黏附质粒的微泡声学造影剂同时经体表给予一定强度的超声辐照,可以较好地实现基因的靶向转染.     

超声微泡-阳离子纳米脂质体复合体制备的实验研究

目的 利用生物素亲和素系统连接超声微泡与阳离子纳米脂质体,制备一种新型的基因载体.方法 机械振荡法制备生物素化超声微泡(Bio-MB).薄膜分散-膜挤压法制备生物素化阳离子纳米脂质体(Bio-CNLP).采用生物素亲和素系统偶联Bio-MB与Bio-CNLP.以非生物素化超声微泡(MB)加非生物素化阳离子纳米脂质体(CNLP)组作为对照,行激光共聚焦显微镜观察复合物形态与连接效果.结果 Bio-CNLP的平均粒径约291.7 nm,平均表面电荷约(21.6±2.1)mV.激光共聚焦显微镜下Bio-MB+Bio-CNLP组可见绿色Bio-MB壁因连接Bio-CNLP而不光滑,周围可见红色小圆形点状Bio-CNLP呈花环状聚集,而MB+CNLP组MB壁光滑,周围未见CNLP聚集.结论 生物素亲和素系统可成功将Bio-CNLP与Bio-MB牢固连接,有望为肿瘤基因治疗提供一种新的手段,为探索基因载体和转染方法提供一种新的思路.     

超声辐照联合微泡造影剂介导人血管生成素-1基因体外转染293T细胞的研究

目的 探讨超声辐照联合微泡造影剂的基因转染系统介导人血管生成素-1(hAng-1)基因转染人胚肾293T细胞的转染效率.方法 将六孔板中的293T细胞悬液分为4组:A组,超声+质粒组,每孔加入10 μg目的 基因质粒;B组,超声+微泡+质粒组,每孔加入微泡和质粒混合液,终浓度分别为质粒10 μg/孔,微泡200 μl/孔;C组,脂质体+质粒组,每孔加入4 μl脂质体和5 μg质粒;D组,对照组,每孔仅加入10 μg目的 基因质粒.A组和B组均接受超声辐照,照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,作用时间为30 s.转染后48 h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量观察基因的转染效率.结果 48 h后,荧光显微镜下观察到转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组、D组的基因转染效率分别为(3.5±0.4)%、(20.8±1.2)%、(18.0±0.9)%和(0.2±0.1)%.结论 超声本身即有促进基因转染的作用,超声辐照联合微泡造影剂后则增强了这种作用,明显增加了基因的转染效率.