长链非编码RNA XLOC_005009在食管鳞状细胞癌中的表达及其甲基化状态

[目的]通过检测长链非编码RNA XLOC 005009在人食管癌细胞系及食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中的表达情况及其甲基化状态,探讨XLOC_005009基因在食管鳞癌发生、发展中的作用及表观遗传学失活机制.[方法]分别应用逆转录一聚合酶链反应以及甲基化特异性聚合酶链反应的方法检测XLOC_005009基因在DNA甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC处理前后的食管癌细胞系(TE1、TE13、T.Tn、Eca109)以及57例食管鳞癌组织及相应癌旁正常组织中的表达情况和各位点的甲基化状态.[结果] XLOC_005009基因的表达在5-Aza-dC处理后的4株细胞系中表达增高,在5-Aza-dC处理前的4株细胞系中XLOC_005009基因的3个位点均表现为高甲基化状态,在5-Aza-dC处理后,各位点甲基化程度均降低.XLOC 005009基因在ESCC中的表达明显低于对应癌旁正常组织(0.21±0.22 vs 0.32±0.29,P＜0.05),其远端CpG岛及第2外显子区甲基化率在ESCC与其癌旁正常组织中差异无统计学意义,且其在发生甲基化的ESCC与未发生甲基化的ESCC中的表达无统计学差异.第一外显子区甲基化率在ESCC中显著高于其癌旁正常组织[45.61％(26/57)vs 19.30％(11/57),P＜0.05],并与淋巴结转移、组织分化程度及TNM分期密切相关,且此位点发生甲基化的ESCC中该基因的表达显著低于未发生甲基化的ESCC组织(0.06±0.06 vs 0.33±0.23,P＜0.05).[结论]XLOC_005009基因在食管癌细胞系和ESCC中的低表达与ESCC的发生、发展密切相关,且其第一外显子区甲基化异常增高可能是导致其表达沉默的机制之一.     

SHP-1 在食管鳞状细胞癌组织中异常低表达的表观遗传学调节机制及其临床意义

目的：探讨食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）组织中蛋白酪氨酸磷酸酶1（protein tyrosin phosphatase 1，SHP-1）基因异常低表达的表观遗传学调节机制及其临床意义。方法：所用组织标本均来自河北医科大学第四医院2008-2011 年行食管癌根治术并且病理诊断为ESCC患者的癌组织及相应癌旁组织（距癌灶边缘2 cm以上），共71 例。ESCC细胞株（Eca109、Kyse170、Yes-2）培养完成后，进行甲基化抑制剂5-Aza-dC 或组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理，qPCR和Western blotting 实验检测ESCC组织和细胞系中SHP-1 mRNA和蛋白的表达变化，亚硫酸氢盐基因组测序（bisulfite genome sequencing，BGS）法检测ESCC 细胞系中SHP-1 基因启动子区CpG 位点的甲基化频率，甲基化特异性PCR（methylation specific PCR，MSP）技术检测ESCC组织和细胞中SHP-1 启动子区的甲基化状态，应用双荧光素酶报告基因实验检测SHP-1 启动子区CpG岛甲基化对其转录活性影响。分析ESCC组织中SHP-1 甲基化状态分别与临床病理特征和SHP-1 mRNA表达的关系，对组织SHP-1甲基化水平与ESCC患者生存率进行Kaplan-Meier 生存分析和Log-Rank 检验。结果:5-Aza-dC 处理后，SHP-1 mRNA蛋白在3种细胞株中的表达显著上调（均P<0.05），同时其启动子区的甲基化程度均明显降低(均P<0.05）；应用TSA处理细胞株后，SHP-1在各细胞株中的表达情况及甲基化状态无明显改变(P>0.05）；甲基转移酶处理细胞荧光素报告载体活性显著低于未处理细胞荧光素报告载体活性（P<0.05），表明SHP-1 的甲基化可抑制自身的转录。ESCC组织中启动子区的甲基化率明显高于癌旁组织（P<0.05），并与TNM分期、病理分级及淋巴结转移密切有关(P<0.05）；与癌旁组织相比，ESCC组织中SHP-1 mRNA相对表达量显著降低（P<0.05），并与启动子区甲基化有关（P<0.05）；Kaplan-Meier 分析显示，启动子区高甲基化与ESCC患者的不良预后有关（P<0.05）。结论：ESCC组织和细胞株中SHP-1 基因启动子区高甲基化状态可抑制其自身的转录活性，进而导致该基因表达沉默；SHP-1的高甲基化与ESCC患者预后不良有关，SHP-1 的甲基化状态可能成为ESCC患者预后的评估指标。     

食管鳞状细胞癌中Smad4基因CpG岛甲基化状态分析

目的：探讨食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中Smad4（mothers against decapentaplegic homolog 4）基因启动子区及第一外显子区的CpG岛甲基化状态及其与Smad4蛋白、TGF-β1蛋白表达之间的相关性。方法：128例ESCC组织标本采集自河北医科大学第四医院2004-2008年的手术病例,每例患者均取癌旁正常黏膜组织作对照。分别应用甲基化特异性PCR（methylmion specific PCR,MSP）、RT-PCR和免疫组织化学法检测ESCC组织及相应癌旁组织中Smad4基因CpG岛的甲基化情况、Smad4 mRNA和Smad4蛋白表达情况,应用免疫组织化学法检测TGF-β1的蛋白表达情况。结果：ESCC组织中Smad4基因启动子区CpG岛甲基化率为5.5%（7/128）,第一外显子5′非翻译区CpG岛甲基化率为305%（39/128）;相应癌旁正常黏膜组织均未检测到这两个位点的甲基化（P<0.05）;ESCC组织中Smad4甲基化率显著高于癌旁正常组织（P<005）。ESCC组织中Smad4 mRNA及蛋白表达显著低于癌旁正常组织（P<0.05）,且与Smad4甲基化相关。TGF-β1蛋白在ESCC组织中的表达率（66.4%）显著高于相应癌旁正常组织（21.9%,P<0.01）,且随ESCC分期的增高和分化程度的降低而升高（P<0.05）。Smad4和TGF-β1蛋白在ESCC中的表达呈明显的负相关（P<0.01)。结论: Smad4基因CpG岛甲基化及TGF-β1的过表达可能是ESCC发生机制之一,其中Smad4基因第一外显子5′非翻译区CpG岛比启动子区CpG岛更易发生甲基化,从而导致Smad4基因沉默。     

MicroRNA-203在人食管鳞癌组织和细胞中的表达及其基因的甲基化状态

目的：检测人食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）组织及细胞中MicroRNA-203(miR-203)的表达及其基因的甲基化状态,探讨miR-203在ESCC发生及发展中的作用。方法：选取河北医科大学第四医院2008—2011年间手术切除的83例ESCC原发灶组织及癌旁组织标本,实时定量PCR与甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）分别检测其miR-203的表达及其编码基因的甲基化状态。用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycitydine, 5-Aza-dC）处理食管癌细胞系（TE1、TE13、YES-2、EC109、T.TN）,实时定量PCR与MSP分别检测5-Aza-dC处理对食管癌细胞中miR-203的表达及其基因甲基化状态的影响。结果：五种食管癌细胞中miR-203的表达均相对较低,且呈高甲基化状态。5-Aza-dC处理后,miR-203的表达均显著升高（ P <0.05或 P <0.01）;YES-2细胞中miR-203编码基因的甲基化程度显著降低,其余4种细胞均转变为非甲基化状态。miR-203在ESCC组织中的表达显著低于癌旁组织（0.54±0.11 vs 1.00±001, P <0.01）,启动子区甲基化率显著高于癌旁组织\[62.65%（52/83) vs 7.23% (6/83）, P <0.01\],并且两者均与TNM分期和组织分化程度有关（ P<0.05）。发生miR-203编码基因甲基化的ESCC组织中miR-203的表达显著低于未发生甲基化的ESCC组织（ P <005）。结论： miR-203在ESCC组织与细胞中呈低表达,与食管鳞癌的发生、发展有关,且其启动子区甲基化可能是导致其表达沉默的机制之一。     

Ras相关区域家族7基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的：检测人食管鳞癌 (esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)组织中Ras相关区域家族7（Ras-association domain family 7,RASSF7）基因的mRNA、蛋白表达情况及其甲基化状态,探究RASSF7 在ESCC发生发展中的作用。方法：组织标本取自河北医科大学第四医院2011—2012年间手术切除的69例ESCC原发灶组织及癌旁组织。分别应用RT-PCR及甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)方法检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycitydine, 5-Aza-dC）处理前后的4株食管癌细胞系（TE13、T.Tn、YES-2、Ec109）和69例病灶组织及其癌旁组织中RASSF7 mRNA表达水平及甲基化状态,应用免疫组织化学方法检测69例ESCC组织及相应癌旁组织中RASSF7的蛋白表达。结果：RASSF7基因在TE13、T.Tn、YES-2细胞系中表达阳性,在Ec109细胞系中表达缺失;经5-Aza-dC处理后,RASSF7在TE13、T.Tn、YES-2细胞中表达下调,在Ec109细胞中表达阳性。5-Aza-dC处理前后4株食管癌细胞系中均未检测到RASSF7 的甲基化。人ESCC组织中RASSF7 的mRNA相对表达量（0.63±0.08 vs 0.42±0.20,P<0.01）与蛋白表达阳性率\[81.2%（56/69） vs 53.6%（37/69）,P<0.01\]均显著高于相应癌旁组织,且均与患者的淋巴结转移情况及分化程度有关（P<0.05或P<001）,与TNM分期、年龄和性别无关（均P>0.05）。ESCC组织和相应癌旁组织中均未检测到RASSF7的甲基化。结论：4株食管癌细胞系、人ESCC组织和癌旁组织中RASSF7基因的表达差异与RASSF7 本身甲基化状态无关,ESCC组织中RASSF7 的高表达可能参与了ESCC的发生及转移。     

DNA修复酶基因MGMT启动子区异常甲基化与食管癌的关系

背景与目的： 分析食管癌组织中MGMT启动子区CpG岛甲基化状态和食管癌发病风险的关系,探讨MGMT基因启动子的异常甲基化在食管癌筛查及早期诊断中的意义。 材料与方法： 对江苏淮安的91例新发食管癌病例的癌组织、癌旁组织及外周血血浆样本提取DNA,应用甲基化特异性PCR(MSP)分析MGMT启动子区CpG岛的甲基化状态;对食管癌组织和癌旁组织提取总RNA,采用SYBR GREEN I 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定MGMT的mRNA水平。 结果： MGMT启动子区CpG岛异常甲基化与食管癌发病风险增高有关联 (OR=7.750, 95％CI=2.736～21.955);MGMT启动子区CpG岛甲基化状态与MGMT mRNA水平无显著相关;血浆循环DNA中MGMT启动子区CpG岛甲基化与癌组织中MGMT启动子区CpG岛甲基化相关(P<0.01),血浆循环DNA中MGMT启动子区CpG岛甲基化检出率与癌组织中MGMT启动子区CpG岛甲基化检出率中度相关(Kappa=0.603, P<0.01)。 结论： MGMT基因的启动子区CpG岛的异常甲基化与食管癌发病风险增加有关;检测血浆循环DNA中MGMT基因启动子的异常甲基化,可为食管癌的筛查、早期诊断提供有价值的信息。     

miR-6867及其宿主基因RAPGEFL1在食管鳞状细胞癌组织和细胞系中的表达及甲基化状态

目的:检测miR-6867及其宿主基因Rap型鸟苷酸交换因子1(rap guanine nucleotide exchange factor like l,RAPGEFL1)在食管癌细胞系及食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中的表达水平及甲基化状态,并探讨其在ESCC发生发展中的作用.方法:选取河北医科大学第四医院2014年1月至2016年1月收治的ESCC手术患者组织标本87例.应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-6867及RAPGEFL1在食管癌细胞系和ESCC组织及其相应癌旁组织中的表达水平,分析miR-6867和RAPGEFL1基因表达之间的相关性.应用甲基化特异性PCR法(MSP)检测RAPGEFL1在食管癌细胞系和ESCC组织及其相应癌旁组织中的甲基化状态.结果:miR-6867在ESCC组织中的相对表达量显著低于其相应癌旁组织(P＜0.05),并与淋巴结转移及TNM分期有关(P＜0.05);RAPGEFL1基因在ESCC组织中的表达显著低于其相应癌旁组织(P＜0.05),并与淋巴结转移、组织分化程度及TNM分期相关(P＜0.05);miR-6867与RAPGEFL1在ESCC组织中的表达呈明显正相关(P＜0.05).5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)处理后,4种食管癌细胞系中miR-6867和RAPGEFL1基因的表达均增高,并且其甲基化程度明显降低.RAPGEFL1基因在ESCC组织中的甲基化率显著高于其相应癌旁组织(P＜0.05),并与淋巴结转移、组织分化程度及TNM分期有关(P＜0.05).结论:ESCC的发生发展可能与miR-6867和RAPGEFL1的异常低表达及RAPGEFL1高甲基化状态有关,miR-6867与RAPGEFL1表达具有一致性,且RAPGEFL1基因启动子区甲基化可能是导致miR-6867与RAPGEFL1表达沉默的机制之一.     

miR-6803和PPP6R1在食管鳞状细胞癌组织和细胞中的表达及其甲基化状态与患者临床病理特征的关系

目的:探讨微小RNA-6803(miR-6803)及其宿主基因蛋白磷酸酶6调节亚单位1(protein phosphatase 6 regulation subunit 1,PPP6R1)在食管鳞状细胞癌(ESCC)中的表达和PPP6R1基因启动子区甲基化状态及其在ESCC发生及发展中的作用.方法:采用2013年至2014年间河北医科大学第四医院生物标本库的72例ESCC手术患者癌组织及对应的癌旁组织标本,用实时荧光定量PCR法检测miR-6803和PPP6R1在ESCC组织及其癌旁组织和DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理前后的ESCC细胞株TE1、TE13、Eca109、T.TN、Kyse170中的表达水平.用甲基化特异性PCR(MSP)法检测ESCC细胞系和组织及其癌旁组织中PPP6R1的甲基化状态,分析其与患者临床病理特征的关系.结果:ESCC组织中miR-6803和PPP6R1的表达水平显著低于癌旁组织(0.318±0.156,0.408±0.177 vs 1.000±0.001,均P＜0.05),miR-6803表达水平与淋巴结转移、组织分化程度及TNM分期密切相关(均P＜0.05);PPP6R1表达水平与TNM分期和组织学分化程度密切相关(均P＜0.05).ESCC组织中miR-6803和PPP6R1基因的表达具有显著相关性(P＜0.05).ESCC组织中PPP6R1的启动子区甲基化率显著高于癌旁组织(56.94％ vs 36.11％,P＜0.05),并与TNM分期和组织学分化程度密切相关(均P＜0.05),miR-6803-和PPP6R1基因的低表达与PPP6R1启动子区甲基化明显相关(P＜0.05).经5-Aza-dC处理后,5种ESCC细胞中miR-6803和PPP6R1的表达均升高,并且TE1、TE13、Kyse170细胞中PPP6R1基因甲基化程度降低,非甲基化程度增加,其余2种细胞中PPP6R1基因均表现为非甲基化状态.结论:miR-6803及其宿主基因PPP6R1的低表达可能与ESCC的发生发展密切相关,其启动子区甲基化可能是miR-6803和PPP6R1表达沉默的机制之一.     

长链非编码RNA XLOC_008370在食管鳞状细胞癌中的表达和甲基化状态及其与临床病理特征的关系

目的：检测食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）中长链非编码RNA XLOC_008370（long non-colding RNA XLOC_008370, lncRNA XLOC_008370）的表达及其甲基化状态,探讨XLOC_008370在ESCC发生及发展中的作用机制。方法：分别应用RT-PCR以及甲基化特异性PCR（methylation specific PCR, MSP）法检测DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycitydine, 5-Aza-dC）处理前后的ESCC细胞系（TE1、TE13、Eca109、T.TN、YES-2）以及ESCC组织及相应癌旁正常组织中XLOC_008370的表达和甲基化状态,分析其与临床病理特征的关系。结果：5种ESCC细胞中XLOC_008370的表达均呈阴性或弱阳性,经5-Aza-dC处理后,5种细胞中XLOC_008370的表达均升高。5种细胞中XLOC_008370基因呈高甲基化状态,应用5-Aza-dC处理后,Eca109、Yes-2细胞中XLOC_008370基因甲基化程度降低,非甲基化程度增加,其余3种细胞中XLOC_008370基因均表现为非甲基化状态。XLOC_008370在ESCC组织中的表达显著低于癌旁正常组织（P<0.05）,并与TNM分期和组织学分化程度密切相关（P<0.05）。ESCC组织中XLOC_008370的启动子区甲基化率为(54.02%, 47/87）,显著高于癌旁正常组织（9.20%, 8/87）（P<0.05）,并与TNM分期和组织学分化程度密切相关（P<0.05）。发生XLOC_008370甲基化的ESCC组织中XLOC_008370的表达显著低于未发生甲基化的ESCC组织（P<005）。结论： XLOC_008370的异常低表达可能与ESCC的发生密切相关,且其启动子区甲基化可能是导致其表达沉默的机制之一。     

胃癌ERCC1基因甲基化与蛋白表达的关系及其意义

  目的  检测胃癌组织、相应癌旁组织及正常胃组织中ERCC1蛋白表达情况，探讨ERCC1基因启动子CpG岛甲基化与蛋白表达的关系及其意义。  方法  采用甲基化特异性PCR技术，检测30例胃癌组织、相应癌旁组织、10例正常胃组织中ERCC1基因启动子CpG岛甲基化状态。采用免疫组织化学SP法检测胃癌组织、相应癌旁组织及正常胃组织中ERCC1蛋白的表达情况。  结果  胃癌组织中ERCC1基因启动子CpG岛完全甲基化率为46.7%（14/30），部分甲基化率为30.0%（9/30），总甲基化率为76.7%（23/30），显著高于相应癌旁组织中该基因的甲基化率13.3%（4/30），差异有统计学意义（P < 0.05）。10例正常胃组织中未检测到该基因的甲基化（0/10）。30例胃癌组织中ERCC1蛋白阴性表达率为70.0%（21/30），显著高于相应癌旁组织中蛋白阴性表达率33.3%（10/30），差异有统计学意义。10例正常胃组织中ERCC1蛋白均阳性表达。胃癌组织中发生ERCC1基因启动子CpG岛甲基化其ERCC1蛋白表达率明显低于胃癌组织中未发生ERCC1基因启动子CpG岛甲基化其ERCC1蛋白表达率。  结论  ERCC1基因启动子CpG岛甲基化与其蛋白表达呈负相关，ERCC1基因启动子CpG岛甲基化可能是导致其蛋白表达下调的主要原因之一。      

食管鳞癌中DACT2基因表达及甲基化状态研究

[目的]检测食管鳞状细胞癌(ESCC)中DACT2基因表达及启动子区甲基化状态,探讨DACT2基因在食管鳞癌发生发展中的作用.[方法]分别应用逆转录—聚合酶链反应(RTPCR)以及甲基化特异性PCR(MSP)的方法检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-dC)处理前后的食管癌细胞系(TE1、TE13、T.Tn、Eca109)以及食管鳞癌组织及相应癌旁组织中DACT2 mRNA表达情况及启动子区甲基化状态.[结果]经5-aza-dC处理后4种食管癌细胞系中DACT2基因的表达均增高.4种未经5-aza-dC处理的食管癌细胞系中DACT2基因呈高甲基化状态.应用5-aza-dC处理后,DACT2基因在4种细胞系中均呈非甲基化状态.DACT2基因在食管鳞癌组织中的表达显著低于癌旁组织(0.66±0.53 vs 0.95±0.64,t=-2.43,P=0.018),并与淋巴结转移密切相关(t=-2.030,P=0.048).食管鳞癌组织中DACT2基因的启动子区甲基化率显著高于癌旁组织(50.0％ vs 21.1％,x2=9.439,P=0.002),并与TNM分期、组织学分化程度和淋巴结转移密切相关(P均＜0.05).发生DACT2基因甲基化的食管鳞癌组织中DACT2基因的表达量显著低于未发生甲基化的食管鳞癌组织(0.46±0.32 vs 0.78±0.61,t=-2.341,P=0.023).[结论]DA CT2基因在食管鳞癌中的异常低表达与食管鳞癌的发生、发展密切相关,且其启动子区甲基化可能是导致其表达沉默的机制之一.     

SRY-box 17基因在食管鳞状细胞癌中异常甲基化及表达的研究

目的:检测食管磷癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)细胞株及组织标本中Wnt通路相关因子SRY-box 17基因的甲基化状态及表达情况,探讨其与食管鳞癌发生的相关性.方法:分别采用甲基化特异性-PCR(methylation specific-PCR,MSP)和RT-PCR的方法检测食管癌细胞株TE1、TE13及109例食管鳞癌及相应癌旁非肿瘤组织中SRY-box 17基因的甲基化状态及mRNA表达情况,并分析其与Wnit通路中心因子β-catenin蛋白表达的关系.结果:在食管癌细胞株TE1和TE13中,SRY-box 17基因mRNA均呈阴性或弱阳性表达,用甲基化抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)处理后,其mRNA全部恢复阳性表达;MSP检测结果显示,在食管癌细胞株中SRY-box 17基因均呈高甲基化状态;在食管癌组织标本中,SRY-box17基因的甲基率为89.0％ (97/109),明显高于癌旁组织的53.2％ (58/109)(P＜0.01);癌组织中SRY-box 17基因的甲基化率在Ⅲ和Ⅳ期肿瘤患者中明显高于Ⅰ和Ⅱ期患者(P＜0.05),而该基因的甲基化率与肿瘤患者的组织学分级无相关性;在癌组织中该SRY-box17mRNA的阳性表达率为28.4％(31/109),明显低于癌旁组织(P＜0.01).其mRNA表达的缺失率及通路中心因子β-catenin蛋白的异质表达率均与该基因的甲基化状态有相关性(P＜0.05).结论:食管鳞癌组织及细胞株中SRY-box 17基因均呈高甲基化状态,该基因的高甲基化可能是引起mRNA表达下调的重要机制之一,并可能通过Wnt/β-catenin信号转导通路的激活在食管癌的发生、发展中具有重要作用;对该基因的甲基化检测可能对食管癌的预后判断有一定的临床指导意义.     

食管鳞癌中CAV-1基因的表达及甲基化状态

背景与目的：作为重要的表观遗传学现象之一,DNA甲基化对基因表达发挥着重要的调控功能。研究表明肿瘤细胞基因组正常DNA甲基化模式异常改变所导致的肿瘤相关基因功能异常可能参与肿瘤发生与发展。本研究通过检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinomas,ESCC)组织中质膜微囊蛋白-1(caveolin-1,CAV-1)基因的表达及甲基化状态,探讨CAV-1基因在食管鳞癌发生及发展中的作用。方法：分别应用甲基化特异性PCR(MSP)、RT-PCR法、免疫组织化学SP法检测食管癌及相应癌旁正常黏膜组织标本中CAV-1基因甲基化状态、mRNA及蛋白表达情况。结果：CAV-1 mRNA在食管癌和癌旁正常组织中的表达量分别为0.86±0.56和0.40±0.36,食管癌组织中CAV-1 mRNA表达量明显高于癌旁正常组织,2者差异有统计学意义(P<0.05)。CAV-1 mRNA表达与患者的淋巴结转移及肿瘤组织学分级有关(P<0.05);食管鳞癌组织中,CAV-1蛋白表达阳性率为66.7%(34/51);显著高于正常食管黏膜组织(15.7%,8/51)(P<0.01)。CAV-1蛋白表达与患者的淋巴结转移有关(P<0.05),而与肿瘤的临床分期和分化程度无关(P>0.05)。51例食管癌组织中1例发生了基因启动子区甲基化,甲基化率为2.0%(1/51);而相应癌旁正常黏膜组织中未发现有该基因的甲基化现象。食管癌组织中该基因的甲基化率与相应癌旁正常组织相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：CAV-1基因在食管鳞癌组织中mRNA及蛋白表达均明显高于癌旁正常黏膜组织,该基因的高表达对于肿瘤的发生及淋巴结的转移起到了一定的促进作用;癌及癌旁组织中该基因的表达异常均与该基因的甲基化状态无关。     

lncRNA NUP50-AS1 在食管鳞癌组织中的表达及其对Eca109 细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）NUP50-AS1 在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell cancer, ESCC）组织及细胞株中的表达及其对人食管癌Eca109 细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法：选取自2015 年1 月至2016 年12 月河北医科大学第四医院生物标本库的49 例ESCC手术患者的癌组织和相应癌旁组织,qRT-PCR检测ESCC癌组织、癌旁组织及5 种食管癌细胞株（TE1、TE13、Eca109、Kyse150 和Kyse170）中NUP50-AS1 表达水平。shRNA 转染NUP50-AS1 后,选用sh2 -NUP50-AS1 进行后续功能实验。采用MTS法、克隆形成实验检测敲减NUP50-AS1 表达对Eca109 细胞增殖的影响,划痕实验检测敲减NUP50-AS1 表达对细胞迁移的影响,Transwell 小室实验检测敲减NUP50-AS1 表达对细胞侵袭的影响。结果：NUP50-AS1 在ESCC组织中的相对表达量显著高于癌旁组织(2.003±0.870 vs 1.000±0.000,P<0.05）;NUP50-AS1 在ESCC组织中的表达水平与淋巴结转移及TNM分期相关（均P<0.01）,NUP50-AS1 在5 株食管癌细胞系中相对表达量均明显上调（P<0.05）,其中Eca109 细胞的NUP50-AS1 表达水平最高。转染后,sh2-NUP50-AS1 转染组干扰效率最高,敲低NUP50-AS1 可明显抑制Eca109 细胞增殖、迁移和侵袭能力。结论：ESCC组织中lncRNA NUP50-AS1 表达明显高于癌旁组织,且与癌症分期和淋巴结转移有关,敲减其表达明显抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,NUP50-AS1 的高表达可能与ESCC的发生发展密切相关。     

Bin1甲基化对食管鳞状细胞癌TE13细胞侵袭能力的影响

目的:检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞株TE13中(bridge integration factor1,Bin1)甲基化状态,分析去甲基化药物5-Aza-dC去甲基化前后Bin1表达水平、甲基化状态及细胞生物活性的变化,探讨ESCC发生的可能机制及治疗策略.方法:采用qRT-PCR方法检测去甲基化前后TE13细胞Bin1 mRNA的表达,MSP法检测ESCC细胞株TE13中Binl启动子区甲基化状态,划痕实验及Transwell实验分别检测去甲基化对TE13细胞迁移及侵袭能力的影响,Western blotting法检测Bin1与基质金属蛋白酶2(MMP-2)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达变化.结果:TE13细胞株中Bin1表现为完全甲基化状态,Bin1 mRNA呈低表达,经5-Aza-dC处理后Bin1 mRNA表达显著升高(P＜0.01);划痕试验及Transwell试验显示去甲基化处理可明显降低TE13细胞迁移、侵袭能力(P＜0.01);经5-Aza-dC处理后Bin1蛋白表达显著升高(P＜0.01),MMP-2和MMP-9蛋白表达显著降低(均P＜0.01).结论:DNA甲基化是Bin1低表达或缺失的重要机制之一,并可能通过调节MMP-2和MMP-9蛋白的表达,影响食管鳞状细胞癌细胞株TE13迁移、侵袭能力.     

CpG island methylation status of miRNAs in esophageal squamous cell carcinoma

Previous studies on esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) indicated that it contains much dysregulation of microRNAs (miRNAs). DNA hypermethylation in the miRNA 5' regulatory region is a mechanism that can account for the downregulation of miRNA in tumors (Esteller, N Engl J Med 2008;358:1148-59). Among those dysregulated miRNAs, miR-203, miR-34b/c, miR-424 and miR-129-2 are embedded in CpG islands, as is the promoter of miR-34a. We investigated their methylation status in ESCC by bisulfite sequencing PCR (BSP) and methylation specific PCR (MSP). The methylation frequency of miR-203 and miR-424 is the same in carcinoma and in the corresponding non-tumor tissues. The methylation ratio of miR-34a, miR-34b/c and miR-129-2 is 66.7% (36/54), 40.7% (22/54) and 96.3% (52/54), respectively in ESCC, which are significantly higher than that in the corresponding non-tumor tissues(p < 0.01). Quantitative RT-PCR analysis in clinical samples suggested that CpG island methylation is significantly correlated with their low expression in ESCC, 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC) treatment partly recovered their expression in EC9706 cell line. We conclude that CpG island methylation of miR-34a, miR-34b/c and miR-129-2 are frequent events and important mechanism for their low expression in ESCC. DNA methylation changes have been reported to occur early in carcinogenesis and are potentially good early indicators of carcinoma (Laird, Nat Rev Cancer 2003;3:253-66). The high methylation ratio of miR-129-2 indicated its potential as a methylation biomarker in early diagnosis of ESCC.     

Frequent methylation-associated silencing of a candidate tumor-suppressor, CRABP1, in esophageal squamous-cell carcinoma

Epigenetic alterations and the resulting inactivation of tumor suppressor genes often contribute to the development of various cancers. To identify novel candidates that may be silenced by aberrant methylation in esophageal squamous-cell carcinoma (ESCC), we analysed ESCC cell lines by a recently developed method known as bacterial artificial chromosome array-based methylated CpG island amplification (BAMCA), and selected candidates through BAMCA-assisted strategy. In the course of this program, we identified frequent CpG methylation-dependent silencing of the gene encoding cellular retinoic acid binding protein 1 (CRABP1) in our panel of ESCC cell lines. Expression of CRABP1 mRNA was restored in gene-silenced ESCC cells after treatment with 5-aza 2'-deoxycytidine. The DNA methylation status of the CRABP1 CpG island with clear promoter activity correlated inversely with expression of this gene. CpG methylation of CRABP1 was frequently observed in primary ESCC tissues as well. Restoration of CRABP1 expression in ESCC cells lacking the protein reduced cell growth by inducing arrest at G(0)-G(1), whereas knockdown of the gene in cells expressing CRABP1 promoted cell growth. Among 113 primary ESCC tumors, the absence of immunoreactive CRABP1 was significantly associated with de-differentiation of cancer cells and with distant lymph-node metastases in the patients. These results indicate that CRABP1 appears to have a tumor-suppressor function in esophageal epithelium, and its epigenetic silencing may play a pivotal role during esophageal carcinogenesis. Its expression status in biopsies or resected tumors might serve as an index for identifying ESCC patients for whom combined therapeutic modalities would be recommended.