双氢青蒿素诱导胶质瘤细胞自噬作用的研究

目的 研究双氢青蒿素(DHA)抑制胶质瘤生长作用、机制及联合替莫唑胺(TMZ)的协同抗肿瘤作用.方法 选用胶质瘤细胞株10个,MTT法检测DHA持续作用72 h后细胞株半数抑制浓度(IC50);0.5 μg/ml浓度DHA联合梯度浓度TMZ作用于SKMG-4细胞株,MTT法检测IC50;MDC法荧光分析DHA作用后自噬泡形成;梯度浓度DHA作用SKMG-4,Western Blot法检测caspase-3、Beclin -1、LC3-B蛋白表达.结果 DHA抑制胶质瘤细胞生长IC50为(1.17±0.078)μg/ml-(23.568±0.796)μg/ml;在SKMG-4细胞株中,DHA实验组与空白对照相比,可见明显的自噬泡染色;Beclin-1及LC3-B表达随DHA浓度增加而增加,而cagpase-3表达无明显变化;DHA联合TMZ抑制SKMG-4生长,IC50值明显下降(P＜0.01).结论 DHA具有抗胶质瘤活性,诱导胶质瘤细胞自噬;DHA联合作用可提高TMZ的抗胶质瘤SKMG-4活性,机制可能为增强了TMZ自噬效能.

Abstract：

Objective To investigate the anti - glioma efficacy of dihydroartemisinin ( DHA) and combined with temozolomide (TMZ) on human glioma cell line in vitro. Methods The growth inhibition of DHA on 10 glioma cell lines induced by DHA treatment for 72 h was analyzed by MTT method. TMZ combined with 0. 5 μg/ml DHA, and the IC50 value was measured in SKMG - 4 cells. The autofluorescent drug monodansylcadaverine (MDC) was used to mark autophagicvacuoles. The autophagy related protein LC3 - B and Beclin - 1, and the apoptosis protein caspase - 3 were analyzed by western blot ( WB). Results The IC50 of DHA was different in ten glioma cell lines [from (1. 17 ±0. 078) μg/ml to (23. 568 ±0. 796) μg/ml]. In SKMG -4 cells, the autophagicvacuoles were detected in the DHA group, the IC50 of TMZ had significant difference with 0. 5 μg/ml DHA contrast to the control group ( P ＜ 0. 01), and the levels of LC3 - B and Beclin -1 protein were increased gradually with the increase of DHA concentration, and caspase - 3 protein has no difference. Conclusion DHA can inhibit proliferation of glioma cell lines and increase the efficacy of TMZ, and the autophagy may be the mechanism.     

丙戊酸诱导胶质瘤细胞自噬及其机制研究

目的对丙戊酸诱导胶质瘤细胞发生自噬性死亡的过程进行观察,并初步探讨其可能的机制。方法丙戊酸处理人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295,台盼蓝染色检测细胞活性并计算细胞存活率;流式细胞仪测定细胞周期,透射电子显微镜和荧光测定仪观察细胞超微结构及自噬水平,West-ern blotting检测经丙戊酸处理后细胞内LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt和p-p70S6K等蛋白质的表达水平。结果经不同浓度丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295细胞活性明显受到抑制,其胶质瘤细胞半数抑制浓度分别为(2.45±0.32)、(4.78±0.62)和(6.62±0.95)mmol/L,其中丙戊酸对人脑胶质瘤细胞系U87具有较明显的杀伤作用(P<0.05)。透射电子显微镜观察可见人脑胶质瘤细胞系U87细胞胞质内有大量自噬体和自噬溶酶体,其自噬水平随丙戊酸浓度的升高而逐渐增强。经丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平明显升高,而p-Akt和p-p70S6K表达水平明显降低。结论丙戊酸可诱导胶质瘤细胞发生自噬,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与阻断Akt信号转导通路有关。     

凝血酶导致的星形细胞死亡中自噬激活以及作用研究

目的探讨凝血酶导致的星形细胞死亡中是否存在细胞自噬,以及自噬在此过程中的作用。方法孕21 d SD大鼠原代培养星形细胞分为:生理盐水组,凝血酶组(凝血酶处理),自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(3-MA干预),凝血酶+3-MA组(凝血酶+3-MA共处理)。应用Western blot法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)转化,免疫组化学染色检测beclin 1表达水平,单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察细胞自噬空泡;乳酸脱氢酶(LDH)和活/死细胞计数评估细胞死亡。结果星形细胞经凝血酶处理24 h后,1LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化和beclin 1表达明显上升(P0.05)。2MDC染色示自噬空泡数显著增加;3-MA可降低LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化,下调beclin 1表达(P0.01)和减少MDC染色自噬空泡(P0.05)。3细胞死亡检测,星形细胞经凝血酶处理后LDH水平和活/死细胞计数与生理盐水组比较,死亡细胞比例上升(均P0.05);3-MA干预后,LDH水平和活/死细胞计数中的死亡细胞比例较凝血酶组进一步上升(均P0.05)。结论凝血酶导致的星形细胞死亡过程中存在细胞自噬,抑制细胞自噬加重细胞死亡。     

脑出血后凝血酶的神经毒性研究进展

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是神经科常见的急、危、重症之一,有较高的病死率和致残率。脑出血后除血肿扩大导致的机械性损伤外,还有脑水肿、细胞凋亡、炎症反应、脑血管痉挛等继发性损伤[1]。研究表明凝血酶是导致脑出血后继发性损伤的重要因素。本文就凝血酶及其神经毒性、抗凝治疗展望做一综述。     

凝血酶对脑出血后神经再生的影响

脑出血(Intra cerebralhemorr hage,ICH)是常见的脑血管疾病,其病死率及致残率均较高,严重威胁人类的健康和生命.脑出血的防治越来越受到临床医生的关注,但目前脑出血依然缺乏明显有效的治疗手段.     

氯喹通过抑制自噬促进TRAIL诱导的胶质瘤细胞凋亡

目的探讨氯喹对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的胶质瘤细胞凋亡的影响。方法体外培养人脑胶质瘤细胞U251和Hela细胞,分为对照组、氯喹组、重组人TRAIL蛋白(rhTRAIL)组和联用组(氯喹与rhTRAIL联合应用);MTT法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡,共聚焦显微镜检测GFP-LC3的分布判断细胞自噬水平,Western Blot检测cleaved caspase-8的表达水平。结果氯喹和rhTRAIL均显著增加U251细胞和Hela细胞自噬水平,而且联用较单独应用自噬水平更高,Hela细胞自噬水平明显高于U251细胞。U251细胞和Hela细胞增殖抑制率和细胞凋亡率:氯喹组与对照组均无统计学差异(P0.05),rhTRAIL和联用组均明显高于氯喹组(P0.05),联用组明显高于rhTRAIL组(P0.05)。氯喹组和对照组Cleaved caspases-8水平无统计学差异(P0.05),rhTRAIL和联用组均明显增高(P0.05),联用组明显高于rhTRAIL组(P0.05)。结论氯喹能通过抑制细胞自噬,增强TRAIL诱导的U251细胞凋亡。     

KU-55933抑制替莫唑胺诱导的U87胶质瘤细胞自噬

目的研究KU-55933对替莫唑胺(TMZ)诱导的U87细胞自噬及TMZ毒性的影响及机制。方法 U87细胞分别给予5、10、15、20μmol/L KU-55933作用72 h,或10μmol/L KU-55933作用24、48、72、96 h,MTT法检测细胞增殖。U87细胞分别给予DMSO、100μmol/L TMZ、10μmol/L KU-55933、100μmol/L TMZ+10μmol/L KU-55933作用72 h,流式细胞术检测自噬小体,Western blot检测相关蛋白的表达。结果 KU-55933抑制U87细胞的增殖,并呈剂量及时间依赖性;KU-55933抑制TMZ诱导的共济失调突变蛋白(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)、自噬激活激酶(unc-51 like autophagy activating kinase1,ULK1)、P53蛋白磷酸化,降低微管相关蛋白(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta,LC3B)裂解,减少自噬小体的生成,增加TMZ敏感细胞组蛋白亚型γH2AX的形成,但对细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1,Chk1)、细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2,Chk2)蛋白磷酸化无影响。结论 KU-55933可抑制TMZ诱导的胶质瘤细胞自噬,并且增强TMZ对敏感胶质瘤的细胞毒性。     

凝血酶体外诱导模拟脑室出血后大鼠蛛网膜细胞纤维化的实验研究

目的 观察凝血酶（thrombin）刺激体外培养大鼠蛛网膜细胞后纤维化程度的变化，探讨其与脑室出血（intraventricular hemorrhage，IVH）后大鼠慢性脑积水形成的关系。方法 采用SD大鼠蛛网膜细胞，经不同浓度凝血酶刺激，在体外模拟脑室出血（IVH）后慢性脑积水大鼠的蛛网膜细胞纤维化的病理生理过程。细胞免疫化学法（immunocytochemistry ，ICC）鉴定传代培养的SD大鼠蛛网膜细胞标志物细胞角蛋白（CK 8/18）和桥粒蛋白（Desmoplakin）的表达。qRT-PCR与Western Blot检测细胞纤维化因子（Col-I、Col-III、TGF-β1、α-SMA）的表达，观察其纤维化程度，同时检测比较各组细胞的表达差异。结果 （1）培养的蛛网膜细胞标志物Cytokeratin和Desmoplakin表达阳性。（2）凝血酶可诱导蛛网膜细胞纤维化，在50u/ml浓度下，蛛网膜细胞纤维化程度最明显。（3）实验组较对照组细胞纤维化程度明显。结论 体外可以稳定培养大鼠蛛网膜细胞。凝血酶诱导的蛛网膜细胞各种纤维化指标明显高于正常组，提示纤维化模型构建成功。构建成功的纤维化蛛网膜细胞有利于下一步深入研究脑室出血后慢性脑积水的机制。     

凝血酶体外诱导模拟脑室出血后大鼠蛛网膜细胞纤维化的实验研究

目的观察凝血酶(thrombin)刺激体外培养大鼠蛛网膜细胞后纤维化程度的变化,探讨其与脑室出血(intraventricular hemorrhage,IVH)后大鼠慢性脑积水形成的关系。方法采用SD大鼠蛛网膜细胞,经不同浓度凝血酶刺激,在体外模拟脑室出血(IVH)后慢性脑积水大鼠的蛛网膜细胞纤维化的病理生理过程。细胞免疫化学法(immunocytochemistry,ICC)鉴定传代培养的SD大鼠蛛网膜细胞标志物细胞角蛋白(CK 8/18)和桥粒蛋白(Desmoplakin)的表达。qRT-PCR与Western Blot检测细胞纤维化因子(Col-I、Col-III、TGF-β1、α-SMA)的表达,观察其纤维化程度,同时检测比较各组细胞的表达差异。结果 (1)培养的蛛网膜细胞标志物Cytokeratin和Desmoplakin表达阳性。(2)凝血酶可诱导蛛网膜细胞纤维化,在50u/ml浓度下,蛛网膜细胞纤维化程度最明显。(3)实验组较对照组细胞纤维化程度明显。结论体外可以稳定培养大鼠蛛网膜细胞。凝血酶诱导的蛛网膜细胞各种纤维化指标明显高于正常组,提示纤维化模型构建成功。构建成功的纤维化蛛网膜细胞有利于下一步深入研究脑室出血后慢性脑积水的机制。     

NMDA受体亚单位NR2A在凝血酶诱导的脑出血后脑损伤中的研究

目的 探讨NMDA受体亚单位NR2A在脑出血后脑损伤中的作用机制.方法 成年雄性SD大鼠随机分为生理盐水组,脑出血组,凝血酶组,凝血酶＋阿加曲班组.各组在手术后48 h采用不同方法观察其分布及动态变化规律.结果 NMDA受体亚单位NR2A在72h达高峰,阿加曲班可以减少其在72 h时的表达.阿加曲班可以改善血脑屏障的通透性、减轻脑水肿.结论 NMDA受体亚单位NR2A参与了脑出血后脑损伤的病理生理过程;阿加曲班通过抑制NMDA受体亚单位NR2A的激活而发挥神经保护作用.     

细胞自噬与缺血性脑血管病

细胞自噬是胞浆内长寿命蛋白质或过表达、功能失常的细胞器经自噬体被大量降解的生物学过程,是生物体内适应恶劣环境、维持内环境稳定的重要方式。目前的研究发现细胞自噬和缺血性脑血管病也存在着一定的关联,如果能够通过对细胞自噬分子机制的深入研究来寻找治疗缺血性脑血管病的相关方法,无疑能够拓展研究的面向。为了更好地将研究成果运用临床,本文对目前的研究相关的研究进行了总结,梳理研究成果,现将研究成果综述如下。     

凝血酶对脑出血后脑损伤的作用机制

凝血酶在对脑出血后脑组织的损伤中起着重要作用。本文通过介绍凝血酶的化学结构及其受体的分布，从脑水肿，炎症反应，脑缺血损伤，神经元损伤四个方面，对凝血酶在脑出血后脑损伤的作用机制进行综述。最后对小剂量凝血酶 预处理在脑组织中的保护作用进行了展望。     

凝血酶预处理对大鼠脑出血后SVZ细胞迁移和分化的影响

目的 探讨凝血酶预处理(thrombin preconditioning,TPC)对大鼠脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后侧脑室下带(subventricular zone,SVZ)细胞迁移和分化的影响。方法 将90只SD雄性大鼠随机分为3组:TPC组、ICH组、对照组。每组分为3、7、14、21、28 d亚组; 应用IV型胶原酶脑内立体定向注射制作脑出血模型,应用Brdu标记新生的SVZ细胞; 进行脑片培养,应用时间间隔显微系统动态观察Dil标记的SVZ细胞在活体脑片上的迁移; 为了评估迁移至损伤区的SVZ细胞是否具有与其他细胞形成突触的能力,进行Brdu和突触蛋白Ⅰ免疫组织化学双标染色。结果 在时间间隔显微系统下观察Dil标记的SVZ细胞向纹状体迁移,动态观察12 h,TPC组3 d SVZ细胞迁移的速度是(4.23±0.25)μm/h,7 d的速度是(6.53±0.37)μm/h,14 d的速度是(8.23±0.47)μm/h,21 d的速度是(7.05±0.31)μm/h,28 d的速度是(5.29±0.20)μm/h,在各个时间点TPC组的迁移速度明显快于脑出血组(P<0.01)。TPC组同侧纹状体Brdu和突触蛋白Ⅰ双标阳性细胞3 d明显增加,14 d达高峰,持续至21 d,然后逐渐减少。脑出血组3 d未见Brdu和突触蛋白Ⅰ双标阳性细胞,7 d可见少数阳性细胞,14 d达高峰,然后逐渐下降,在各个时间点双标阳性细胞与脑出血组比较均明显增加(P<0.01)。TPC使突触蛋白I的表达出现时间更早,持续时间更长。结论 TPC能够促进脑出血后SVZ细胞的迁移和分化。     

抑制自噬晚期阶段增强榭皮素诱导的胶质瘤细胞凋亡

目的研究抑制自噬不同阶段对榭皮素作用于胶质瘤细胞的影响,并对其机制进行初步探讨。方法通过3-甲基腺嘌呤(3-MA)及转染Beclin 1 shRNA质粒抑制自噬早期阶段,通过氯喹(CQ)抑制自噬晚期阶段。噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞活性。通过透射电镜及Western Blot检测自噬水平。通过流式细胞技术及Western Blot检测细胞凋亡。结果榭皮素可以诱导胶质瘤细胞凋亡及自噬的发生。抑制自噬的早期阶段会减弱榭皮素对胶质瘤细胞的毒性作用,抑制自噬的晚期阶段可以增强榭皮素诱导的胶质瘤细胞凋亡。结论氯喹与榭皮素联合用药具有协同作用,可能对胶质瘤的治疗提供新的思路。     

凝血酶和自发性脑出血研究新进展

自发性脑出血(ICH)是神经科常见的急症之一.最近的研究表明[1],脑血管疾病造成死亡中15%是由于自发性脑出血的缘故.自发性脑出血造成继发性神经损伤的主要原因有脑组织受损,脑水肿的形成等.目前,血肿周围的脑水肿可以加重脑出血后神经损伤的机制日益受到重视,而凝血酶(Thrombin)在其中起重要作用.     

脑出血与TLR4/NF-κB介导小胶质细胞自噬的相关性研究

目的 探讨TLR4介导小胶质细胞自噬在脑出血后炎症反应中的作用及机制。方法 A组(空白对照组):野生型C57BL/6小鼠; B组(自噬抑制剂对照组):野生型C57BL/6小鼠+自噬抑制剂(3-MA); C组(假手术组1):野生型C57BL/6小鼠+假手术+自噬抑制剂(3-MA); D组(造模组1):野生型C57BL/6小鼠+造模+自噬抑制剂(3-MA); E组(假手术组2):野生型C57BL/6小鼠+假手术+TLR4腺病毒抑制+自噬抑制剂(3-MA); F组(造模组2):野生型C57BL/6小鼠+造模+TLR4腺病毒抑制+自噬抑制剂(3-MA); 进行脑组织含水量(BWC)和神经功能障碍评分(NDS); Western Blot检测LC3-II/I比值,TLR4,MyD88和NF-κB蛋白表达水平; ELISA检测细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6水平。结果 与C组比较,E组BWC和NDS下降(P<0.05); 与D组比较,F组BWC和NDS下降(P<0.05); A,B,C和D组TLR4,MyD88和NF-κB p65蛋白水平无明显变化(P>0.05); 与C组比较,E组TLR4,MyD88,NF-κB p65水平,LC3-II/I比值下降(P<0.05); 与D组比较,F组TLR4,MyD88,NF-κB p65水平,LC3-II/I比值下降(P<0.05); 与A组比较,B,C和D组LC3-II/I比值下降(P<0.05); 与A组比较,B,C和D组TNF-α,IL-1β,IL-6水平下降(P<0.05); 与C组比较,E组TNF-α,IL-1β,IL-6水平下降(P<0.05); 与D组比较,F组TNF-α,IL-1β,IL-6水平下降(P<0.05)。结论 抑制C57BL/6小鼠的TLR4及自噬可减轻自噬引起的脑出血炎症损伤。     

ULK1小分子激活剂诱导细胞保护性自噬治疗帕金森病疗效观察

目的 探究ULK1小分子激活剂通过诱导细胞进行保护性自噬进程治疗帕金森病(PD)的疗效及其机制。方法 使用MPP⁺构建体外PD模型细胞;分别使用不同浓度的ULK1小分子激活剂BL918处理模型细胞,观察BL918对PD模型细胞生存率、凋亡情况影响;采用Western blotting检测BL918对PD细胞模型中自噬特异性蛋白P62及LC3 II表达影响;分析应用自噬抑制剂3MA对MPP⁺以及BL918诱导的自噬抑制程度。结果 随着MPP⁺浓度的升高,PD模型细胞活性呈现逐渐下降趋势;经BL918干预后细胞活性有所提高。随着BL918干预浓度的升高,PD模型细胞的活性有所升高,在0.5 mM浓度时PD细胞活性最大,明显高于其他浓度(P<0.05)。流式细胞术检测显示,BL918的干预可以有效降低PD模型细胞的凋亡,凋亡率明显低于PD模型组(P<0.05)。Western blotting检测显示BL918的应用可以升高P62蛋白以及LC3 II的表达(P<0.05)。经自噬抑制剂3MA干预后,BL918减轻PD模型细胞凋亡的趋势有所减弱。结论 ULK1的小分子激活剂对MPP⁺建立的PD模型细胞具有较好的保护作用,能够显著降低PD细胞凋亡,其原因可能与ULK1能够诱导细胞发生保护性自噬有关。     

组织蛋白酶D与自噬及脑出血的关系

组织蛋白酶D(Cathepsin D)是一种细胞溶酶体内的天冬氨酸蛋白酶,作用广泛,参与机体多种生理、病理过程.近年来研究发现,自噬参与了脑出血后的病理学过程,并且影响神经细胞的生存和死亡.Cathepsin D是介导自噬过程的重要蛋白,Cathepsin D可能在脑出血发病机制中起着重要作用.     

选择性自噬的研究

<正>自噬(autophagy)是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体降解途径。这个古老而保守的降解途径主要有三种形式:巨自噬(giant autophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperon-mediated autophagy,CMA)。自噬一直被认为是一个饥饿诱导的非选择性本体降解途径,通过细胞质成分的自我消化,细胞在有限的能源中回收所有的营养成分。泛素     

凝血酶在自发性脑出血后脑水肿形成中的作用

脑出血后脑水肿形成是导致继发性神经损害的一个重要因素。近年来,有关脑出血后脑水肿产生机制的研究表明,凝血时释放的凝血酶可能是引起脑出血后脑水肿的重要物质之一,凝血酶在脑出血后脑水肿形成、炎症反应等方面起着重要作用。本文对近年来凝血酶在自发性脑出血后脑水肿形成中的作用研究进展作一综述。