广佛手UDP-鼠李糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

目的对广佛手Citrus medica var.sarcodactylis中参与合成UDP-鼠李糖的UDP-鼠李糖合成酶(UDP-rhamnose synthase,RHM)基因进行全长cDNA克隆、功能鉴定及差异表达分析。方法基于广佛手转录组数据,筛选和克隆广佛手鼠李糖合成酶基因(CmRHM1)的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体,通过体外酶促反应鉴定CmRHMl的功能;利用实时荧光定量PCR分析广佛手不同器官中CmRHM1基因的表达特性。结果CmRHM1基因的开放阅读框(ORF)长度为2007 bp,编码668个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量为75 330、理论等电点是6.97,为亲水蛋白,无信号肽。多重序列比对显示CmRHMl在序列的N-端和C-端均含有高度保守的2个结构域(GxxGxxG/A和YxxxK)。体外酶促反应结果表明CmRHMl蛋白具有催化UDP-Glc合成UDP-Rha的功能。实时荧光定量结果显示该基因在广佛手的茎、叶和果实中的表达水平依次为叶果实茎。结论CmRHM1基因的功能鉴定为UDP-鼠李糖及鼠李糖糖苷的生物合成奠定了物质基础。     

茅苍术DXS基因的克隆与分析

目的:克隆茅苍术萜类化合物生物合成关键酶1-脱氧木糖-5-磷酸合酶(DXS)基因,并进行序列特征分析和组织特异性表达分析。方法:根据转录组测序所得的DXS基因片段,克隆出全长c DNA序列。运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),以tublin为内参基因,检测DXS基因在不同组织中的表达量。结果:克隆得到的DXS基因全长c DNA序列为2 151 bp,编码716个氨基酸,并在Gen Bank注册(登录号KY659208)。氨基酸序列系统发育分析表明,该序列与甜叶菊等菊科植物DXS基因有较高的同源性。Real-time PCR法检测发现茅苍术DXS在叶片中表达量最高,其次为花,而在根茎和根中表达很低。结论:获得了茅苍术DXS基因的全长c DNA序列,对其进行了初步生物信息学分析,揭示了其组织差异性表达特征,为进一步阐述该基因在茅苍术萜类成分生物合成途径中的功能奠定了基础。     

鹿血的PCR-RFLP鉴定研究

目的建立鹿血聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)种间及种内鉴定方法并确定检测限度。方法根据梅花鹿、马鹿、猪、牛、羊、鸭的细胞色素b(cytb)基因序列的差异,设计并选取DNA限制性内切酶Eco RV和Mse I分别作为区分鹿和非鹿,梅花鹿和马鹿的工具。采用试剂盒法提取样品基因组DNA,经PCR扩增cytb片段后,分别进行RFLP分析;在梅花鹿血基因组DNA中分别加入不同比例非鹿类动物血基因组DNA或马鹿血基因组DNA,PCR产物用限制性内切酶Eco RV和Mse I进行切割,确定检测限。结果经PCR-RFLP分析,Eco RV切割鹿和非鹿cytb片段,前者得到2个片段(287、185 bp),后者未被切割;Mse I切割梅花鹿与马鹿cytb片段,前者被切成2个片段(281、191 bp),后者被切成3个片段(281、126、65 bp),191 bp的片段作为梅花鹿血的特征片段,126 bp的片段作为马鹿血的特征片段。梅花鹿血中加入非鹿类动物血基因组DNA的检测限为3%,加入马鹿血基因组DNA的检测限为6%。结论建立的PCR-RFLP方法可以快速鉴定鹿血及相关伪品或掺伪品,也可区分鉴定梅花鹿源的鹿血或马鹿源的鹿血,为鹿血相关产品的质量控制提供了新的技术手段。     

342bp人骨形态发生蛋白2成熟肽基因的克隆表达

目的探讨克隆人骨形态发生蛋白2(hBMP2)成熟肽的最精简的基因序列并原核表达方法。方法剔除所有信号肽和中间前肽的非必需基因序列,以RT-PCR方法克隆扩增出hBMP2的342 bp的成熟肽基因片段,将其与原核表达载体PBV220酶切后相连接并测序,构建PBV220-hBMP2的真核基因原核表达系统,在DH5α大肠杆菌下扩增并温度诱导表达hBMP2蛋白质,SDS-PAGE检测表达蛋白。结果RT-PCR扩增出hBMP2的成熟肽基因342 bp片段与Genbank公布的序列完全一致,且经DNA电泳和蛋白电泳鉴定,构建PBV220-hBMP2原核表达系统可导入DH5α大肠杆菌,并在温度诱导下表达出约16 kD的蛋白条带,诱导培养4 h后的蛋白表达量达到最高峰。结论成功扩增342 bp的成熟肽hBMP2基因片段能在原核大肠杆菌上有效表达生产hBMP2蛋白质。     

佛手茎尖玻璃化超低温保存和植株再生

目的 为佛手种质资源的保存提供一条新途径.方法 对佛手茎尖进行了玻璃化超低温保存,并对保存后的茎尖进行微嫁接试验,获得再生植株.结果 佛手茎尖在含5%DMSO和5%蔗糖的MS培养基上预培养48h后,切取3～4 mm的茎尖,室温(25℃)下装载液(60%PVS_2)预处理30 min,0℃下玻璃化液PVS_2处理80 min,投入液氮保存24 h后取出,在40℃水浴快速化冻,室温下分别用1.2 mol/L蔗糖和MT基本培养基洗涤2次,每次10 min.保存后的茎尖经TTC法检测,成活率达81.25%;将茎尖嫁接到黑暗培养基的砧木上,再生率可达52.94%,且再生植株生长和分化正常,经PCR检测不含黄龙病病原.结论 玻璃化超低温保存方法可用于佛手种质资源保存.     

红花天冬氨酸激酶基因片段的分离及表达分析

目的克隆红花种子中的天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)基因并研究其在种子不同发育时期的表达量。方法根据红花转录组文库注释信息筛选与红花天冬氨酸激酶(Ct AK)基因相关的Unigenes,设计引物,以红花种子总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Ct AK基因片段并连接到克隆载体上,经PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆进行测序。同时利用荧光定量PCR技术对其进行基因表达量的分析。结果克隆了红花Ct AK基因的核心片段,分离到486 bp的基因序列。根据Ct AK基因片段设计引物,对不同品种不同发育时期红花种子进行荧光定量PCR分析,Ct AK基因在红花品种川红1号初花后13 d表达量最高。结论系统发育树分析表明,该基因与其他物种的AK基因具有较高的同源性。     

丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的克隆与分析

目的:获得丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因(GGPS),并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究.方法:根据GGPS蛋白序列保守区域设计简并引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从丹参根中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Prosite分析蛋白质的基本结构域,Target P 1.1分析信号肽序列,MEGA4.0比对已有GGPS蛋白序列,并构建进化树;用半定量RT-PCR检测其在丹参子叶期根、叶和花期根、茎、叶、花蕾、花中的表达情况;设计特异引物,从丹参基因组DNA中扩增,获得编码完整的GGPS基因,初步分析该基因结构.结果:得到1条长1298 bp的GGPS cDNA序列,其ORF框长1 095 bp,编码1段含有52个氨基酸质体定位信号肽的364个氨基酸序列,具有多聚异戊二烯基合成酶的特异序列,与已报道的GGPS基因有60%以上的同源性;RT-PCR半定量分析表明该基因在所分析的各组织中均有表达,尤以花期叶片中的表达最强;基因结构分析表明该基因有1个397 bp的内含子.结论:首次得到丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因,为其功能研究提供了基础.     

太子参3个肌动蛋白基因片段的克隆与序列分析

目的克隆太子参肌动蛋白(Actin)基因片段并进行序列分析。方法利用植物Actin基因的保守序列设计简并引物,通过RT-PCR和抑制PCR扩增太子参Actin基因核心片段。利用半定量RT-PCR分析太子参Actin基因在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达情况。结果通过RT-PCR获得3条太子参Actin基因的核心片段,长度均为760 bp,依次命名为PhACT1、PhACT2、PhACT3。通过抑制PCR及序列拼接后3条核心片段依次延长至1 008、1 008、975 bp,分别编码336、336、325个氨基酸残基。半定量RT-PCR分析表明PhACT2和PhACT3基因在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达量基本恒定,PhACT1基因存在一定的差异。结论首次从太子参中克隆得到3条太子参Actin基因序列,并确定PhACT2基因适合作为太子参功能基因表达分析的内参基因。     

滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。     

农杆菌介导几丁质酶及β-1，3-葡聚糖酶基因转化半夏的研究

目的:将木霉来源的内切几丁质酶以及β-1,3-葡聚糖酶基因片段转入半夏,使其获得抗真菌感染的特性.方法:以半夏外植体为受体,潮霉素磷酸转移酶Hpt为筛选标记,采用农杆菌介导法将内切几丁质酶基因ech42、葡聚糖酶基因gluc78以及2种基因的组合pcAMBIA(ech42+gluc78)进行遗传转化获得转化再生植株,通过PCR,RT-PCR检测转化结果.结果:经PCR,RT-PCR检测,表明3种外源基因已成功转化半夏,并在转录水平得到表达.连续多代的PCR追踪检测证实外源基因已遗传至T5代.结论:带有ech42,gluc78,pCAMBIA(ech42+gluc78)表达载体的根癌农杆菌可以分别转化半夏,并表达出相应的RNA,进行稳定遗传.     

椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达

目的克隆中药橘核主要来源品种椪柑Citrus reticulata的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶(limonoid-UDP-glucosyl transferase gene,LGT)基因,并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法克隆获得LGT序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LGT与相关物种LGT的系统进化树,利用RT-PCR分析橘皮、橘肉以及橘核中LGT基因表达量,并进行分析和比较。结果测序所得椪柑LGT序列全长为1 530 bp,具有1 509 bp的完整开放阅读框,编码502个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。基因表达分析结果发现椪柑LGT基因在橘核中表达量最低,其次为橘皮,表达量最高为橘肉。结论成功克隆、分析并表达了椪柑LGT基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。     

不同比例甘草配伍祖师麻抗大鼠佐剂性关节炎的实验研究

目的 观察不同比例甘草配伍祖师麻对大鼠佐剂性关节炎（AA）模型的治疗作用,筛选两者配伍比例,探讨其配伍意义。方法 采用足跖皮内注射弗氏完全佐剂制备AA模型,将140只模型大鼠随机分成14组：模型组,雷公藤多苷片组,祖师麻低、中、高剂量组,甘草低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：1）低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：2）低、中、高剂量组,另取10只正常大鼠为对照组,给药组大鼠造模前2 d开始ig给药,连续给药31 d,观察各组大鼠体质量变化,计算足肿胀度、关节炎指数（AI）,采用ELISA法检测大鼠血清炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平,观察大鼠膝关节组织病理变化,通过免疫组化法测定大鼠膝关节滑膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）、巨噬细胞游走抑制因子（MIF）的表达。结果 与模型组比较,祖师麻组、祖师麻甘草配伍组能够明显抑制AA大鼠体质量减轻的趋势,对抗AA大鼠足肿胀度及AI的增加,降低异常升高的血清TNF-α、IL-1β水平,改善关节病理组织变化,减少滑膜组织VEGF、MIF的表达,其中以祖师麻-甘草（3：2）配伍组效果最优。结论 祖师麻甘草配伍后,对AA大鼠各项指标改善作用显著,作用优于单用祖师麻,其最佳配伍比例为祖师麻-甘草（3：2）。调节血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β及滑膜组织VEGF、MIF的表达,可能是祖师麻甘草配伍治疗类风湿性关节炎机制之一。     

夏天无HPLC指纹图谱及多指标含量测定研究

目的建立夏天无HPLC指纹图谱及多指标成分测定方法,为夏天无药材质量标准提升提供科学依据。方法采用HPLC法,Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;以乙腈-0.2%冰醋酸溶液(三乙胺调pH 6.0)为流动相,梯度洗脱;体积流量1.0 mL/min;柱温35℃;进样量10μL;检测波长280 nm;建立15批夏天无药材的指纹图谱,用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012A版)进行评价,聚类分析和主成分分析将15批药材分为2类,同时测定原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素4种成分的含量。结果建立了夏天无药材的HPLC指纹图谱,共标定了10个共有峰;原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素线性关系良好,r均大于0.999 9,平均回收率分别为97.12%、100.09%、98.53%、99.71%。结论 HPLC指纹图谱结合多指标成分测定可为夏天无药材质量评价提供参考。     

内生真菌链格孢菌醋酸乙酯提取物对大肠杆菌抑菌机制的研究

目的研究分离自药用植物白毛蛇Humata tyermanni的内生真菌链格孢菌发酵产物醋酸乙酯提取物(B06e)对大肠杆菌的抑菌机制。方法采用倍比稀释法测定了B06e对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC);测定了B06e作用前后大肠杆菌培养液电导率、核酸和蛋白质的变化;结合流式细胞仪、扫描电子显微镜、凝胶阻滞实验、圆二色谱和荧光实时定量PCR的分析方法研究了B06e对大肠杆菌细胞膜结构、形态、DNA的影响。结果 B06e对大肠杆菌的MIC为25μg/m L,3×MIC处理组的电导率是对照组的1.01倍;3×MIC处理组的β-半乳糖苷酶活性是对照组的11.6倍;流式细胞仪分析表明3×MIC处理组被碘化丙啶(PI)染色的阳性细胞比是对照组的286.5倍;扫描电子显微镜结果显示,B06e处理后菌体表面变得粗糙,细胞膜大量塌陷;以上结果说明B06e能增大细胞膜的通透性,破坏细胞膜的完整性。凝胶阻滞、圆二色谱的结果表明,B06e能够以嵌插的方式与DNA结合,但不能降解DNA;实时定量PCR结果表明,经B06e处理后rec A和rec N基因的表达量分别是对照组的2.9和3.7倍,说明B06e能破坏DNA的结构,迫使大肠杆菌启动了SOS修复。结论 B06e通过破坏大肠杆菌细胞膜完整性和DNA的结构,使得细菌代谢紊乱,最终导致细菌丧失了生长繁殖的能力。     

瓜蒌皮药材的HPLC指纹图谱

目的：建立瓜蒌皮药材的 HPLC 指纹图谱。方法：采用 Agilent TC-C₁₈（4.6 mm×250 mm,5 μm）色谱柱,以乙腈-0.2%冰乙酸为流动相进行梯度洗脱,检测波长 260 nm,流速 0.8 mL·min^-1,柱温 25℃,进样20 μL。结果：建立了瓜蒌皮药材的HPLC指纹图谱,方法学考察结果良好,确立了13个共有峰,其中5个共有峰得到确认,10批瓜蒌皮样品指纹图谱的相似度均>0.9。结论：该方法稳定性、重复性好,建立的指纹图谱可为瓜蒌皮的质量评价提供依据。     

肉豆蔻、麸煨肉豆蔻中总木脂素的含量测定

目的:建立肉豆蔻、麸煨肉豆蔻中总木脂素的含量方法.方法:采用紫外分光光度法,以去氢二异丁香酚为对照品,测定波长275 nm.结果:去氢二异丁香酚质量浓度在1.5～9.0 mg·L-1与吸光度呈良好线性关系,r=0.999 8,平均回收率97.6％(n=6),RSD 1.2％.结论:建立的方法简便、快速、重复性好.     

苗药血人参提取物水凝胶的制备及促创面愈合体内外研究

目的 制备一种载苗药血人参Indigofera stachyodes提取物的聚乙烯醇（PVA）/木质素（Lig）/壳聚糖（CS）水凝胶并探究其促创面愈合机制。方法 在单因素考察的基础上,正交试验优选处方工艺并对其进行质量评价和体外生物评价,通过建立大鼠全层皮肤损伤模型,评价其促创愈合效果。结果 携载提取物的PVA/Lig/CS水凝胶的最优处方和制备工艺为PVA用量7.0 g、CS用量4.0 g、Lig用量0.5 g、冻融循环次数4次,每次冻结6 h。该凝胶具有多孔网状结构、良好的溶胀性、保湿性及一定的机械强度,同时具有良好的生物相容性、抑菌性以及有效抑制巨噬细胞细胞迁移,且抑制作用可能与时间呈正比。该水凝胶的体内药效学研究显示,其促创面愈合作用可能与减少创面组织炎性细胞浸润,促进巨噬细胞向M2型极化、增加毛血细管生成和纤维组织形成有关。结论 制备的载血人参提取物的PVA/Lig/CS水凝胶剂制备工艺简单、稳定可行、具有良好的缓释性能,且对全层皮肤损伤具较好的治疗效果。     

赶黄草的转录组测序及分析

目的获得赶黄草Penthorum chinense转录基因参考序列和表达量信息,探索赶黄草药用活性成分生物合成的遗传基础,为赶黄草的重要功能基因研究提供参考。方法采用Illumina Hi Seq 2000高通量测序技术,对赶黄草进行转录组测序,对获得的数据进行过滤组装,对得到的unigene进行比对注释,同时对本研究获得赶黄草活性成分合成相关代谢通路基因进行分析。结果共获得了40 005 442条有效的短读序,通过de novo拼接得到42 306个unigene,开放阅读框(ORF)分析共计得到518个ORF,其中75个ORF具有转录因子结构域。通过KEGG分析,检测到33、32、59、68个unigene分别参与黄酮类生物合成、固醇类生物合成、萜类骨架生物合成和羧酸代谢。结论本研究发现的这些基因对赶黄草遗传改良和药用活性物质的生物合成路径相关基因研究有着重要意义。     

基于NMR代谢组学技术的白芍与赤芍化学成分比较研究

目的比较白芍与赤芍的化学组成差异,为其质量控制提供研究依据。方法采用1H-NMR代谢组学技术对白芍与赤芍进行分析,通过多元统计方法找出其化学差异成分,并分析差异成分之间的相关性。结果白芍与赤芍核磁共振指纹图谱中共指认出了代谢物32种,多元统计分析显示白芍与赤芍可明显区分,白芍中精氨酸、苏氨酸、乙酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、柠檬酸、丁二酸、乳酸、芍药内酯苷、6-O-没食子酰白芍苷、1,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖以及没食子酸的量较高,而赤芍中丙氨酸、α-葡萄糖、蔗糖、芍药苷、儿茶素、β-谷甾醇、脂肪酸以及丹皮酚的量较高。此外,二者差异成分之间的相关系数也存在较大差异。结论本研究从整体化学组成上比较了白芍与赤芍的差异,不仅为白芍、赤芍质量标准研究提供了一种新思路,而且为其功效与化学成分的相关性研究提供依据。     

洋金花与木本曼陀罗叶绿体基因组特征与系统进化分析

目的 以洋金花Datura metel和木本曼陀罗Brugmansia arborea为材料,分析其叶绿体基因组结构和特征,基于叶绿体组数据探讨洋金花和木本曼陀罗及茄科其他物种的系统发育关系。方法 利用华大MGISEQ-2000PE150测序平台,双末端测序策略对基因组DNA建库测序,用NOVOPlasty组装叶绿体基因组,采用最大似然法(maximum likelihood,ML)构建系统进化树。结果 洋金花和木本曼陀罗的叶绿体基因组全长为155934bp和155939bp,分别包含131和130个基因,GC值32.3%,具有典型的四分区域结构,包括1个大单拷贝区(large single copy,LSC)、1对反向重复区(inverted repeats,IR)和1个小单拷贝区(small single copy,SSC),各区域序列长度分别为86354、86278、25609、25720、18362、18221bp。系统发育分析表明,洋金花与曼陀罗属的曼陀罗构成1单系分支,具有100%支持率,而木本曼陀罗属与曼陀罗属构成单系分支,具有100%支持率。结论 结果支持洋金花隶属于曼陀罗属,与曼陀罗亲缘关系较近,木本的木曼陀罗属从曼陀罗属分出,独立为一个属。洋金花和木本曼陀罗叶绿体基因组信息为后期分子鉴定和群体遗传研究奠定基础。