重组人血红蛋白δ链的制备与鉴定

目的克隆人血红蛋白δ(delta)链蛋白基因,并在大肠杆菌中进行表达,经纯化与鉴定,获得δ链蛋白,为建立β-地中海贫血的免疫学筛查方法提供特异性抗原。方法从K562细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术获得目的片段并将其克隆到pET-32a及pET43.1a载体中,经PCR、酶切及测序验证,以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。包涵体经变性、复性后以Ni2+亲和层析柱纯化,可溶性蛋白直接以Ni2+亲和层析柱纯化。采用Western Blot和ELISA分析鉴定表达产物。结果成功构建两种融合表达载体pET32-Hbδ及pET43.1-Hbδ,分别为包涵体表达和可溶性表达,纯化产物经Western blotting和ELISA鉴定均为δ链蛋白。结论克隆表达并获得了纯化的人血红蛋白δ链,为后续的抗体制备及地中海贫血的免疫筛选方法的建立提供了抗原。     

粉尘螨第五组主要变应原(Der f5)的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的 克隆表达粉尘螨第五组变应原(Dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性.方法 提取活粉尘螨总RNA,扩增Der f5片段.PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化入大肠埃希菌JM109,经酶切及测序鉴定获得pMD18-Der f5阳性菌株,再提取质粒进行双酶切,与表达载体pET-30a(+)连接,转化人大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果.Ni-IDA亲和层析柱纯化蛋白,利用尘螨病人血清鉴定其免疫原性.结果 构建了重组质粒pMD18-Der f5和pET30a-Der f5,SDS-PAGE结果表明Der f5基因在BL21中获得良好的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符.纯化的蛋白与病人血清有良好的IgE结合活性.结论 获得广州地区Der f5的原核表达载体,高效表达纯化重组蛋白.初步鉴定了该蛋白的免疫原性.     

人细小病毒B19 XA株VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的:通过DNA 重组技术,构建B19 病毒XA株VP1全长基因表达载体, 诱导重组VP1融合蛋白表达. 方法:自B19病毒感染患者血清中提取病毒DNA为模板,用PCR法扩增编码VP1蛋白的全长基因片段,以pET28(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET28(a)-VP1,转化E. coli. BL21(DE3),获得重组工程菌株.经IPTG诱导培养获得高效表达的VP1融合蛋白,SDS-PAGE、免疫印迹鉴定表达产物;并以该重组融合蛋白为抗原,免疫家兔,ELISA法检测所获抗体效价. 结果:①获得了含重组表达质粒pET28(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白.②经ELISA法检测抗VP1多克隆抗体效价为1: 12 800. 结论:重组工程菌可表达VP1融合蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性,对诊断试剂制备及疫苗研制具有重要意义.     

人锌转运体8强免疫原性片段的预测及原核表达鉴定

目的 筛选人锌转运体8(Zinc transporter 8,ZnT8)中强免疫原性片段,并对其进行克隆表达及鉴定.方法 采用生物信息学软件预测ZnT8结构特征,筛选出具有强免疫原性的N末端片段ZnT8(N),经PCR(Polymerase Chain Reaction)技术扩增,构建表达质粒pET32a-ZnT8(N),转化入E.coli BL21(DE3)中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白的表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析及Western blot鉴定.结果 从ZnT8分子中筛选出具有140个氨基酸的肽段ZnT8(N),重组质粒pET32a-ZnT8(N)经酶切和测序鉴定证实构建成功.转入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子质量(Mr)约32 000,与预期值相符,并经免疫印迹检测鉴定为阳性,融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量45%.结论 筛选获得了人胰岛细胞来源的ZnT8强免疫原性片段,并在原核系统中成功表达.     

新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备

目的:PCR扩增得到新基因ZNFD(Znf domain containing protein),构建pET32a-ZNFD原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:通过PCR的方法克隆新基因ZNFD,选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列,克隆到原核表达载体pET32a上,利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论:得到纯化的ZNFD蛋白,制备的多克隆抗体达到了一定的效价,且具有高特异性,为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

沙眼衣原体质粒蛋白pORF5原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建沙眼衣原体(CT)pORF5蛋白基因重组质粒pGEX-6p/pORF5,表达并纯化质粒蛋白pORF5,并鉴定其免疫原性.方法 用PCR法扩增pORF5基因,定向插入pGEX-6p原核表达载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达pORF5融合蛋白.融合蛋白纯化后免疫BALB/c鼠,ELISA及Western-blot分析pORF5质粒蛋白免疫原性及免疫反应性.结果 PCR扩增出795 bp基因片段,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的D型Ct一致;pORF5融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1:25 600.结论 pORF5蛋白在原核细胞中可有效表达并具有较好的免疫原性,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件.     

人HT036蛋白的原核表达及鉴定

目的 原核表达人HT036蛋白并鉴定其正确性.方法 采用PCR技术,扩增人HT036蛋白编码序列,克隆至原核表达载体pET30a( )中,用IPTG诱导表达,免疫印迹鉴定.结果 PCR扩增得到了目的DNA片段,克隆至原核表达载体后经酶切与测序鉴定正确,并在大肠杆菌中获得高效表达,用抗His抗体鉴定融合蛋白表达正确.结论 成功构建了重组原核表达载体并正确表达了HT036蛋白.     

产气荚膜梭菌α毒素亚单位基因的表达及表达产物活性分析

含有产气荚膜梭菌α毒素基因序列的克隆载体pMD18TCα ,经BamHⅠ和HindⅢ内切酶双酶切后 ,将α毒素亚单位基因亚克隆到原核表达载体pET30b中 ,构建表达载体pET30bPα。经酶切和测序鉴定 ,α毒素基因中的90 0bp的片段正确插入到表达载体中。重组菌株BL2 1(DE3)pET30bPα经IPTG诱导的表达产物经SDS PAGE和Western_blot分析 ,表达出大小为 38× 10 3的重组蛋白具有和α毒素阳性血清发生特异性的免疫反应。     

肠出血性大肠杆菌O157P:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究

目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( ) 中,构建重组表达质粒pET28a( )-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a( )中,构建了表达质粒pET28a( )-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.     

重组截短型人角质细胞生长因子-1的表达及纯化

目的：构建高效表达N端缺失的23个氨基酸重组人角质细胞生长因子1( rhKGF1_dest23)的基因工程菌,为治疗放化疗后口腔黏膜炎的新药开发提供实验数据。方法：利用PCR方法分别以pET3c-hKGF1及sumo-EGF为模板合成N端缺失的23个氨基酸rhKGF1_dest23及sumo基因片段,构建4种原核表达载体pET22b-rhKGF1_dest23﹑pET22b-sumo-rhKGF1_dest23﹑pET3c-rhKGF1_dest23和pET3c-sumo-rhKGF1_dest23,分别转化原核表达宿主菌Rosetta(DE3) plysS、BL21(DE3) 、BL21(DE3)Star plysS、origima(DE3) 和BL21AI,筛选rhKGF1_dest23蛋白表达的最佳质粒与宿主菌组合。CM离子交换和肝素亲和层析法纯化rhKGF1_dest23蛋白,Western blotting法鉴定rhKGF1_dest23蛋白。结果： pET22b-rhKGF1_dest23质粒与BL21AI 宿主菌为最佳组合表达,经IPTG与阿拉伯糖诱导, SDS-PAGE电泳后表明目的蛋白大部分以可溶性形式存在,约占菌体总蛋白的10％,经CM和肝素两步纯化后rhKGF1_dest23蛋白纯度为95%以上,Western blotting法鉴定为rhKGF1_dest23蛋白。结论：成功构建表达人KGF1_dest23重组蛋白的基因工程菌,经IPTG与阿拉伯糖诱导,CM弱阳离子与肝素亲合层析后,得到了纯化的rhKGF1_dest23蛋白。     

HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的 :HIV- 1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法 :1PCR法扩增的 HIV-1p17基因片段克隆至 p ET2 8c质粒 ;2重组质粒分别在大肠杆菌 BL 2 1、BL 2 1(DE3)、BL 2 1(DE3) plys S及 HMS174 (DE3)中表达 ;3用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白 ;4用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果 :重组质粒在 BL (DE3)中表达量最高 ,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32 % ,纯化后其纯度达 95% ,纯化蛋白可与 p17Mc Ab和 HIV- 1阳性血清发生特异反应。结论 :带有HIV- 1p17片段的重组质粒 p ET2 8c在大肠杆菌 BL2 1(DE3)中获得高效表达 ,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究 ;用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化蛋白 ,方法简便 ,蛋白丢失少 ,纯度高 ;纯化的重组蛋白 HIV- 1p17可用来临床早期诊断 HIV- 1感染者 ,同时可预测患者的临床进程。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

成纤维细胞生长因子-21[Arg59]突变体基因的克隆及融合蛋白的表达与纯化

目的：对野生型成纤维细胞生长因子-21（FGF21）进行突变改造及表达与纯化,为后续蛋白质体外偶联(Pull-down)实验及建立人源肝癌裸鼠模型奠定基础。方法：采用PCR定点突变方法,将FGF21 cDNA第59位赖氨酸密码子突变为精氨酸密码子,所得的突变体片段与SUMO分子伴侣相连后插入表达载体pET20b,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导表达。对表达产物进行Ni-NTA柱亲和层析、酶切和除盐等纯化分析。结果：PCR扩增出约546 bp的特异性片段,测序分析表明已成功引入突变;所构建的pET20b-SUMO-FGF21［Arg59］ 重组阳性克隆经PCR与双酶切鉴定及测序分析,与预期结果一致;SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约31 500,且为可溶性;Western blotting分析证实：纯化后产物是成熟的FGF21［Arg59］ 突变体蛋白。结论：成功构建FGF21［Arg59］ 突变体基因,并经表达纯化得到成熟的FGF21［Arg59］ 突变体蛋白。     

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的：构建热休克蛋白65（HSP65）与沙眼衣原体（C.trachomatis,Ct）主要外膜蛋白（MOMP）T细胞表位（简称ctm1）融合蛋白（简称H-ctm1）的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法：用PCR技术获得HSP65基因和ctm1基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctm1基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctm1的基因重组。用IPTG诱导转化H-ctm1表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果：构建了HSP65与ctm1的表达载体pET28a-H-ctm1,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98%的融合蛋白质。结论：用分子克隆技术正确构建HSP65与Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。     

细粒棘球蚴重组延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的对构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)延伸因子-1(Elongation factor1,EF-1)基因的重组质粒,并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法从重组质粒EF-1/pGEM-T中酶切出EF-1目的片段,亚克隆入表达载体pET28a,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达,经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化,SDS-PAGE和Westernblot方法鉴定表达产物。结果成功构建Eg.EF-1/pET28a/E.coliBL21基因工程菌株,诱导表达重组蛋白和纯化分离得到31KDaEg.EF-1均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。     

肿瘤转移抑制基因Nm23-H1融合蛋白的表达纯化及其功能的初步研究

目的 利用人Nm23-H1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,并对蛋白其活性进行初步分析.方法 将重组质粒pET28a-Nm23-H1转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到Nm23-H1融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot鉴定纯化蛋白,并用RP-HPLC法、电泳迁移率变动分析实验检测Nm23-H1融合蛋白的核苷二磷酸激酶(NDPK)活性及核酸内切酶(AP)修复活性.结果 转化溶原菌后能够表达目的 蛋白,蛋白表达量高,为可溶性蛋白.Ni2+柱纯化后得到Nm23-H1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.RP-HPLC法就及电泳迁移率变动分析实验证明所纯化的Nm23-H1融合蛋白具有NDPK活性,不具有AP修复活性,但可以增加APE1蛋白的AP修复活性.结论 利用原核表达载体pET28a-Nm23-H1在E.coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到具有NDPK活性,但无AP修复活性的Nm23-H1融合蛋白,此蛋白可以增强APE1蛋白的AP修复活性,共同参与细胞的DNA损伤修复.     

TAT／LMP-3融合蛋白的制备及其诱导成骨活性的初步研究

目的：表达并纯化具有入胞转导能力并保持骨诱导活性的重组融合蛋白TAT／LMP-3,观察融合蛋白TAT／LMP-3对人骨髓间充质干细胞的入胞转导活性和诱导其成骨分化的效能．方法：采用基因工程技术构建原核表达载体pET43．1a—TAT／LMP-3和pET43．1a—LMP-3并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni—NTA树脂亲和层析柱纯化后进行初步鉴定,同时制备重组蛋白LMP-3的多克隆抗体．将融合蛋白与人骨髓间充质干细胞共孵育,Western Blot技术分析融合蛋白的入胞效应,检测成骨细胞标志性基因表达以分析重组蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响．结果：成功地构建了pET43．1a—TAT—LMP-3融合基因原核表达载体,获得了TAT／LMP-3的可溶性表达,纯化后融合蛋白TAT／LMP-3纯度大于90％．成功制备了TAT／LMP-3的兔源性多克隆抗体．Western Blot分析证实TAT—LMP-3融合蛋白能以浓度和时间依赖性的方式转导进入人骨髓间充质干细胞,同时,TAT／LMP-3能成功诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化．结论：成功进行了TAT／LMP-3融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定,构建的TAT／LMP-3融合蛋白具有入胞转导能力同时保持了骨诱导活性,为其在脊柱融合的进一步应用奠定了实验基础．