超多人份混合血浆分馏AHF制备FⅧ∶C标准品的可行性研究

目的　用超多人份混合血浆分馏抗血友病球蛋白 (AH F)制备稳定的用于测定凝血因子 促凝活性 (F ∶C)的标准品。　方法　以 WH O第六代 F ∶ C标准品 (WH O-6)和美国国家 F ∶ C标准品 (MEGA-1)为基准 ,用一期法测定两个批号工作标准品样品的凝血因子 促凝活性 ,并标定其活性值。　结果　用 WH O-6标定时两批样品的 F ∶ C(IU/ml)分别为 19.14± 2 .73和 11.75± 2 .0 9,用 MEGA-1标定时两批样品的 F ∶ C(IU/ml)分别为 18.94± 3 .0 0和11.63± 1.2 9。同批样品分别用 WH O-6和 MEGA-1标定时 ,其促凝活性值的差异无显著性 (P>0 .0 5 )。将样品置于 -3 0℃条件下保存 6个月 ,用 MEGA-1为基准测定 ,效价未见明显改变。　结论　以已知的国际公认 F ∶ C质控标准品为基准 ,用本文所推荐的方法可从超多人份混合血浆分馏的 AH F中制备数据可靠、性能稳定的 F ∶ C检测质控和工作标准品 ,方法具有一定的可行性和实用性     

应用半自动血凝仪检测冷沉淀中FⅧ∶C含量

随着成分输血的逐步推广,冷沉淀的应用逐渐被临床医生接受.冷沉淀在临床上的止血效果,除与输注的冷沉淀中纤维蛋白原的含量有关外,还与输注的冷沉淀中凝血因子(如:凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ异常引起的血友病)的含量有关.因此,如何准确地检测冷沉淀中凝血因子Ⅷ促凝活性(简称FⅧ∶C),已成为血液成分质量控制工作中的重点质控项目之一.笔者就半自动血凝仪检测冷沉淀中FⅧ∶C含量的应用及其与手工法的比较,介绍如下.     

凝血因子Ⅷ复合物的纯化

本文介绍一种制备高纯度凝血因子Ⅷ(FⅧ)复合物的方法。用新鲜冰冻血浆作为原始材料,收集冷沉淀,溶解后经氢氧化铝[Al(OH)_3]凝胶吸附、甘氨酸沉淀和氯化钠沉淀,得高纯 FⅧ。然后经 Sephacryl S-1000柱层析,收集富含 FⅧ促凝活性(FⅧ∶C)及 von Willebrand 因子(vWF)组分,得到进一步纯化的产品。层析后产品总蛋白含量为0.188mg/ml,FⅧ∶C 为15.43IU/ml,FⅧ相关抗原(FⅧR∶Ag)为9.85U/ml,vWF 的 Ristocetin 辅因子活性(FⅧR∶RCof)为24.2U/ml。火箭电泳测定未显示含有纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)、纤维结合蛋白(Fibronectin,Fn)和IgG 等杂蛋白。     

应用半自动血凝仪检测冷沉淀中FⅦ：C含量

随着成分输血的逐步推广 ,冷沉淀的应用逐渐被临床医生接受。冷沉淀在临床上的止血效果 ,除与输注的冷沉淀中纤维蛋白原的含量有关外 ,还与输注的冷沉淀中凝血因子(如 :凝血因子 、凝血因子 异常引起的血友病 )的含量有关。因此 ,如何准确地检测冷沉淀中凝血因子 促凝活性 (简称 F ∶ C) ,已成为血液成分质量控制工作中的重点质控项目之一。笔者就半自动血凝仪检测冷沉淀中 F ∶ C含量的应用及其与手工法的比较 ,介绍如下。材料与方法1　仪器　 Start4半自动血凝仪。2　试剂　凝血因子 促凝活性检测试剂盒 ,批号 0 110 0 1;正常参比血…     

人凝血因子Ⅷ抗原含量ELISA检测方法的建立、验证及应用

目的双抗体夹心法测定标本中人凝血因子Ⅷ(human coagulation factor Ⅷ, FⅧ)抗原水平并进行验证和应用。方法建立检测人FⅧ抗原(FⅧ∶Ag)含量的双抗体夹心ELISA法;用人FⅧ/VWF标准血浆(NIBSC 07/316)标定内控标准品(S.A.R.P);根据方法学验证的要求对此方法进行线性、准确度、精密度、样品稳定性的研究分析。将验证后的该方法用于FⅧ纯化工艺的监控及产品质量分析。结果以NIBSC 07/316标定分装冻存的S.A.R.P的FⅧ∶Ag为1.12 Ag/mL,标准曲线的线性范围为(0.003—0.112)Ag/mL,各浓度回收率在97.62%—102.19%,CV<5%,R~2≥0.99;不同浓度样品检测结果的批内准确度在90.70%—95.23%,批间准确度在91.50%—94.20%;批内精密度CV值在1.69%—4.98%,批间精密度CV值在2.63%—4.83%。样品添加实验的回收率在87.50%—89.50%,特异性回收率在94.64%—101.78%。具有生物学活性的样品应-80℃冻存,复融1次后立即检测。武汉血制公司FⅧ纯化工艺中聚乙二醇4000(PEG 4000)沉淀和离子交换层析去除了大约60%的FⅧ抗原,工艺稳定性较好,生产规模可线性放大,不同来源产品FⅧ∶C/FⅧ∶Ag的比值接近。结论本方法具有良好的线性、准确度和精密度。用该方法进行FⅧ抗原含量检测可作为FⅧ纯化工艺内部质量控制的一个指标。     

机采血小板悬液在保存过程中凝血因子Ⅷ、Ⅸ生物活性的变化

为了研究机采血小板悬液22℃振荡保存不同时间的凝血因子Ⅷ、Ⅸ生物活性的变化,采用SYSMEXCA-1500型全自动血凝仪对用CS-3000plus血细胞分离机采集的18份血小板悬液于22℃振荡保存条件下,测定0、12、24、48、72、96、120小时7个时间段的FⅧ∶C和FⅨ∶C的活性。结果表明:机采血小板FⅧ∶C在0时活性为(100.51±44.02)%,保存12-120小时,其活性衰减了10%-40%;FⅨ∶C在0时活性为(120.93±20.50)%,保存24-120小时,其活性衰减了10%-35%。结论:机采血小板悬液于22℃振荡保存时凝血因子Ⅷ、Ⅸ仍保持有较高的生物学活性。     

急性心肌梗死患者血浆凝血因子的变化

目的:研究凝血因子V、Ⅶ、Ⅷ、X、Ⅺ的活性在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的变化,并探讨其临床意义.方法:采用一期法测定AMI组(80例)和对照组(80名)因子V促凝活性(factor V coagulant activity,FV:C)、因子Ⅶ促凝活性(factorⅦcoagulant activity,FⅦ:C)、因子Ⅷ促凝活性(factor Ⅷ coagulant activity,FⅧ:C)、因子X促凝活性(factor X coagulant activity,FX:C)、因子Ⅺ促凝活性(factorⅪcoagulant activity,FⅪ:C).结果:①AMI组血浆FV:C、FⅦ:C、FⅧ:C、FX:C、FⅪ:C分别为(134±25)%、(187±32)%、(212±64)%、(140±29)%和(193±64)%,均高于健康对照组(均为P＜0.01),而AMI组凝血因子超过其临界值的发生率分别为63%、77%、90%、64%、81%;②AMI组中再发病例各凝血因子水平明显高于初发组(均为P＜0.01);③不同年龄患者各凝血因子促凝活性有差异.结论:AMI患者存在多个凝血因子活性水平增高,其中以FV:C、FⅦ:C、FⅧ:C、FX:C、FⅪ:C增高明显,存在着高凝状态,可能与AMI的发病相关,因此定期检查凝血因子活性对于及早发现高凝倾向,并加以预防和治疗均具有一定的参考价值.     

中国市场人凝血因子Ⅷ质量分析

目的考察了5种、11个批次的中国市场人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品,分析相关制品的成份。研究对国内制品的有效性和安全性做出评估,为建立新的制品质量标准提供理论依据。方法选用S公司人FⅧ、CSL Alevi-ate、+公司人FⅧ、L公司人FⅧ和Bayer KogenateFS,通过FⅧ测定进行制品活性评估,通过FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ分析杂质蛋白含量,用3种不同蛋白测定方法测定制品总蛋白含量;初步评价von Willebrand Factor(vWF)活性,并用非还原和还原SDS-PAGE电泳分析纯度。结果不同制品在活性检测、蛋白含量测定和电泳纯度评估中均有不同的表现差异。结论不同的工艺制备流程导致不同的制品质量;凝血因子类制品测定不同的方法、设备和检测试剂盒都对数值造成不确定性;甘氨酸影响Bradford法总蛋白含量测定,目前考察的几种FⅧ的关键性质量参数-比活性均大于WHO高纯度(10 IU/mg)和2010版中国药典(1IU/mg)的要求。     

标准曲线在凝血因子Ⅷ测定中的应用

检验信息的有效性是检验工作的目的,检验信息的不正确、不可靠不仅会造成人力、物力的浪费,还可能误导生产过程的改进[1].要得到冷沉淀和新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ:C)的可靠检验信息,保证血液产品的质量,关键在于每次检测时制作的标准曲线是否准确、有效.怎样知道标准曲线准确、有效,可通过对正常质控血浆的测定值来判断.     

1例凝血因子Ⅺ缺乏症的基因突变研究

目的研究1例凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症患者的基因突变,揭示其分子发病机制。方法应用凝固时间法测定患者血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原含量(Fbg)、凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ∶C)、凝血因子Ⅸ促凝活性(FⅨ∶C)、FⅪ促凝活性(FⅪ∶C)及凝血因子Ⅻ促凝活性(FⅫ∶C);采用聚合酶链式反应(PCR)扩增产物直接测序的方法对患者FⅪ基因进行直接检测,鉴别其中可能存在的基因变异。结果患者血浆中APTT、PT、TT、Fbg含量、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅪ∶C及FⅫ:C分别为64.2s、12.8s、17.9s、3.8g/L、87.4%、71.2%、16.6%及80.2%,其FⅪ基因第13号外显子编码482位氨基酸的碱基发生杂合性的错义突变TGC→TGG(Cys482Trp)。结论 Cys482Trp的杂合突变可能是导致患者FⅪ缺乏的分子发病机制。     

显色底物分光光度计法测定FⅧ：C新技术的研究进展

用显色底物分光光度计法测定人凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ:C)是70年代末、80年代初发展起来的1种FⅧ:C检测新技术。其基本过程是将混合试剂在Ca~(2-)活化下与因子Ⅷ反应,其生成物与显色底物作用后,测定形成的显色物质的吸光度。显色底物法测定FⅧ:C技术于1976年由Seghatchian等人首创,用于血友病血浆和供血者血浆中因子Ⅷ水平分析。由于使用显色底物进行比色分析。故被称为     

FⅧ抑制物的特点及其临床治疗

FⅧ抑制物是人体内最常见的抗凝血因子抗体,通过抑制FⅧ∶C活性引起获得性血友病A(AH0 A)。AH- A是一种罕见的出血性疾病,死亡率较高。与遗传性血友病相比,AH -A具有独特的临床特点及治疗措施。早期诊断及选择合理治疗方案对AH-A的预后有积极意义。     

平行计算法在凝血因子Ⅷ两期测定法中的应用

<正> 在医疗实践中,用实验方法诊断血友病和检测凝血因子Ⅷ制剂(冷沉淀,中纯因子Ⅷ浓制剂)都需要测定FⅧ∶C(因子Ⅷ促凝活性)。目前,国内外在用两期法测定FⅧ∶C时,对实验数据的处理多采用手Ⅰ绘图法或简单回归计算法。我们在测定FⅧ∶C的同时,根据两期法的原理,利用计算机辅助数理统计学,提出了一种更方便、更准确的两期测定法数     

非病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达

为了观察非病毒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠 32D细胞系中的表达 ,将B结构域缺失(△ 76 0aa - 16 39aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBDcDNA)亚克隆至质粒载体pRC/RSV ,构建重组质粒载体 pRC/RSV hFⅧBDcDNA。经SuperFectTransfectionReagent转染小鼠 32D细胞系 ,分别采用一期法、ELISA法和RT PCR检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性 (hFⅧ∶C)和抗原含量 (hFⅧ∶Ag)以及细胞中hFⅧBDcDNA的转录。结果表明 :小鼠 32D细胞系培养上清液中的人FⅧ∶Ag最高达到了 4 5 0 .0 8毫微克 /(10 6细胞·2 4小时 ) ,hFⅧ∶C最高达到了 2 .0 1单位 /(10 6细胞·2 4小时 ) ,RT PCR可检测到 32D细胞中hFⅧBDcDNA转录的mRNA。结论 :非病毒质粒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因能够在小鼠 32D细胞系中表达人FⅧ蛋白 ,所表达的FⅧ与正常人血浆中的野生型FⅧ具有相似的凝血活性。     

缺凝血因子Ⅶ血浆的研制及初步性能评价

目的制备缺凝血因子Ⅶ血浆(FⅦDP)并初步评价该FⅦDP的性能。方法利用本实验室建立的抗人凝血因子Ⅶ单克隆抗体(FⅦMcAb)杂交瘤细胞株,采用小鼠体内诱生腹水法和亲和层析法制备高亲和力的FⅦMcAb,并将其偶联至CNBr-Activated Sepharose 4B上,制成FⅦMcAb免疫亲和层析柱,制备FⅦDP;采用凝血一期法检测自制FⅦDP中各凝血因子促凝活性并考察自制FⅦDP的精密度,对比自制FⅦDP和同类进口FⅦDP制品的测定线性范围、比较二者检测不同FⅦ水平样品的效果。结果所制备的FⅦMcAb亚类均被鉴定为IgG1型,利用该FⅦMcAb制备的FⅦDP中FⅦ促凝活性(FⅦ∶C)<1%,而FⅡ∶C、FⅤ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C及FⅩ∶C都>70%,均满足正常凝血所需水平;该FⅦDP线性范围在1.625%—200%,3批次自制FⅦDP批内精密度(Sr)分别为3.30、3.36和3.30,批内变异系数分别为4.12%,4.11%,3.98%;批间精密度(Srr)4.20,批间变异系数4.99%,标准曲线的相关系数(r)分别为-0.998、-0.996和-0.996与同类进口制品(r=-0.998)基本一致;经相关分析,该FⅦDP对于不同FⅦ水平的样品的检测效果与同类进口产品一致,r分别为0.97、0.96和0.97。结论初步评价显示FⅦMcAb免疫亲和层析柱研制出FⅦDP性能良好,可作为FⅦ检测试剂使用。     

急性脑梗死发作期间组织因子途径改变的观察

目的 :观察急性脑梗死 (ACI)与组织因子途径变化以及与该途径有关的其他凝血因子的关系。方法 :71例经 CT确诊为 ACI患者和 5 0名正常人被纳入研究范围。血浆中组织因子 (TF)和组织因子途径抑制物(TFPI)活性测定采用发色底物法 ;抗原测定用酶联免疫吸附法 (ELISA) ;血浆中 F 促凝活性 (F ∶C)和F 促凝活性 (F ∶C)测定用一期凝固法 ;凝血酶原 (F )的活性测定采用 Ecarin法 ;纤维蛋白原 (Fbg)的活性测定采用凝血酶法 ;抗凝血酶 (AT )的测定用肝素辅因子法。结果 :与正常对照组比较 ,ACI患者血浆中TF活性显著增加 (P<0 .0 5 ) ,TF抗原含量显著增加 (P<0 .0 5 ) ,TFPI的活性降低 (P<0 .0 5 ) ,TFPI抗原含量明显降低 (P<0 .0 5 ) ;血浆 F ∶ C显著增加 (P<0 .0 1) ,血浆 F ∶ C明显下降 (P<0 .0 5 ) ,F 活性显著增加(P<0 .0 1) ,Fbg的活性显著增加 (P<0 .0 1) ;AT 活性显著降低 (P<0 .0 1)。结论 :ACI的发生与组织因子途径的启动有关 ,在 ACI早期患者血液呈高凝状态     

Lman1基因复合杂合突变导致的凝血因子Ⅴ、Ⅷ联合缺乏症

凝血因子Ⅴ和Ⅷ(FⅤ、FⅧ)联合缺乏症(F5F8D)是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病。近年的研究发现,该病病因在于基因lman1或mcfd2的突变。本研究的目的是对1名F5F8D先证者及其家系成员的lman1、mcfd2基因进行扩增、测序,以查找潜在的致病突变。采集了先证者及其父母的外周血样本,进行了凝血功能相关检查,包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、血浆纤维蛋白原(Fg)、FⅤ促凝活性(FⅤ∶C)、FⅧ促凝活性(FⅧ∶C),并提取基因组DNA,通过PCR法对先证者lman1基因的13个外显子及侧翼序列、mcfd2基因的4个外显子及侧翼序列进行特异性扩增,产物经纯化后直接测序,以检测致病突变。根据先证者突变所在位点,选择性扩增其父、母的相应片段,纯化、测序,以便进行家系分析。结果表明:先证者APTT82.2秒、PT19.6秒、TT18.6秒,Fg2.9 g/l,FⅤ∶C 7.1%,FⅧ∶C 18.7%。先证者及其母亲lman1基因第8外显子区出现杂合性单碱基插入c.912_913insA,导致蛋白序列改变p.Glu305fsX20;先证者及其父亲lman1基因11外显子区出现杂合性无义突变c.1366CT,导致p.Arg456X。结论:先证者lman1基因的复合杂合突变c.912_913insA、c.1366CT是导致其发病的原因;前者继承自其母,后者继承自其父。这种复合杂合突变的组合方式尚未见有报道。     

逆转录病毒载体介导人凝血因子Ⅷ的体外高效表达

目的　建立逆转录病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ (FⅧ )体外高效表达体系。方法　将一B区缺失 (76 0aa～ 16 39aa)的人FⅧcDNA(FⅧBDcDNA)克隆至逆转录病毒载体pLNCX ,构建了重组表达载体pLNC FⅧBD。经PA317细胞包装后 ,感染多种靶细胞。分别采用一期法、ELISA法和RT PCR检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性 (FⅧ∶C)和抗原含量 (FⅧ∶Ag)以及细胞中FⅧBDcDNA的转录。结果　pLNC FⅧBD在 4种靶细胞中以NIH3T3细胞的表达最高 ,在 2 4h内每毫升中 10 6细胞表达FⅧ∶C为 1.6U ,FⅧ∶Ag为 5 0 0ng。结论　逆转录病毒载体能够介导人FⅧ的体外高效表达 ,为血友病A的基因治疗奠定了基础     

大疱性类天疱疮并获得性血友病A患者血浆IgG亚型及FⅧ结合表位鉴定

目的确定1例大疱性类天疱疮并获得性血友病 A 患者的临床和实验室诊断;通过体内外干预实验观察获得性血友病 A 患者体内的 FⅧ抑制物对正常人血浆及兔 FⅧ凝血活性(FⅧ:C)的影响;确定患者 FⅧ抑制物的 TgG 亚型和结构表位,以揭示该病发病的分子机制。方法用Ⅰ期法测定患者血浆 FⅧ:C;以 Bethesda 单位(BU)表示 FⅧ:C 抑制物滴度;用蛋白 A-琼脂糖柱纯化患者及正常人血浆 IgG;用活化部分凝血活酶时间(APTT)分析其对 FⅧ:C 的抑制作用;观察 FⅧ抑制物对兔血浆 FⅧ:C 活性的抑制作用;分别用抗 IgG_1、IgG_2、IgG_3、IgG_4抗体作 Western blot,结合灰度扫描确定患者血浆 IgG 亚型相对表达量;散射比浊法测定患者及正常人体内各 IgG 亚型浓度;用 FⅧ/FⅧ抑制物固相结合试验及 Western blot 鉴定患者 IgG 抗体(FⅧ抑制物)作用于 FⅧ的具体“表位”。结果①患者 APTT 明显延长,正常血浆不能纠正;FⅧ:C<1.5%,FⅧ抑制物滴度为147.8 BU;②纯化的患者 IgG 以剂量依赖方式抑制正常人混合血浆 FⅧ:C;动物实验显示患者血浆能以时间依赖方式延长兔血浆 APTT;③Western blot 结果显示 FⅧ抑制物成分主要为 IgG_4,其次为 IgG_1,FⅧ抑制物作用于FⅧ:C 的结构相对分子质量为44×10~3。散射比浊法测定结果显示患者体内 IgG_4、IgG_1含量明显高于正常人。结论研究结果证明大疱性类天疱疮并获得性血友病 A 患者体内 FⅧ抑制物对 FⅧ:C有抑制作用,FⅧ抑制物的 IgG 亚型主要为 IgG_4,其次为 IgG_1;患者 FⅧ抑制物作用于 FⅧ的表位为相对分子质量为44×10~3的肽段,揭示了该获得性血友病 A 发生、发展的分子机制。     

一种全自动血凝仪在人凝血因子Ⅷ浓缩剂效价检测中的应用

目的对STAGO全自动血凝仪检测人凝血因子Ⅷ浓缩剂(FⅧ)效价进行检测方法(一期法)确认。方法使用不同稀释液(样品稀释液(来自2015版中国药典)、Owren-Koller稀释液(来自法国DIAGNOSTICA STAGO公司))检测FⅧ效价,比较二者结果的差异。根据2015版中国药典要求进行检测方法确认,包括准确度、线性和范围、精密度及选择性。结果在(0.125-1)IU/mL范围内,人凝血因子Ⅷ国家标准品(GB)和FⅧ的效价[LOG(IU/mL)]和凝固时间[LOG(S)]均呈线性,相关系数均>0.990,各浓度回算值的回收率为96%-104%;准确度确认中GB回收率100%,各测定值CV≤5.4%;批内和批间精密度结果均CV<10.0%;选择性确认中GB回收率96%,且各效价结果均CV≤5.9%。2种稀释液检测效价结果差值在5%以内。结论 STAGO全自动血凝仪可满足FⅧ效价检测要求;2种稀释液对检测结果无明显差异。