Nek2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响

目的研究RNA干扰Nek2表达对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响以及相关的分子机制。方法设计合成3条针对Nek2基因的siRNA,转染至SKOV3细胞中,采用Real-time RT-PCR和Western blot技术筛选出抑制效率最高的Nek2-siRNA序列,用Transwell方法检测转染该序列的SKOV3细胞侵袭能力的改变,并用Western blot方法检测Nek2-siRNA转染后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表达的变化。结果①RNA干扰序列2对SKOV3细胞中Nek2的抑制效果最明显;②与未转染组和阴性对照组相比,转染了Nek2-siRNA的SKOV3细胞侵袭能力明显下降(P<0.01);③Western blot检测表明,与未转染组和阴性对照组相比,Nek2-siRNA转染48 h后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9的表达明显下调,而TIMP-1的表达明显上调(P<0.01)。结论 Nek2-siRNA能有效得沉默SKOV3细胞中Nek2的表达,通过下调MMP-2、MMP-9的表达,上调TIMP-1的表达,从而抑制SKOV3细胞的侵袭转移。     

HYAL2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术抑制人卵巢癌SKOV3细胞株HYAL2基因的表达,探讨siRNA-HYAL2对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭能力的影响.方法：将靶向HYAL2的siRNA及对照分别转染人卵巢癌SKOV3细胞株,RT-PCR测定HYAL2基因mRNA表达情况,MTT法检测SKOV3细胞增殖,FCM检测细胞周期变化,构建Transwell小室体外侵袭模型观察其对细胞侵袭能力的影响.结果：转染siRNA-HYAL248 h后HYAL2基因mRNA表达水平明显降低,细胞存活率下降（P〈0.05）,S期细胞百分比降低、G0/G1期细胞百分比升高（P〈0.05）;转染24 h后平均穿膜细胞数减少（P〈0.05）.结论：siRNA-HYAL2能特异性抑制HYAL2的mRNA表达水平,HYAL2基因沉默后,卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭能力降低,HYAL基因可能成为卵巢癌基因治疗的新靶点.     

Clusterin基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞增殖与侵袭的影响

目的通过RNA干扰技术抑制卵巢癌SKOV3细胞分泌型clusterin(sCLU)基因的表达,研究其对卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法通过脂质体介导靶向sCLU基因的siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞,实验分为4组:实验组(sCLU-siRNA+脂质体)、阴性对照组Ⅰ(negative control siRNA+脂质体)、阴性对照组Ⅱ(sCLU-siRNA)、空白对照组(等体积的完全培养液)。RT-PCR和蛋白质印迹分析法检测sCLU表达;利用MTT法、Transwell小室体外侵袭实验及流式细胞仪AnnexinⅤ/PI法检测评价sCLU基因抑制后对卵巢癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。结果靶向sCLU基因的siRNA明显、特异性地抑制了sCLU mRNA和蛋白的表达水平;MTT实验结果显示实验组细胞增殖能力较各对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪AnnexinⅤ/PI法检测结果显示实验组细胞凋亡率较各对照组明显升高,达到(15.84±1.53)%,较空白对照组升高了约9%,差异有统计学意义(P<0.01)。侵袭实验结果提示实验组细胞侵袭能力受到明显抑制,实验组穿膜细胞数量为(26.52±6.22)个/视野,较各对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 sCLU基因沉默明显抑制了卵巢癌SKOV3细胞的增殖、侵袭能力,并增加了其凋亡率,sCLU基因有望成为卵巢癌治疗的新靶点。     

Chk1基因对人卵巢癌细胞HO8910增殖及细胞周期调控的影响及可能机制

目的：探讨siRNA沉默检测点激酶1（Chk1）基因对人卵巢癌细胞HO8910增殖和周期调控的影响及其作用机制。方法：设计并合成3条Chk1 siRNA干扰片段,转染进入卵巢癌细胞HO8910,Western blot检测转染前后HO8910细胞中Chk1蛋白的表达情况,筛选出有效片段。将Chk1 siRNA有效片段转染进入HO8910细胞,采用MTT法和流式细胞仪分析Chk1 siRNA对HO8910细胞增殖和周期的影响;Western blot方法分别检测细胞周期相关基因CyclinA、CDK4、Cdc25A蛋白表达。 结果：3个siRNA中,1条是有效siRNA。该有效Chk1 siRNA片段转染后,HO8910细胞中Chk1蛋白水平下降约53.6%,明显低于未转染组和脂质体转染组（P=0.000）。转染48 h后,Chk1 siRNA转染组HO8910细胞增殖活性下降,抑制率为（52.1±5.1）%,明显高于脂质体转染组的（7.6±3.8）%（P=0.000）。流式细胞仪检测显示Chk1 siRNA转染组HO8910细胞G2/M期比例为（5.03±2.62）%,明显低于未转染组（19.35±2.19）%和脂质体转染组（19.76±2.67）%（P=0.000）。Western blot结果显示转染Chk1 siRNA后,细胞内与细胞周期相关的CyclinA、CDK4、Cdc25A蛋白水平表达明显增强,与未转染组和脂质体组比较,差异有统计学意义（P=0.000）。结论：siRNA沉默Chk1基因后,可明显抑制卵巢癌细胞HO8910细胞的增殖,其抑制增殖作用与减弱G2/M期阻滞有关。     

RNAi抑制卵巢癌SKOV3细胞MMP-24基因表达及对细胞侵袭的影响

目的 探讨应用RNA干扰技术沉默MMP-24基因表达,研究其对人卵巢上皮癌SKOV3细胞侵袭力的影响.方法 设计合成2条特异性针对MMP-24基因的siRNA,转染至SKOV3中,采用RT-PCR和Western blotting检测MMP-24mRNA和蛋白表达情况,细胞侵袭实验观察转染后细胞侵袭能力的变化.结果 转染siRNA后,卵巢癌细胞MMP-24mRNA表达受抑制,蛋白表达降低,细胞侵袭力减弱.结论 RNAi沉默MMP-24基因可影响卵巢癌细胞的侵袭,有可能成为治疗卵巢癌的新途径.     

c-cbl 基因沉默对卵巢癌 SKOV3细胞增殖和侵袭的影响

目的：探讨 c-cbl 在卵巢癌的表达及其对卵巢癌细胞增殖、侵袭的影响。方法通过免疫组织化学法（S-P 法）检测c-cbl 蛋白在卵巢癌组织的表达;EdU 检测卵巢癌 SKOV3细胞沉默 c-cbl 基因后细胞增殖能力变化;Transwell 检测卵巢癌 SK-OV3细胞侵袭能力;Western blot 检测 P21蛋白和 P53蛋白的表达。结果 c-cbl 蛋白在卵巢癌中表达位于细胞质,在卵巢癌中, c-cbl 蛋白呈强阳性表达,在正常卵巢组织 c-cbl 蛋白呈弱阳性或者阴性表达。与正常卵巢组织比较,c-cbl 蛋白在卵巢癌表达明显增高（P＜0．05）;c-cbl 蛋白在卵巢癌的表达与 FIGO 分期相关（P＜0．05）;沉默卵巢癌 SKOV3细胞 c-cbl 基因后,卵巢癌细胞增殖能力和侵袭能力降低（P＜0．05）;沉默 c-cbl 基因后,P21和 P53蛋白表达上调（P＜0．05）。结论 c-cbl 蛋白在卵巢癌表达上调,沉默 c-cbl 基因可能与上调 P21和 P53蛋白有关。     

RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的：研究pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,阐明RNA干涉技术在卵巢癌生物治疗领域中的作用。方法：应用人卵巢癌细胞系SKOV3对15例裸鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型,随机分为3组：对照组（生理盐水）、空质粒对照组及重组质粒组（pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3）。应用电子穿孔仪将质粒转入裸鼠移植瘤内,观察重组质粒注射后第7、14、21和28天各组裸鼠皮下移植瘤体积变化。利用Western blotting检测重组质粒对STAT3蛋白表达的影响,采用HE及TUNEL染色方法观察肿瘤组织形态变化及细胞凋亡情况。结果：重组质粒瘤内注射对SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长有明显的抑制作用,与2个对照组比较,重组质粒组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢（P<0.01）。重组质粒组瘤体内STAT3及CyclinD1、VEGF、survivin、c-myc蛋白表达明显低于2个对照组（P<0.01）。HE染色显示,重组质粒组肿瘤细胞出现大片细胞坏死,2个对照组肿瘤细胞以正常形态居多。TUNEL染色显示,重组质粒组癌组织有大量细胞凋亡,2个对照组几乎均为TUNEL阴性反应细胞。结论：pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长。     

多肿瘤抑制基因对卵巢癌细胞周期的影响

0　引言　多肿瘤抑制基因 1(MTS1)是人们发现的第一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因 [1 ,2 ] ,其编码蛋白为 p16蛋白 ,它通过与细胞周期素竞争性结合细胞周期素依赖激酶并使之失活 ,阻止细胞由 G1期进入 S期 ,从而抑制细胞分裂以及向恶变发展 .在以往的研究 [3]中我们构建了 MTS1的真核表达载体并将其转入卵巢癌细胞 .我们进一步探讨了 MTS1基因对卵巢癌细胞周期的影响 .1　材料和方法1.1　材料　 DMEM培养基购自 Gibco公司 ;胰蛋白酶购自Sigma公司 ;胎牛血清购自杭州四季青公司 ;人源性卵巢癌细胞系 HO- 8910由本实验室保存 ,经…     

Skp2基因沉默对 SPC-A-1肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨 S 期激酶相关蛋白2（Skp2）基因沉默对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将 Skp2 RNA 干扰表达载体转染至 SPC-A-1肺癌细胞中,G418筛选获得阳性克隆细胞。通过实时荧光定量（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺癌细胞中 Skp2的表达。采用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐（M TT ）法检测各组肺癌细胞生长、凋亡情况。结果转染 Skp2 shRNA 表达载体的肺癌细胞中 Skp2蛋白表达量明显减少,抑制效率分别可达75．3±5．1,70．4±3．2;转染 Skp2 shRNA 表达载体的肺癌细胞生长减慢,阻滞于 G1期的增多,S 期细胞减少。 Skp2 shRNA 转染质粒组凋亡率较阴性对照组明显增加,细胞凋亡率分别为（17．5±2．8）％、（15．6±3．1）％。结论通过特异性沉默 Skp2基因的表达,可有效降低肺癌细胞中 Skp2蛋白表达水平,抑制肺癌细胞生长及增加细胞凋亡。     

RNA 干扰bcl-2基因对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖影响的实验研究

目的探讨RNA干扰bcl-2基因对人卵巢癌细胞体外增殖及凋亡的调控作用.方法选用人卵巢癌细胞进行体外培养,以siRNA分别处理SKOV3细胞24～72h后,MTT法检测细胞增殖,SABC免疫组织化学法检测细胞内bcl-2、bcl-xl、bax、caspase-3蛋白表达水平.结果 RNA干扰bcl-2基因对SKOV3细胞增殖有抑制作用.bcl-2表达下调,Caspase-3蛋白表达水平上调.结论 RNA干扰bcl-2对人卵巢癌细胞的增殖具有明显的抑制作用.下调bcl-2的表达,上调Caspase-3蛋白表达水平.特异性地降解抗凋亡基因bcl-2的mRNA是其作用机制.     

RNA干扰survivin对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰survivin基因对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响.方法 实验分3个组：siR-NA组,采用脂质体法将靶向survivin siRNA荧光真核表达质粒载体pGPU6-GFP-survivin-shRNA转染卵巢癌HO-8910PM细胞;空白对照组,单纯细胞培养;阴性对照组,用表达与survivin序列无同源性的siRNA片段质粒pGPU6-GFP-NC转染细胞.于转染后48 h和72 h,用PI单染法流式细胞术检测各组HO-8910PM细胞周期的变化以及Western blot检测survivin蛋白的表达情况.结果 PI单染流式细胞仪检测细胞周期结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比较,2个时间点siRNA组转染后的G0/G1期细胞比例明显增加,而G2/M期细胞比例均下降（P＜ 0.05）;Western blot结果证实,siRNA组的HO-8910PM细胞survivin蛋白的表达量明显下调.结论 导入survivin基因特异性的siRNA可导致卵巢癌HO-8910PM细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞增殖受阻,且细胞sur-vivin蛋白表达量下降.     

UbcH10基因沉默对肺癌NCI-H226细胞增殖及细胞周期的影响

目的：通过脂质体转染siRNA方法沉默人肺鳞癌细胞NCI-H226中UbcH10基因,观察基因沉默后细胞增殖活性的变化及其对细胞周期的影响。方法：设计3条针对UbcH10基因CDS区不同位点的siRNA序列并构建shRNA表达载体,脂质体法转染重组质粒至NCI-H226细胞。转染后48小时,RT-PCR,Western-blot检测细胞内UbcH10 mRNA及蛋白含量。使用有效siRNA序列（pshRNA2）转染细胞,转染后24、48小时CCK-8检测细胞活性。使用有效siRNA序列转染细胞,转染后48小时收集细胞,流式法检测细胞周期。结果：成功构建shRNA重组质粒并转染NCI-H226细胞。转染siRNA 48小时后,3组NCI-H226细胞中UbcH10基因的mRNA及蛋白含量均明显下降;其中2号siRNA序列的沉默效果最好,UbcH10基因剩余表达量为对照组的14%。使用有效序列转染NCI-H226细胞24、48小时,细胞增殖活性明显降低,与基因未干预组比较,差异显著（P＜0.05）。使用有效序列转染NCI-H226细胞48小时,细胞明显阻滞于G2期,与基因未干预组比较有显著差异（P＜0.05）。结论：UbcH10基因沉默,可显著抑制NCI-H226细胞增殖活性,并使肺癌细胞阻滞于细胞G2期。     

RNAi沉默clusterin基因对卵巢癌SKOV3细胞放射敏感性的影响

目的:研究clusterin(CLU)基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞放射敏感性的影响.方法:靶向CLU基因的siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞,Western blot法测定CLU基因蛋白表达水平.给予不同放射剂量(2、4、6Gy)处理后,通过MTT法及克隆形成实验检测卵巢癌SKOV3细胞的存活率及克隆形成率,流式细胞...     

细胞黏附分子L1基因沉默对胰腺癌细胞Capan-2神经侵袭能力的影响

目的 观察沉默细胞黏附分子L1基因(L1CAM)表达后对胰腺癌Capan-2细胞体外神经侵袭能力的影响.方法 应用慢病毒介导的L1CAM-shRNA干扰载体转染胰腺癌Capan-2细胞,以L1CAM-NC转染细胞为对照.分别将L1CAM-shRNA组及L1CAM-NC组细胞与大鼠背根神经节(DRG)、基质胶(matrigel)一起构成共培养神经侵袭模型,倒置显微镜下观察神经突及细胞生长情况并拍照,利用Image pro plus图像分析软件对照片进行分析.结果 共培养模型中,L1CAM-NC对照组细胞向DRG方向不断迁移增殖,包绕神经突起并沿之向DRG爬行,而L1CAM-shRNA组中并未观察到该现象.共培养第3天和第5天时,L1CAM-NC对照组细胞集落面积显著高于L1CAM-shRNA组(P＜0.01),但两组的神经突生长差异无统计学意义.结论 干扰L1CAM的表达可能通过抑制细胞集落形成及迁移爬行的方式抑制胰腺癌Capan-2细胞的神经侵袭作用.     

RNA干扰沉默HMGN5基因对肺癌H1299细胞增殖和周期的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默高迁移率族核小体结合域5(HMGN5)基因对肺癌H1299细胞增殖和细胞周期的影响,为肺癌的基因靶向治疗提供理论依据。方法:构建HMGN5特异性siRNA慢病毒载体,感染肺癌H1299细胞,设阴性对照组及干扰组,应用Real-time PCR和Western blotting方法分别从mRNA和蛋白质水平检测各组干扰质粒对HMGN5基因的干扰效果,MTT和BrdU法检测HMGN5 siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果:与阴性对照组比较,干扰组HMGN5的mRNA表达量下降了50.7%(P< 0.05),蛋白表达水平明显降低(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;BrdU实验RNAi干扰组细胞增殖率（37.8%）明显低于对照组（55.0%）(P< 0.05);流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比（54.6%±0.9%）高于阴性对照组（46.5%±0.4%）(P<0.05)。结论:运用RNA干扰技术能够有效沉默H1299细胞的HMGN5基因,并抑制肺癌细胞的增殖能力,提示HMGN5在肺癌的发生发展中起重要作用,抑制HMGN5的表达可能成为一种治疗肺癌的方法。     

RNA干扰靶向沉默FLIP基因对卵巢癌细胞A2780生物学特性的影响及生长抑制作用

目的探讨靶向FLIP基因的小干扰RNA（siRNA）对人卵巢癌细胞A2780生物学特性的影响及生长抑制作用。方法设计并体外化学合成FLIP序列特异性双链RNA,在脂质体（LipofectamineTM2000）介导下转染人卵巢癌细胞株A2780。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测FLIP siRNAs转染前后A2780细胞FLIP基因mRNA和蛋白表达的变化,并筛选出抑制作用最强的FLIP-siRNA。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、Annexin-V-PI双染法流式细胞术（FCM）分别检测FLIP-siRNA转染对A2780细胞的生长抑制作用和对凋亡的影响。结果特异性FLIP-siRNAs片段能有效降低A2780细胞中FLIP的 mRNA和蛋白水平（P＜0.01）,最大抑制率分别为77.4％和66.1％;转染FLIP-siRNA后,A2780细胞的生长活力明显下降（P＜0.05）,RNA干扰组的细胞凋亡也显著增加（P＜0.05）。结论靶向FLIP基因的siRNAs可在转录和翻译水平抑制FLIP基因表达;并可抑制卵巢癌A2780细胞生长,促进其凋亡。     

Effect of human epididymis protein 4 gene silencing on the malignant phenotype in ovarian cancer

Background  Human epididymis secretory protein 4 (HE4) has been proved to be a promising novel biomarker for the detection of epithelial ovarian carcinomas. Compared with CA125, HE4 assay demonstrated an improved ability to discriminate between pelvic mass with malignant and benign disease. Though it is well known that HE4 is overexpressed in ovarian cancer, however, the role of HE4 in the carcinogenesis and progression of ovarian cancer remains unkown.

Methods  In this study, we explored the role of HE4 in the carcinogenesis and progression of ovarian cancer. We screened nine ovarian cancer cell lines for HE4 expression, and using RNA interference (RNAi), we silenced HE4 gene expression in CaoV3 and SKOV3.ip1 ovarian cancer cell lines. We assessed the effect of HE4 gene silencing on the transformed phenotype by examining the cell cycle, apoptosis, proliferation and transwell migration/invasion in vitro.

Results  HE4 gene silencing induces G0/G1 arrest and blocks the progression from the G1 to S phase in CaoV3 and SKOV3.ip1 cells. HE4 knockdown also inhibited cell proliferation, migration and invasion in SKOV3.ip1 cells in vitro.

Conclusion  HE4 may be involved in the regulation of the cell cycle and promote ovarian cancer migration and invasion.