两性多肽结构影响鲍曼不动杆菌外膜通透性的实验研究

目的明确两性多肽结构对鲍曼不动杆菌(AB)外膜通透性的影响。方法 PCR扩增LysAB3基因及删除两性多肽结构的LysAB3-D基因,以pET28a(+)为载体构建重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达LysAB3及LysAB3-D,金属离子螯合亲和层析法纯化重组蛋白。将AB分别经LysAB3及LysAB3-D处理后,用扫描电子显微镜观察菌体形态,荧光显微镜观察菌体中是否有绿色荧光的聚集。结果经LysAB3处理后的AB,在扫描电子显微镜下可见菌体表面粗糙、皱缩,部分裂解为碎片;在荧光显微镜下可见菌体内有绿色荧光聚集。而删除两性多肽结构的LysAB3-D作用AB后,却没有上述现象的发生。结论两性多肽结构可增加AB外膜通透性,有助于裂解酶进入其中,达到抗菌目的。     

鲍曼不动杆菌噬菌体AB3裂解酶基因的表达及其抗菌活性分析

目的构建噬菌体AB3裂解酶LysAB3原核表达载体,测定LysAB3对鲍曼不动杆菌的抗菌活性。方法PCR扩增LysAB3基因,以pET28a(+)为载体构建重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达LysAB3,金属离子螯合亲和层析法纯化重组蛋白。检测LysAB3的抗菌力、裂解谱、作用的最佳pH和温度,以及对细胞壁肽聚糖的降解力。结果扩散法表明LysAB3对40株鲍曼不动杆菌均有抗菌作用,并可降解其肽聚糖。LysAB3作用的最佳pH为7,最佳温度为25℃。经LysAB3作用后的鲍曼不动杆菌,在扫描电镜下可见菌体表面粗糙、皱缩,部分裂解为碎片。结论噬菌体AB3裂解酶LysAB3对鲍曼不动杆菌具有明显的抗菌活性。     

重组乙酰胆碱受体α亚单位-BirA识别多肽序列基因的构建与表达

[目的]构建重组乙酰胆碱受体亚单位-BirA识别多肽序列基因(pcDNA 3.1-AChR-αBirA),并对其进行真核基因表达.[方法]设计引物生物素蛋白连接酶(BirA)识别多肽序列基因,将载体pcDNA3.1-AChR-αBirA识别多肽序列基因连接,并用EcoRⅤ单酶切检查BirA识别多肽序列基因插入的正确性,并测定序列进行验证.将构建成功的载体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上进行表达,经激光扫描共聚焦显微镜验证其产物.[结果]电泳检查可见大小为63 bp的条带,经测定序列验证了插入的基因序列为BirA识别多肽序列基因;转染后经激光扫描共聚焦显微镜观察到CHO细胞膜上的绿色荧光.[结论]成功构建了AChR-αBirA识别多肽序列基因重组载体,并可在CHO细胞中较好地表达.     

突变APP荧光融合基因的构建和表达

目的探讨阿尔茨海默病（Alzheimer disease）的发病机制，研究淀粉样蛋白前体（amyloid protein precursor，APP）酶解过程，构建含有APP Flemish突变的荧光真核表达系统。方法通过聚合酶链式反应（PCR）得到含有Flemish突变的APP最后300bp片段（C99）、黄色荧光蛋白碱基序列（yellow fluorescence protein，YFP），利用基因工程技术将YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3．0中，通过酶切，测序鉴定最终得到重组质粒pcDNA3．0-YFP—C99，将其转染至人神经母细胞瘤细胞（SH—SY5Y）中，利用激光共聚焦显微镜观察融合基因表达和Aβ的生成，MTT检测转染细胞活性。结果①基因序列分析证明重组质粒构建成功；②激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光分布于转染细胞内，表明融合基因能够准确表达荧光；③MTT检测显示AB生成后细胞活性下降，差异有极显著性意义（P〈0．01）；④激光共聚焦显微镜下观察YFP—C99能够生成Aβ，转染细胞内有荧光颗粒聚集沉积，形态异常。结论荧光标记APP Flemish突变重组质粒构建成功，为进一步在体研究APP的有序裂解特别是γ裂解活动奠定了基础。     

鲍曼不动杆菌对常用抗生素耐药性分析

目的 探讨鲍曼不动杆菌对常用抗生素的耐药机制。方法 采用K-B法和琼脂稀释法检测35株鲍曼不动杆菌对常用的β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类药物的药敏情况;碘-淀粉法、三维试验、协同法、纸片扩散确证试验检测产β-内酰胺酵睛况;SDS-PAGE法检测其外膜蛋白,直接荧光法检测对环丙沙星的吸收和积累,PCR法扩增tem-1、tzac-4、gyrA基因并对gyrA基因进行测序分析。结果 35株鲍曼不动杆菌中有28株表现为多重耐药（同时耐3种以上药物）,其中产青霉素酶的菌株16株,产头孢菌素酶的菌株10株,产金属β-内酰胺酶的菌株2株,产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的菌株3株;耐药菌株与敏感菌株相比,外膜蛋白在约29kD条带处消失,在26kD条带处明显增强;耐药菌株药物积累量不及敏感菌株,经叠氮钠处理后,积累量上升并接近敏感菌株水平;PCR扩增结果：tem-1除3株敏感菌株和2株耐药菌株为阴性外,其余均为阳性;aac-4均为阴性,gyrA均为阳性,gyrA测序发现耐药菌株有点突变。结论 鲍曼不动杆菌对抗生素的耐药与产生β-内酰胺酶、外膜蛋白的低通透性和主动外运以及基因的突变有关。     

EST3-EGFP融合蛋白重组体的构建和表达

目的 构建EST3一EGFP融合蛋白穿梭载体并检测其表达。方法 重叠延伸PCR获取EST3一EGFP融合基因,克隆至pTriEx-4穿梭载体中,重组体转化至细菌Rosetta（De3）pLacI,诱导蛋白的表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达的融合蛋白;免疫印迹法检测重组蛋白的免疫学活性;荧光显微镜观察转化宿主细菌的发光活性。结果 成功构建了EST3EGFP重组体;融合蛋白主要分布于表达菌细胞质中;免疫印迹杂交检测表明重组蛋白具有EST3的免疫原性;诱导后的菌体在荧光显微镜下可见强烈的绿色荧光。结论 成功构建的EST3一EGFP穿梭表达载体具有EST3免疫原性和GFP发光特性。     

烧伤患者气管套管内鲍曼不动杆菌生物膜形成及特征研究

目的观察鲍曼不动杆菌在烧伤患者气管套管（ETT）内细菌生物膜（BF）的形成过程及其特征。方法烧伤患者ETT内壁取样（临床菌株）,Vitek2快速细菌自动鉴定仪分离鉴定9株鲍曼不动杆菌且均为泛耐药菌株。临床菌株分别于体外培养12、24、48、72h,改良微孔法进行BF半定量黏附试验;FITC-ConA/PI荧光双染色后激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察并测定成熟BF厚度;以标准菌株鲍曼不动杆菌（ATCC19606）作为对照。于ETT拔除时收集并制备套管内壁标本,扫描电子显微镜观察。结果 BF半定量黏附试验结果显示,临床菌株黏附力在体外培养24～48h时达到高峰,且各时相点均显著大于标准菌株（P〈0.05）;CLSM动态观察发现,临床菌株在体外培养48h左右形成成熟BF,其厚度均显著大于标准菌株（P〈0.05）;ETT内壁扫描电镜观察可见成熟BF呈团状簇集,细菌被大量胞外多糖复合物包埋并融合呈片状。结论鲍曼不动杆菌能在烧伤患者ETT内壁形成BF,且具有成熟早、数量多、黏附能力强的特点,是烧伤后ETT相关感染的重要原因。     

GPC3真核表达载体的构建及其对肝癌细胞功能的影响

目的：通过构建GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体，研究磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3，GPC3）促细胞增殖效应的影响，探讨GPC3基因对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响。方法：应用基因重组技术及限制性内切酶酶切构建并鉴定pEGFP-IRES-N1-GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体，经脂质体Lipofectamine^TM 2000介导转染BEL-7404后，通过G418筛选出抗性克隆，应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测GPC3 mRNA在真核细胞中的表达，并在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况，采用免疫荧光法和流式细胞仪检测GPC3对细胞增殖效应的影响。Transwell小室实验检测BEL-7404肝癌细胞的侵袭能力。结果：限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子，荧光显微镜下可见转染的真核细胞胞膜区发出强绿色荧光，RT-PCR法表明GPC3在真核细胞中成功表达，转GPC3的BED7404肝癌细胞与对照组相比有促细胞增殖及侵袭和转移效应。结论：构建完成真核表达重组质粒pEGFP—IRES-N1-GPC3；GPC3基因在BEL-7404中成功表达；GPC3可促进肝癌细胞的增殖，其通过增加细胞的侵袭能力而促进肝癌的转移。     

野生型与Pro370Leu突变型myocilin基因真核细胞表达的对比研究

目的比较Pro370Leu突变型myocihn（mMYOC）与野生型myocilin（wMYOC）基因在真核细胞中表达的差别,了解原发性开角型青光眼（POAG）的发病机制。方法将携带有wMYOC基因的绿色荧光蛋白重组表达载体pEGFP-N3-wMYOC和携带有mMYOC基因的红色荧光蛋白重组表达载体pDsRed2-N1-mMYOC,分别及共同转染真核细胞Hela,用荧光显微镜观察蛋白表达定位情况,并用Western印迹分析蛋白分泌情况。结果荧光显微镜观察到wMYOC蛋白和mMYOC蛋白均成功表达,都定位在细胞质中,但wMYOC蛋白分布均匀,而mMYOC蛋白呈聚集状态。共表达时,wMYOC蛋白也呈聚集状态,且与mMYOC蛋白有共定位倾向。经Western印迹分析,相应的转染细胞可分泌wMYOC蛋白,而不能分泌mMYOC蛋白;当共表达时,也没有wMYOC蛋白分泌。结论两种基因都能成功表达,都定位在细胞质;mMYOC蛋白表现为聚集倾向和分泌障碍,并且影响wMYOC蛋白的表达和分泌特性。     

携带hHCN4基因重组腺病毒载体体外转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建重组腺病毒载体Ad-hHCN4-IRES/eGFP在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）,检测目的基因在BMSCs中mRNA和蛋白水平是否有表达。方法采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSCs;将携带hHCN4基因的重组腺病毒转染大鼠BMSCs,用荧光显微镜观察转染后BMSCs绿色荧光蛋白的表达,用RT-PCR和Western Blot法检测转染后hHCN4基因mRNA和蛋白水平的表达情况。结果 BMSCs成功贴壁分离传代。转染目的基因24 h后荧光显微镜下即观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测到有hHCN4 mRNA的表达,Western blot法检测到有其蛋白水平的表达。结论重组腺病毒载体转染的BMSCs能够表达hHCN4基因。     

ICU院内鲍曼不动杆菌感染36例临床分析

目的探讨重症监护病房（ICU）鲍曼不动杆菌感染的临床特点、治疗及预防措施。方法对36例并发院内鲍曼不动杆菌感染患者进行回顾性调查,并根据药敏试验分析其对15种常用抗菌药物的耐药率。结果鲍曼不动杆菌几乎均为多重耐药,耐药率最低的是亚胺培南（66.7%）。结论鲍曼不动杆菌已成为医院感染尤其是ICU感染的主要致病菌之一,在抗生素治疗过程中形成多重耐药;对多重耐药的鲍曼不动复合群杆菌感染的患者应以亚胺培南作为第一线抗菌药物;重点是加强预防,防止鲍曼不动杆菌感染的发生。     

不动杆菌医院内感染的耐药性分析

目的探讨不动杆菌医院感染的临床状况、病原菌分类及耐药现状。方法对2001年1月-2004年10月医院感染病案进行统计分析，并用VITEK CC4全自动微生物分析系统，对从临床感染标本中分离的284株不动杆菌进行鉴定和药物敏感试验。结果不动杆菌的医院感染以鲍曼不动杆菌为主，占75．4％，其次分别为醋酸钙不动杆菌占13．7％，洛菲不动杆菌占9．8％，溶血不动杆菌占1．1％。对不动杆菌最有效的抗生素顺序为：亚安培南、阿米卡星、哌拉西林／他唑巴坦。鲍曼不动杆菌对抗生素的敏感性低于其他不动杆菌。结论不动杆菌医院内感染及耐药性呈上升趋势，鲍曼不动杆菌是医院常见病原菌之一，并具多重耐药特性。     

28例鲍曼不动杆菌血行感染临床分析

目的对鲍曼不动杆菌血行感染的临床及预后效果进行研究分析。方法选取我院2011年10月至2013年10月收治的28例鲍曼不动杆菌血行感染患者,对其临床资料进行回顾性分析。结果 28例患者中,9例死亡,12例好转,4例治愈,好转率为42.9%;随访1年以上有4例,其中2例死亡;同时患者血培养菌株具有较高的耐药性,并且对亚胺培南,美罗培南的耐药率高达85.7%,对头抱呱酮/舒巴坦的耐药率是17.9%。结论鲍曼不动杆菌血行感染出现死亡的机率较高,并且其菌株具有较高的耐药性,所以需要提升对鲍曼不动杆菌的重视程度。     

多重耐药革兰阴性杆菌I类整合子结构与功能分析

目的探索I类整合子在多重耐药的革兰阴性杆菌中的功能作用,并对其基因结构进行研究,为阐明革兰阴性杆菌的耐药机制和抑制耐药性的产生提供理论依据。方法选择温岭市妇幼保健院2009年7月～2011年10月的多重耐药革兰阴性杆菌80株,其中铜绿假单胞菌40株,鲍曼不动杆菌40株,使用K—β纸片法和双纸片协同实验对细菌的耐药性和超广谱β-内酰胺酶（ELSBs）的产生情况进行考察。对耐药且产ELSBs的细菌进行筛选．使用聚合酶链式反应（PCR）扩增实验、电泳法、整合酶Souhen杂交实验对耐药细菌体内的I类整合子存在情况、整合子基因结构、基因位置进行考察。结果药敏结果显示,40株铜绿假单胞菌中多重耐药且产ELSBs的菌株为27株,40株鲍曼不动杆菌中多重耐药且产ELSBs的菌株为28株。对多耐药且产ELSBs的菌株通过PCR扩增实验进行的I类整合子存在情况的考察结果显示,40株鲍曼不动杆菌和40株铜绿假单胞菌中I类整合子的阳性率分别为57．5％和55．O％。I类整合子的保守区和可变区PCR扩增与测序分析结果显示,保守区内含有qaeEal-F和sul1-B这两种特征性基因片段,可变区内以长度为0．15、1．00、2．00、2．30kb的基因片段出现频率最高．0．15kb含有保守区内基因结果,其它基因片段依次为aadA、aaeA4、catB8这3种基因盒。结论I类整合子与革兰氏阴性杆菌耐药性的产生有着密切的关系,qaeEal-F和sull一B为I类整合子基因保守区的特征性片段。两者同时出现则可确证该细菌体内含有I类整合子。I类整合子基因可变区内含有aadA、aaeA4、catB8三种出现频率最高的基因盒且长短为0．15kb的基因片段含有保守区的基因结构,这3种基因盒和保守区基因片段的存在是导致细菌间耐药性平行转移的重要因素。     

鲍曼不动杆菌的耐药与多粘菌素临床应用探讨

目的 了解西安市某三甲医院2年来鲍曼不动杆菌的药敏变迁情况,探讨多粘菌素治疗鲍曼不动杆菌的临床应用效果.方法 回顾分析2010年1月～2011年12月西安市某三甲医院细菌室的分离菌株,统计鲍曼不动杆菌的检出率和体外药敏效果.结果 2010年共分离细菌4552株,2011年7269株;鲍曼不动杆菌检出率分别为583株（12.8％）和934株（12.8％）,为分离菌株第二位.多粘菌素B对鲍曼不动杆菌保持高体外活性,2010和2011年敏感率分别为92％和91％.结论 鲍曼不动杆菌临床检出率很高,药敏试验证实对多粘菌素B保持很高体外活性,多粘菌素是临床治疗鲍曼不动杆菌的选择之一.     

人单链白细胞介素12的原核表达和生物学活性鉴定

目的构建含人单链白细胞介素12(hscIL-12)基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达具有活性的hscIL-12。方法 PCR法从质粒pCA13-hscIL-12中扩增hscIL-12基因,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a(+)-hscIL-12,转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集菌液进行蛋白质印迹分析,经镍柱亲和层析(Ni2+-NTA)纯化,体外增殖实验检测其生物学活性。结果 PCR扩增、双酶切及DNA序列测定证实pET28a(+)载体上成功插入了hscIL-12基因片段。表达产物经SDS-PAGE电泳分析,证明其相对分子质量为70×103;蛋白质印记表明重组蛋白具有hscIL-12抗原活性;表达产物纯化、复性后进行体外生物学活性实验表明,该重组蛋白能刺激外周血单核细胞(PBMC)产生IFN-γ。结论 pET28a(+)-hscIL-12原核表达载体的构建和重组hscIL-12蛋白的制备为进一步研究hscIL-12生物学功能和临床应用奠定了基础。     

头孢哌酮/舒巴坦联合阿米卡星对多重耐药鲍曼不动杆菌的疗效分析

目的：探讨头孢哌酮/舒巴坦联合阿米卡星对多重耐药鲍曼不动杆菌的临床疗效。方法方便选取2013年1月—2015年6月80例该院多重耐药鲍曼不动杆菌感染住院患者,按挂号单双数分为观察组、对照组各40例,观察组使用头孢哌酮/舒巴坦联合阿米卡星治疗,对照组仅适用头孢哌酮/舒巴坦,分析标本来源,观察临床疗效和细菌清除率,进行药物敏感性试验,并进行统计分析。结果多重耐药鲍曼不动杆菌感染患者主要来源于重症监护室、外科、呼吸科等,标本以痰液、血液、创面分泌物为主。在该院每年多重耐药鲍曼不动药物敏感性监测报告中,常规使用药物头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星的耐药率均显示最低,最新数据(2014年院内多重耐药鲍曼不动药物敏感性监测报告)中分别为50.20%、54.50%。头孢哌酮/舒巴坦联合阿米卡星治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的有效率为95.0%,较单使用头孢哌酮治疗率85.0%高,差异具有统计学意义,P<0.05。结论头孢哌酮/舒巴坦联合阿米卡星治疗对多重耐药鲍曼不动杆菌感染患者临床有效率高,细菌清除率高,临床遇到多重耐药鲍曼不动杆菌感染患者可优先考虑两者联合用药。     

鲍曼不动杆菌的临床分布及耐药分析

目的：探讨鲍曼不动杆菌的临床分布及其耐药性,为临床防治提供实验依据.方法：采用细菌培养、生化鉴定临床鲍曼不动杆菌,药敏实验分析其耐药性及临床分布特点.结果：从住院患者标本中分离出76株鲍曼不动杆菌,主要在痰液检出63株（83.0％）,脑脊液检出6株（7.9％）.菌株主要分布在重症监护病房（ICU）和外科病房,分别检出37株（48.7％）,和21株（27.6％）.鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦、多黏菌素E和美罗培南等药物敏感;对头孢西丁、头孢呋辛和头孢噻肟等耐药.结论：鲍曼不动杆菌主要引起ICU患者下呼吸道感染,对多种抗生素耐药.     

英山县老年患者机械通气鲍曼不动杆菌感染耐药调查

目的：分析老年患者机械通气鲍曼不动杆菌感染和耐药情况,为本地区老年患者鲍曼不动杆菌感染治疗及预防提供理论依据。方法分析我院重症医学科老年患者机械通气感染鲍曼不动杆菌临床常见抗生素药敏培养结果,对治疗及转归进行评价。结果12个月内入住重症医学科的老年患者下呼吸道分泌物培养出鲍曼不动杆菌共108例,所有菌株对临床常用药物耐药非常严重,药敏结果显示本地区鲍曼不动杆菌对临床常见抗生素耐药率大部分达70.00%以上,对青霉素类和二、三代头孢菌素全部表现为广泛耐药或者全耐药。108例患者中70例治疗结束后随访符合临床治愈,38例在治疗结束后随访临床无效,其中30例患者死亡。结论本地区老年患者感染鲍曼不动杆菌耐药率非常高,临床治疗应根据药敏结果选择适宜抗生素,并采取有效的预防隔离措施。     

耐亚胺培南鲍曼不动杆菌同源性及耐药机制研究

目的调查耐亚胺培南鲍曼不动杆菌在各科室的流行特点,研究其耐药机制。方法收集不同科室分离的耐药菌54株,采用Vitek-2Compact进行药敏实验;采用PFGE分析同源性;PCR及DNA测序检测耐药基因型。结果PFGEA型占77．8％,B型占18．9％。54株菌都携带OXA-66基因,53株菌携带OXA-23基因,41株菌携带16SrRNA甲基化酶annA基因。结论临床科室存在A型耐药菌的克隆播散。产OXA-23型碳青霉烯酶基因及其上游插入序列ISAbaI是其最主要的耐药机制。