白色念珠菌烯醇化酶诱导产生中性粒细胞外网

目的通过重组白色念珠菌烯醇化酶（enolase）,研究其对人中性粒细胞的作用。 方法采用分子克隆法,构建质粒、克隆、表达、纯化白色念珠菌重组enolase,密度梯度离心法提取人中性粒细胞,通过2,7-二氯二氢荧光素二醋酸酯（DCFH-DA）法、Sytox green染色和免疫荧光观察白色念珠菌重组enolase（500 nmol/L）对人中性粒细胞的刺激作用。中性粒细胞加入白色念珠菌SC5314（中性粒细胞∶白色念珠菌= 5∶1）作为阳性对照组（SC5314组）,未加刺激的作为阴性对照组。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）及Tukey′s检验对数据进行统计分析。 结果成功得到重组enolase,分子量为46 kDa。重组enolase可以刺激人中性粒细胞产生细胞内活性氧（ROS）,enolase组与SC5314组产生ROS的量均无明显差异。Sytox green对胞外DNA定量及免疫荧光观察,均显示重组enolase可以刺激人中性粒细胞产生中性粒细胞外网（NETs）。NETs定量结果显示,enolase组[（11.0 ± 2.5）%]与SC5314组[（12.4 ± 2.0）%]在2 h时无明显差异（F = 6.13,P = 0.0886）,在4 h时enolase组[（22.2 ± 2.0）%]显著低于SC5314组[（31.4 ± 3.1）%],差异有统计学意义（F = 9.745,P = 0.0370）。 结论白色念珠菌enolase可以诱导人中性粒细胞形成NETs。     

附着状态对口腔白色念珠菌ALS基因mRNA的影响

目的　比较生物膜和游离状态下,白色念珠菌ALS基因在mRNA水平上的表达差异。方法　一步法 RT-PCR观察白色念珠菌临床分离株和标准菌株,在游离状态和生物膜状态下ALS1和ALS4的mRNA的丰度差异。 结果　白色念珠菌临床分离株在生物膜状态下,ALS1和ALS4的mRNA丰度明显强于游离状态,而标准株在游离状 态和生物膜状态下,ALS1和ALS4的mRNA丰度没有显著性差异。结论　生物膜状态下的白色念珠菌,ALS基因在 转录水平的表达有增强,提示该基因在生物膜形成发展中可能有一定的作用,但其增强的程度在菌株之间可能有 较大的差别。     

饥饿状态下白色念珠菌差异表达基因的研究

目的探讨白色念珠菌饥饿状态的形成机制及差异表达基因。 方法将白色念珠菌（ATCC 10231）诱导进入厌氧饥饿状态,收集进入饥饿状态0、12、24和48 h的白色念珠菌,提取总RNA后采用全基因组表达谱芯片技术分析基因的差异表达。采用t检验对不同时间点的基因表达状况进行统计分析。 结果统计分析显示,白色念珠菌诱导进入饥饿状态过程中,14.45%~ 29.13%的基因表达发生改变（P<0.05）,涉及氨基酸代谢、糖代谢、脂类代谢、核酸代谢和细胞周期等多个通路。上述通路中丙氨酸合成通路、ATP合成基因SDH4、有丝分裂相关基因PRE1以及胞外基质分泌相关基因GCA1等表达降低,RAX2、VPS34等耐药相关基因表达升高。 结论白色念珠菌在诱导进入饥饿状态过程中涉及代谢和增殖水平的基因表达下降,对外界刺激和药物耐受相关基因表达上调,此类改变有助于保持白色念珠菌在饥饿状态的存活力和致病性。     

牙髓间充质干细胞对巨噬细胞极化的调节作用

目的 :明确牙髓间充质干细胞对巨噬细胞极化的调节作用,探索调节作用分子机制。方法 :使用酶消化法获取健康人的牙髓组织,差速贴壁法纯化培养DPSCs(dental pulp stem cells)。使用流式细胞术分析其表面蛋白表达;使用油红O、茜素红S染色,分析其成脂肪、成骨诱导的潜能。转录组测序分析DPSCs和BMSCs基因表达谱的差异,并使用KEGG、String数据库对可能参与初始免疫信号通路的相关基因进行富集分析和蛋白相互作用预测。使用免疫印迹定量分析MYD88及TLR3蛋白在DPSCs和BMSCs中表达水平。在Transwell共培养体系中,将DPSCs和经Poly(I:C)激活的DPSCs分别与巨噬细胞进行共培养,使用流式细胞术分析共培养之后的巨噬细胞CD206、Arg-1的表达水平。结果:纯化培养的DPSCs形态呈成纤维细胞样,表达CD90、CD105、CD73,不表达CD34、CD45、CD11b,经成骨、成脂肪诱导液诱导后,油红O、茜素红S染色均呈阳性反应。转录组测序富集分析发现DPSCs在初始免疫信号通路基因表达水平高于BMSCs,核心基因MYD88、TLR3的蛋白水平也高于BMSCs。使用TLR3通路的激动剂Poly(I:C)激活DPSCs后,发现能够使巨噬细胞表达CD206、Arg-1的水平增加。结论:DPSCs能够促进巨噬细胞向抗炎型的巨噬细胞极化,TLRs信号通路可能是重要的分子途径。     

RPDs基托材料对口腔念珠菌定植的影响

目的：初步研究可摘局部义齿（RPDs）不同基托材料对口腔念珠菌的定植的影响。方法：临床随机选择RPDs修复患者147例。其中树脂基托义齿（A组）58例,钴铬合金铸造基托义齿（B组）63例,纯钛及钛合金铸造基托义齿（C组）26例。吐唾法取样,用CHROMagar培养基鉴定念珠菌菌种。培养基中念珠菌菌落计数为每个样本的念珠菌检出强度。通过统计学方法,比较3组不同基托材料义齿戴用人群念珠菌检出率和检出强度的差异。结果：147例不同基托材料义齿戴用人群中检出的念珠菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌3个菌种。A、B、C组白色念珠菌和非白色念珠菌检出率无显著差异。白色念珠菌的菌落形成单位数,A组显著高于B、C组（P〈0.05）;B组显著高于C组（P〈0.05）。非白色念珠菌间的菌落形成单位数无明显差异。结论：戴不同材料义齿患者口腔除了能检出白色念珠菌,还可检出非白色念珠菌;口腔念珠菌的菌落形成单位数与义齿基托材料密切相关,钛及钛合金基托义齿应为预防义齿性口炎的首选义齿。     

口腔白色念珠菌基因型与扁平苔藓的关系

目的:分析口腔白色念珠菌基因型与口腔扁平苔藓的关系,白色念珠菌致病菌与共生菌基因型的相关性,为临床制定有效防治措施提供依据。方法:采用随机扩增多态性DNA(RAPD)基因分型方法,对46株口腔念珠菌行基因型观察。46株菌分为以下3组,自健康志愿者口腔中所取的9株共生菌为N组;自口腔单纯白色念珠菌感染者口腔中所取的21株致病菌为OC组;口腔扁平苔藓伴发的16株致病菌为LP组。结果:46株念珠菌中,40株被鉴定为白色念珠菌,基因分型显示不同念珠菌有各自独特基因型。OC组与N组白色念珠菌基因型相似度较高。LP组白色念珠菌基因型无集中趋势,与N组比较存在显著差异(P<0.001)。同是致病菌的白色念珠菌,组与组间基因型也存在显著性差别(P<0.001)。结论:(1)RAPD基因分型可将念珠菌区分至菌种水平,也可深入分辨“同种异型”。(2)口腔单纯白色念珠菌感染可能由共生菌菌群失调引起,即由内源性感染引起。(3)扁平苔藓伴发白色念珠菌基因型无集中趋势,提示扁平苔藓伴发白色念珠菌存在外源性感染的可能。(4)不同口腔黏膜病所伴发的白色念珠菌基因型不同。     

鱼腥草素钠对白色念珠菌磷脂酶体外作用的研究

目的：验证鱼腥草素钠体外对白色念珠菌生物膜的抑菌效果,并初步研究其抑菌作用是否为通过影响或干扰毒力因子磷脂酶的表达而实现的。方法：建立白色念珠菌生物膜的体外模型,MTT法计算鱼腥草素钠对白色念珠菌生物膜的抑菌率,然后用RT-PCR方法检测白色念珠菌毒力因子PLB1、PLB2和PLC1受鱼腥草素钠作用后的表达水平的变化。结果：鱼腥草素钠对白色念珠菌生物膜的抑制作用随药物浓度增加而增加。RT-PCR结果表明,毒力因子PLB1、PLB2的表达水平随着药物浓度的梯度增加而降低,在浓度为240mg/L时mRNA的表达水平受到完全抑制,而药物浓度变化对PLC1的表达影响较小。结论：鱼腥草素钠体外对白色念珠菌生物膜有一定的抑制作用,并对本实验所选毒力因子PLB1、PLB2的表达过程明显产生了抑制作用。     

不同培养基对白念珠菌生物被膜产生法尼醇的影响

目的:检测不同培养基对白念珠菌生物被膜产生法尼醇的影响。方法:白念珠菌标准株SC5314分别接种到含有RP-MI1640、YPD、RPMI1640+10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)培养基的培养皿中,形成白念珠菌生物被膜。在接种1.5～48h内,使用气相色谱-质谱联用法检测法尼醇产生的情况。结果:在RPMI1640、YPD培养基中,法尼醇分泌量随生物被膜的成熟而逐渐增加,在生物被膜形成后期至成熟期达到高峰;在RPMI1640+10%FCS培养基中,法尼醇的产生在48h内呈增长趋势。12h时,YPD培养基中法尼醇的分泌量高于其它两组(P<0.05);48h时,RPMI1640+10%FCS培养基中法尼醇分泌量最高(P<0.05)。结论:白念珠菌生物被膜法尼醇分泌量与培养基种类存在相关性。     

配戴可摘义齿对口腔白色念珠菌的检出及基因分型的影响

目的：研究配戴活动义齿患者口腔中自色念珠菌的检出及基因分型。方法：研究对象共56例,分两组：实验组30例和对照组26例。含漱液浓缩法取样,CHROMagar Candida鉴定培养基分离鉴定白色念珠菌,PCR（聚合酶链式反应polymerase chain reaction,PCR）方法鉴定并进行基因分型,PCR产物经测序验证。结果：实验组与对照组白色念珠菌的基因型均以A型为主,其检出率分别为46．67％,7．69％,两组间差异有显著性。年龄大于60岁的患者及配戴义齿时间长于10年的患者,白色念珠菌及其它念珠菌的检出率显著增高。结论：配戴活动义齿影响口腔白色念珠菌的检出。     

基于PADTM Plus的光活化消毒技术杀灭白色念珠菌的体外实验研究

目的 研究基于PAD^TM Plus的光活化消毒技术(photo-activated disinfection,PAD)体外杀灭白色念珠菌的效果。方法 选取白色念珠菌标准株SC5314配制菌悬液。光活化消毒仪输出功率为750 mW，光敏剂为甲苯胺蓝(Toluidine Blue O, TBO)溶液，有效浓度0.75 mg/mL，光源为波长635 nm的LED红光。实验分为空白对照组(P-L-)、单纯光敏剂孵育60 s组(P+T1+L-)、单纯光敏剂孵育120 s组(P+T2+L-)、单纯光照组(P-L+)、PAD孵育60 s组(P+T1+L+)、PAD孵育120 s组(P+T2+L+)，光照时间均为60s。根据不同分组的处理方法对白色念珠菌悬液进行处理后接种于ChROMagar培养基，并于37℃环境下培养48 h，菌落计数以每毫升菌落形成单位(CFU/mL)表示。采用统计学方法分析结果。结果 P-L-组、P+T1+L-组、P+T2+L-组与P-L+组的对比其菌落对数的差异均无统计学意义(P>0.05)，而P+T1+L+组和P+T2+L+组与P-L-组的对比差异...     

白念珠菌生物被膜耐药株麦角甾醇检测的方法学研究

目的：分别采用高效液相色谱法和气相色谱质谱联用法测定白念珠菌麦角甾醇含量,并对这两种方法进行比较。方法：采用浓度梯度递增法诱导白念珠菌耐药株,采用KONT真菌显色MIC药敏系统鉴定耐药性。构建6、12、24h生物被膜,采用高效液相色谱法和气相色谱质谱联用法测定麦角甾醇含量。结果：高效液相色谱法检测出麦角甾醇含量,最低检出浓度为0.05mg/L,而气相色谱质谱联用法未检测出麦角甾醇含量。结论：高效液相色谱法能准确测定白念珠菌麦角甾醇含量。与气相色谱质谱联用法比较,高效液相色谱法简单、高效和可靠。     

白色念珠菌人工诱导耐药模型的建立及鉴定方法的研究

目的：利用氟康唑人工诱导构建白色念珠菌耐药模型。方法：采用梯度浓度递增法体外氟康唑诱导白色念珠菌耐药株,采用KONT真菌显色MIC药敏系统以及药敏纸片扩散法两种方法对构建形成的耐药菌株进行检测。结果：氟康唑人工诱导白色念珠菌耐药株构建形成,经微量稀释法鉴定最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）≥64μg/ml。KONT真菌显色MIC药敏系统及药敏纸片扩散法判定结果符合率达95%,P〉0.05,无统计学差异。结论：采用梯度浓度递增法体外诱导白色念珠菌耐药模型可行,且KONT真菌显色MIC药敏系统与药敏纸片扩散法对耐药株的鉴定结果一致性较好。     

IL-1alpha, IL-1ra and IL-8 are differentially induced by Candida in experimental oral candidiasis

OBJECTIVE: To investigate the expression of interleukin-1alpha (IL-1alpha), IL-1ra and IL-8 by the oral epithelium challenged by various Candida species. MATERIALS AND METHODS: In vitro candidiasis was induced by C. albicans wild type SC5314, its EFG1, CPH1 and secretory aspartyl proteinase (SAP) mutants and, ATCC isolates of C. albicans, C. tropicalis and C. dubliniensis using a reconstituted human oral epithelium (RHOE) model. IL-1alpha, IL-1ra and IL-8 levels in culture media were quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay at 12, 24 and 48 h. Fungal invasion and IL-1ra expression in RHOE were detected by periodic acid-Schiff staining and immunohistochemistry. RESULTS: Overall, the invasive Candida induced relatively higher levels of IL-1alpha, IL-1ra and IL-8 in the culture media than the noninvasive isolates. IL-1alpha and IL-1ra levels induced by Candida with hyphal invasion were significantly higher (P < 0.05) than those induced by the isolates without hyphal invasion at 12, 24 and 48 h. Candida albicans SC5314 induced IL-1ra expression in RHOE at 12 and 24 h but not at 48 h consistent with its hyphal invasion; while the noninvasive mutants and non-albicans Candida induced IL-1ra expression at 48 h. CONCLUSIONS: The cytokine expression profiles in experimental oral candidiasis may be associated with the invasive potential of Candida.     

Oral epithelium-Candida glabrata interactions in vitro

BACKGROUND: Oropharyngeal candidiasis is a common opportunistic infection and Candida glabrata is the second or third most frequently isolated species from oropharyngeal candidiasis lesions, after Candida albicans. The aim of this study was to study the cytokine-inducing and cell-damaging potential of C. glabrata in oral epithelial cells and compare this to C. albicans. METHODS: Oral epithelial cell lines and primary gingival epithelial cells were cocultured with C. glabrata strains GDH2269 and 94-11 or C. albicans strains SC5314 and ATCC28366. Supernatants were analysed for the presence of interleukin-1alpha (IL-1alpha), IL-8 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) by enzyme-linked immunosorbent assay. The cytotoxity of different strains was determined using the CytoTox-96 assay. RESULTS: Compared to C. albicans, C. glabrata induced different proinflammatory cytokine responses in oral epithelial cells; a high level of GM-CSF induction was only detected in C. glabrata-infected cells and not in C. albicans-infected cells, regardless of the origin of these cells (cell lines or primary cells) or the strain used. Like C. albicans, C. glabrata induced an IL-1alpha response by oral epithelial cells, but this response was both strain-dependent and epithelial cell origin-dependent. Unlike C. albicans, C. glabrata failed to induce a strong IL-8 response in any of the cell systems studied. Finally, in these studies C. glabrata showed lower cytotoxicity than C. albicans. CONCLUSIONS: C. glabrata is less cytotoxic than C. albicans and induces different proinflammatory cytokine responses in oral epithelial cells.     

脐静脉内皮细胞与牙本质浸提液诱导的牙髓干细胞共培养成血管的研究

目的:探讨共培养牙本质浸提液(dentin extract, DE)诱导的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)和人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)在成血管方向的潜能。方法:制备人牙本质浸提液,分别诱导培养hDPSCs 7 d和14 d后,Real-time PCR和Western blot检测诱导后hDPSCs中牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的表达;血管形成实验共分为5组,分别是:HUVECs组、DE诱导后的hDPSCs组以及按5∶1、5∶5、5∶10比例共培养HUVECs和诱导后hDPSCs组,分别在第3、6、9h检测各组小管形成的相对长度和节点数目。结果:DE诱导的hDPSCs 在mRNA和蛋白水平上表达的DSP、DSPP和DMP-1显著提高(P＜0.05);体外小管形成实验结果示共培养组较早形成稳定的网状结构,在3 h时,HUVEc与诱导后hDPSCs比例为5∶1组形成的小管相对长度和相对分支点数明显高于HUVECs组(P＜0.05),而5∶5组和5∶10组低于HUVECs组(P＜0.05)。结论:牙本质浸提液诱导后的hDPSCs与HUVECs按一定比例共培养可促进血管结构的形成。     

小鼠对口腔念珠菌感染的体液免疫应答

目的建立敏感株和阻抗株小鼠口腔念珠菌感染模型，揭示两种小鼠对口腔念珠菌感染的体液免疫反应。方法雌性BALB／c和CBA／CaH小鼠及白色念珠菌3630用于本研究。1×10^8念珠菌／20μl接种于小鼠的口腔黏膜，建立口腔念珠菌感染模型；SDS—PAGE和Western—Blotting用于检测血清抗体。结果念珠菌敏感株鼠CBA／CaH的口腔感染比阻抗株鼠BALB／c严重（P〈0．05）；CBA／CaH小鼠在口腔免疫后5周产生了IgG1、IgG2a、IgM，而BALB／c小鼠仅产生IgG1。结论念珠菌敏感鼠CBA／CaH的口腔念珠菌感染比念珠菌阻抗鼠BALB／c感染更为严重；抗白色念珠菌抗体IgM可能对宿主的口腔念珠菌感染起保护作用。     

MyD88 is essential for alveolar bone loss induced by Aggregatibacter actinomycetemcomitans lipopolysaccharide in mice

Aggregatibacter actinomycetemcomitans is a Gram‐negative bacteria highly associated with localized aggressive periodontitis. The recognition of microbial factors, such as lipopolysaccharide from A. actinomycetemcomitans (_AaLPS), in the oral environment is made mainly by surface receptors known as Toll‐like receptors (TLR). TLR4 is the major LPS receptor. This interaction leads to the production of inflammatory cytokines by myeloid differentiation primary‐response protein 88 (MyD88) ‐dependent and ‐independent pathways, which may involve the adaptor Toll/interleukin‐1 receptor‐domain‐containing adaptor inducing interferon‐β (TRIF). The aim of this study was to assess the involvement of MyD88 in alveolar bone loss induced by _AaLPS in mice. C57BL6/J wild‐type (WT) mice, MyD88, TRIF or TRIF/MyD88 knockout mice received 10 injections of _AaLPS strain FDC Y4 (5 μg in 3 μl), in the palatal gingival tissue of the right first molar, every 48 h. Phosphate‐buffered saline was injected in the opposite side and used as control. Animals were sacrificed 24 h after the 10th injection and the maxillae were removed for macroscopic and biochemical analyses. The injections of _AaLPS induced significant alveolar bone loss in WT mice. In the absence of MyD88 or TRIF/MyD88 no bone loss induced by _AaLPS was observed. In contrast, responses in TRIF^?/? mice were similar to those in WT mice. Diminished bone loss in the absence of MyD88 was associated with fewer TRAP‐positive cells and increased expression of osteoblast markers, RUNX2 and osteopontin. There was also reduced tumor necrosis factor‐α production in MyD88^?/? mice. There was less osteoclast differentiation of hematopoietic bone marrow cells from MyD88^?/? mice after _AaLPS stimulation. Hence, the signaling through MyD88 is pivotal for _AaLPS‐induced osteoclast formation and alveolar bone loss.     

白假丝酵母菌药物流出泵基因在生物膜中表达的动态研究

目的动态观察白假丝酵母菌生物膜形成过程中耐药性产生相关的药物流出泵基因的表达和耐药性的变化情况,并分析该类基因的表达与生物膜耐药性产生的相关性。方法利用人工口腔恒化器形成白假丝酵母菌生物膜结构,收集生物膜形成不同阶段的生物膜态菌细胞,半定量RT- PCR技术分析菌细胞mRNA在生物膜成熟过程中的动态变化;96孔板XTT减低法获得生物膜耐药性的变化情况。结果耐药性随着生物膜的成熟不断增强;与早期生物膜相比,成熟生物膜菌株的药物流出泵基因CDR1表达上调,而MDR1基因的表达在生物膜的整个成熟过程中基本维持不变。结论生物膜成熟程度与耐药性增强有明显正相关性;药物流出泵基因的表达上调与生物膜耐药性的产生有一定关系但改变不一致;在生物膜成熟过程中,CDR1表达水平改变活跃,而MDR1基因相对稳定。