miR-150通过调节c-Myb抑制人慢性髓系白血病细胞系K562增殖

目的探讨miR-150在人慢性髓系白血病细胞系K562中的功能和作用机制。方法以临床收集的慢性髓系白血病患者、和健康人外周血中的单个核细胞为实验材料;实时定量PCR检测miR-150和c-Myb mRNA的表达水平;使用miR-150模拟物转染K562细胞;通过CCK-8法检测K562细胞增殖;通过流式细胞计量术检测K562细胞周期;荧光素酶报告基因实验结合Western blot检测miR-150对其下游靶基因c-Myb的调控作用。结果慢性髓系白血病患者与健康人相比,miR-150表达降低,而c-Myb表达升高;过量表达miR-150可以抑制K562细胞的增殖(P0.05),同时,阻滞K562细胞周期的运行;miR-150可以下调靶基因c-Myb的表达。结论 miR-150在慢性髓系白血病中表达下调,其作用机制是通过抑制癌基因c-Myb的表达抑制白血病细胞的增殖。     

氨基甾体H42649对K562白血病细胞的抑制增殖和诱导分化作用

目的观察氨基甾体H42649对人慢性粒细胞白血病K562细胞系的抑制增殖和诱导分化作用。方法采用液体培养实验,MTT实验,集落培养实验观察10-8～10-4mol/L浓度的H42649对K562细胞增殖能力的影响;采用Wright-Giemsa染色,联苯胺染色和流式细胞术评价10-6mol/L浓度的H42649对K562细胞的诱导分化作用。结果不同浓度的H42649连续作用K562细胞1～5 d后,细胞计数和集落计数明显减少;第5 d处理组的MTT值显著低于对照组,并呈剂量依赖关系;10-6mol/L浓度的H42649对K562细胞作用5d后,联苯胺染色A值升高(P<0.01),形态学观察其趋向成熟分化,流式细胞术检测药物处理4 d后K562细胞膜上CD71表面标记表达阳性率为84%。结论氨基甾体H42649能显著抑制K562细胞的增殖并诱导其向红系分化,提示该药可作为一种新型慢粒白血病细胞的诱导分化剂。     

siRNA沉默Ikaros基因对K562细胞中γ珠蛋白表达的影响

目的:通过siRNA干扰靶基因Ikaros,观察人红白血病细胞株K562细胞中γ珠蛋白的表达变化。方法:设计合成三条针对Ikaros的siRNA寡核苷酸序列,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染siRNA至K562细胞,采用RT-PCR方法筛选出最佳siRNA序列和最佳干扰时间。运用Real-time PCR和Western blotting技术分别检测siRNA沉默Ikaros后K562细胞Ikaros和γ珠蛋白mRNA及蛋白的表达水平,应用联苯胺染色法检测siRNA沉默Ikaros后K562细胞内血红蛋白(Hb)含量。结果:筛选试验表明siRNA3的转染效率最高,达58.7%,siRNA3对Ikaros基因抑制率最高(86.7%),其最佳干扰时间为72h。应用siRNA3沉默Ikaros基因可以上调γ珠蛋白mRNA和蛋白的表达水平,增加K562细胞内Hb含量。结论:siRNA3沉默Ikaros上调γ珠蛋白mRNA和蛋白表达,可能成为治疗重型β-地中海贫血的一种新策略。     

K562细胞总RNA转染对人树突状细胞抗原提呈、成熟及功能影响的初步研究

探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性CTL,为DC疫苗的临床应用提供理论基础。自健康人浓缩白细胞制剂分离有黏附特性的单核细胞,经GM-CSF、IL-4培养5d后,获得未成熟的DC(imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提后即时以及转染24h后的DC内RNA进行RT-PCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,流式细胞仪检测,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。结果显示,RT-PCR检测表明:DC经K562细胞总RNA转染后,细胞内出现Bcr-Abl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot实验表明:转染24h后,开始表达p210特征性蛋白。与对照组相比,转染K562细胞总RNA的DC,在24h后CD80、CD83、CD86、HLA-DR等表面标志均不同程度表达增高,并可促进T细胞对K562的杀伤活性。该研究从多方面角度说明应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗的可行性,提示改良的DC疫苗抗肿瘤可能的应用前景。     

下调RALA表达抑制人白血病K562细胞迁移和侵袭

目的 研究小干扰RNA(siRNA)抑制v-ral 白血病致病因子RALA基因表达对人白血病K562细胞迁移和侵袭的影响.方法 利用LipofectamineTM 2000将化学合成的RALA siRNA转染体外培养的K562细胞,Real-time PCR检测细胞内RALA mRNA的表达水平;Western印迹检测...     

KLF4过表达抑制人白血病K562细胞系的增殖及迁移

目的探索人锌指转录因子Krüppel样因子4(KLF4)过表达对人慢性髓系白血病细胞K562增殖及迁移能力的影响。方法设稳定过表达KLF4的白血病K562细胞系作为实验组(命名为K562-KLF4细胞),空白K562细胞及空质粒转染的K562细胞(命名为K562-C1细胞)作为对照组。实时荧光定量PCR检测各组细胞KLF4mRNA的表达含量;Western blot检测各组细胞KLF4的蛋白相对表达含量;MTS法检测各组细胞的增殖水平;Transwell检测各组细胞的迁移能力。结果 K562-KLF4细胞KLF4 mRNA的相对表达量比2个对照组明显增高(P0.05);与对照组相比,K562-KLF4细胞KLF4蛋白相对表达含量明显增加(P0.05),其过表达率为77.78%;K562-KLF4细胞增殖和迁移能力明显被抑制(P0.05)。结论 KLF4过表达能抑制K562细胞的增殖及迁移能力。     

Pre-miR-10a重组腺病毒载体对K562细胞增殖的抑制作用

目的:观察在K562细胞高表达miR-10a对细胞增殖及凋亡的影响。方法:用pAd-pre-miR-10a重组腺病毒载体感染K562细胞,采用RT-PCR检测感染后K562细胞中miR-10a和bcr/abl融合基因的表达水平,Western blot法检测BCR/ABL融合蛋白表达水平,MTT、流式细胞术(FCM)分别检测感染后K562细胞的增殖及凋亡。结果:与对照组相比,K562细胞在转染pAd-pre-miR-10a重组腺病毒载体后,其miR-10a表达水平明显升高、bcr/abl融合基因水平显著降低;BCR/ABL融合蛋白表达明显下调、K562细胞增殖活力被抑制、细胞凋亡增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:pAd-pre-miR-10a重组腺病毒载体能明显抑制K562细胞的增殖、促进细胞凋亡。     

中性粒细胞弹性蛋白酶的过表达促进K562细胞增殖并抑制其凋亡

目的利用Ad Easy系统构建携带人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)基因的重组腺病毒表达质粒,并感染K562细胞,观察其对K562细胞增殖和凋亡的影响。方法以急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株HL-60的RNA为模板,经反转录PCR得到NE基因的编码区并克隆入穿梭载体p Ad Track-CMV,得到p Ad-NE,经HindⅢ、EcoRⅤ酶切鉴定和测序正确后,将其转化入p Ad Easy-1-BJ5183进行同源重组,得到重组子Ad-NE,经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞进行包装。14 d之后收获原代病毒,经5轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。感染K562细胞后,荧光显微镜初步观察感染效率,同时用流式细胞术检测感染效率;Western blot法进一步鉴定NE是否表达上调;CCK-8法测定细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期变化。结果酶切鉴定及测序结果表明重组穿梭质粒p Ad-NE构建成功;酶切鉴定显示同源重组成功,得到重组子Ad-NE;荧光显微镜表明病毒包装成功;经过5轮扩增后,病毒滴度达到1.64×1012pfu/m L;感染K562细胞后,荧光显微镜观察感染效率达80%左右;Western blot法检测到NE表达上调;CCK-8实验显示NE表达上调后K562细胞增殖能力增强;流式细胞术显示S期细胞明显增多并且细胞凋亡减少。结论过表达NE可促进K562细胞增殖并抑制其凋亡。     

miR-320调节人慢性髓系白血病细胞系K562的增殖

目的探讨miR-320对人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和细胞周期的影响。方法采用正常人及初诊的慢性髓系白血病患者外周血病单个核细胞,用实时定量PCR检测miR-320和β-catenin mRNA的表达;用miR-320模拟物转染K562细胞,CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞计量术检测细胞周期;双荧光报告基因试验和Western blot检测β-catenin mRNA表达;实时定量PCR检测miR-320模拟物对Wnt/β-catenin信号通路下游基因的转录。结果 miR-320在慢性髓系白血病患者中的表达水平显著低于正常人,而β-catenin表达水平显著高于正常人(P0.05);过表达miR-320可以抑制K562细胞的增殖(P0.05)和细胞周期的运行;miR-320可抑制靶基因β-catenin的表达,进而抑制Wnt/β-catenin信号通路下游基因c-Myc、cyclin D、VEGF和Cox-2 mRNA的表达(P0.05)。结论 miR-320通过调节β-catenin的表达,在慢性髓系白血病中发挥抑癌功能。     

BCR-ABL SH3-T79Y突变体重组腺病毒载体的构建及促进白血病K562/G01细胞凋亡

目的探讨构建BCR-ABL SH3-T79Y突变体(简称SH3-T79Y突变体)的重组腺病毒载体及其对白血病耐药细胞株K562/G01细胞凋亡的影响。方法以p Mig210质粒为模板,用重叠延伸PCR扩增SH3-T79Y突变体片段,将其克隆入重组腺病毒载体,通过鉴定、包装、扩增后得到含SH3-T79Y突变体的重组腺病毒。将重组腺病毒感染白血病K562/G01细胞株,测定其感染效率,瑞氏染色检查细胞形态学,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测BCR-ABL、Crk L磷酸化及总蛋白水平。结果重组腺病毒载体构建成功。SH3-T79Y突变体转染K562/G01细胞株72 h效率大于80%,可见明显的凋亡小体、核聚集等凋亡现象,凋亡率为32.46%,较对照组显著增加(P0.05);明显抑制BCR-ABL和Crk L的磷酸化水平,降低BCR-ABL总蛋白表达(P0.05)。结论成功构建SH3-T79Y突变体重组腺病毒载体,并证实其通过抑制BCR-ABL及底物Crk L磷酸化水平促进K562/G01细胞凋亡。     

舟山眼镜蛇细胞毒素1对K562细胞的抑制作用

目的: 研究舟山眼镜蛇细胞毒素1(CTX1)对人慢性粒细胞白血病细胞系K562的抑制作用。方法: 应用MTS方法和细胞计数法分别检测不同浓度CTX1作用K562后的细胞相对活力和细胞数;PI染色后用倒置荧光显微镜观察活细胞培养体系中K562细胞死亡情况;流式细胞术检测Annexin V-FITC和PI双染色后细胞凋亡情况。结果: 不同浓度的CTX1(2、5、10 mg/L)作用于K562细胞24 h,细胞相对活力分别为(90.50±3.07)%、(58.33±3.08)%和(27.43±1.99)%(与阴性对照组相比,下同,P<0.05),作用24 h时CTX1对K562细胞的半数抑制浓度为5.77 mg/L。CTX1(8 mg/L)作用于K562 6 h、12 h、24 h,细胞数分别占对照组的(85.01±3.54)%、(56.65±3.59)%和(43.24±4.15)%,P<0.05。随CTX1浓度增加和作用时间延长,荧光显微镜下观察到被PI染色的细胞数逐渐增多。CTX1(8 mg/L)作用于K562细胞6 h、12 h、24 h,细胞坏死率分别为(0.73±0.06)%、(13.90±0.46)%和(23.33±0.86)%;晚期凋亡率分别为(16.27±0.21)%、(26.90±1.23)%和(18.77±0.81)%。结论: CTX1对K562细胞有明显抑制作用,主要引起K562细胞晚期凋亡和坏死。     

K562细胞经氯化高铁血红素诱导后分化相关基因的筛选

目的 研究K562细胞经氯化高铁血红素（Hemin）诱导后在cDNA分子水平上的表达差异。方法 用限制性显示（RD－PCR）方法寻找K562细胞在经Hemin诱导后的cDNA差异表达片段。结果 筛选到差异表达片段4条,并进行了序列测定与同源性分析。结论 K562细胞分化是多基因参与的结果,这些分化相关基因的共同作用使K562细胞向良性方向分化。     

低氧下K562细胞向红系分化进程中GATA-1与miR-451a表达的相关性研究

目的:探讨低氧下人慢性髓细胞性白血病K562细胞向红系分化进程中GATA结合蛋白1(GATA binding protein-1,GATA-1)与微小RNA-451a(microRNA-451a,miR-451a)表达的相关性。方法:将K562细胞分为常氧组和低氧(1%O₂)组,经40μmol/L氯化血红素分别诱导分化至48和72 h。RT-qPCR检测γ-珠蛋白(γ-globin)的mRNA表达,联苯胺染色观察细胞血红蛋白生成情况,流式细胞术检测CD235a的表达水平,验证K562细胞红系分化模型是否复制成功。在K562细胞向红系分化的不同时点,采用Western blot检测两组细胞GATA-1的蛋白表达情况;采用RT-qPCR检测两组细胞GATA-1 mRNA和miR-451a的表达水平并进行相关性分析。检测GATA-1过表达组、干扰组和阴性对照组K562细胞的红系分化指标,同时采用瑞氏-吉姆萨染色法分析上述组别细胞形态学的变化,明确GATA-1过表达和抑制后K562细胞的红系分化情况。RT-qPCR检测GATA-1过表达和抑制后miR-451a的表达变化。...     

人类红白血病细胞株K562细胞粘弹性的实验研究

本文利用微管吸吮技术研究了人类红白血病细胞株Ｋ５６２细胞的粘弹性,并与高低两种浓度苦参碱作用后的Ｋ５６２细胞粘弹性进行了比较。结果表明：Ｋ５６２细胞的三个粘弹性参数,Ｋ１,Ｋ２,和μ比低浓度苦参碱处理后的粘弹性参数均高,但又显著低于高浓度苦参碱处理后的粘弹性参数。     

慢病毒介导RNA干扰血管内皮生长因子基因增强K562细胞对STI571敏感性

目的： 探讨慢病毒载体介导RNA干扰（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响。 方法： 构建靶向VEGF基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,与慢病毒包装质粒通过脂质体转染至293T细胞,包装产生的病毒液感染K562细胞。采用实时荧光定量PCR、Western blotting、ELISA等方法检测RNAi对K562细胞VEGF mRNA和蛋白表达的影响;台盼蓝拒染法和MTT法分析转导VEGF-shRNA对K562细胞增殖的影响;流式细胞术检测经STI571(甲磺酸伊马替尼)作用后细胞凋亡变化情况。 结果： 构建VEGF基因shRNA慢病毒载体(pRNAT-shRNA),并成功将其导入K562细胞。与K562和K562-con（转导空载体）组细胞相比,转导pRNAT-shRNA的K562-shVEGF细胞VEGF mRNA和蛋白表达均显著下降;生长曲线提示K562-shVEGF细胞增殖速度减慢;在STI571作用下,K562-shVEGF细胞凋亡率较K562和K562 -con组细胞明显增高(P<0.05)。结论： 慢病毒载体介导的VEGF基因RNA干扰可有效抑制K562细胞增殖,并能够增强细胞对STI571的敏感性。     

生长抑素对人红白血病K562细胞的抑制作用

目的　研究生长抑素对人红白血病K5 6 2细胞的抑制作用。　方法　采用 8肽生长抑素———奥曲肽(octreotide ,SMSZOL 1995 ,SMS)在体外作用于K5 6 2细胞 ,经光镜、电镜观察、3H TdR掺入法和TdT缺口末端标记(TUNEL)技术检测K5 6 2细胞增殖、凋亡的变化。　结果　光镜下观察到 ,加SMS组培养 72h与空白对照组比较 ,细胞碎片增多 ;电镜下可见 ,SMS处理组中部分细胞核染色质靠核膜边集 ,呈块状或新月形 ,部分细胞胞浆中见核碎裂团块与空泡 ,线粒体基质深染、空泡样变和髓样变 ;3H TdR掺入法显示 ,SMS呈浓度依赖性地抑制K5 6 2细胞增殖 ,抑制范围为 2 0 %～ 5 0 % ,以 10 - 6 mol L最有效。在 10 - 1 0 ～ 10 - 6 mol L范围内 ,与对照组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ;TUNEL检测见核深染的阳性细胞 ,10 - 6 mol L组与对照组比较 ,凋亡细胞明显增多 (P <0 0 1)。　结论　生长抑素可抑制K5 6 2细胞增殖 ,诱导凋亡。     

单核细胞影响NK细胞抗K562细胞活性的实验研究

目的探讨单核细胞(MO)呼吸爆发过程中产生的反应性氮代谢物(RNM)、反应性氧代谢物(ROM)的情况及其对NK细胞抗K562细胞活性的影响。方法在NK+K562混合细胞培养体系中,观察加入MO或/和IL-2/PHA前后RNM、ROM产量、KIR及TNF-β、IFN-γ产量的相应变化。再观察加入二氢氯组胺、硫普罗宁后上述各指标的变化情况。结果①在NK+K562混合培养体系中,加入IL-2/PHA后,KIR逐渐升高;当按E/MO=10/2、10/5、10/10比例加入MO后,RNM、ROM产量随着MO数量的增加而增加,而TNF-β、IFN-γ的产量和KIR反而降低。对K562细胞数量作偏相关分析,RNM与KIR的负相关系数大于ROM。②加入药物后,ROM产量明显下降,KIR和TNF-β、IFN-γ产量明显升高,硫普罗宁还降低RNM的产量,但二氢氯组胺无效。结论①MO可通过产生ROM、RNM降低NK细胞的活性,抑制NK细胞抗K562细胞效应;②RNM对NK细胞的影响可能比ROM更强。③硫普罗宁通过清除ROM、RNM,可逆转MO对NK细胞的抑制作用。     

苦瓜蛋白诱导K562细胞凋亡及其对Bcl-2、PCNA蛋白表达的影响

目的：观察苦瓜蛋白是否具有诱导K562细胞凋亡的生物学活性，探讨苦瓜蛋白对K562细胞Bcl-2及PCNA表达水平的影响及其作用的分子机制。方法：以一定浓度的苦瓜蛋白处理K562细胞12～72小时，CCK-8检测其对细胞生长的影响；流式细胞术（AnnexinV）、细胞形态学（光镜及电镜）等方法检测细胞凋亡；同时应用流式细胞术检测Bcl-2及PCNA蛋白表达的变化。结果：苦瓜蛋白对K562细胞生长具有明显的抑制作用；流式细胞术及形态学观察（光镜及电镜）证实一定作用浓度的苦瓜蛋白可诱导K562细胞发生明显的细胞凋亡，且随着作用时间的延长细胞凋亡率逐渐升高。苦瓜蛋白处理组K562细胞中Bcl-2及PCNA蛋白的表达分别为0．33％和98．36％，对照组分别为74．03％和97．63％。结论：苦瓜蛋白对K562细胞生长具有明显抑制作用，其作用主要通过诱导K562细胞产生细胞凋亡．而不是抑制细胞增殖。苦瓜蛋白诱导K562细胞凋亡过程中，Bcl-2蛋白表达的下调对调控细胞凋亡有重要作用。     

SU11248诱导K562白血病细胞凋亡的分子机制研究

目的:研究SU11248(舒尼替尼)诱导慢性骨髓性白血病K562细胞凋亡的分子机制。方法:采用CCK-8比色检测SU11248对K562细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测K562细胞周期变化;间接免疫荧光检测凋亡相关蛋白的表达及定位;免疫印迹检测凋亡相关蛋白的表达变化。结果:CCK-8比色显示SU11248可明显抑制K562细胞增殖(P<0.05),呈现剂量和时间依赖性。FCM显示该药可阻滞K562细胞于G0/G1期。间接免疫荧光染色可见SU11248组细胞色素C(Cyto C)在胞质中呈弥散或粗块状分布,而p53、p73及NF-κB p65均主要定位于胞质,较对照组表达差异不明显。免疫印迹显示,随时间延长,SU11248组较对照组Bcl-2表达呈下降趋势,Bax和Cyto C表达呈增加趋势,同时有Caspase-9和Caspase-3的激活,而p53、p73及NF-κB p65表达变化不明显。结论:SU11248可通过阻滞细胞周期进程及激活内源性线粒体凋亡通路诱导K562细胞调亡。     

血管内皮生长因子基因反义核酸体外抑制K562细胞生长及机理研究

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸抑制K562细胞生长的机理;以及反义药物的量效和时效关系,揭示VEGF基因新的功能。方法:用反义核酸X7,20-mer,全硫代修饰;以脂质体介导进行转染,细胞培养72h,用MTT法计算细胞生长抑制率,采用台盼蓝拒染法每24h观察细胞存活情况并计数,用Giemsa染色观测细胞形态学改变,用流式细胞仪检测细胞凋亡百分数。结果:反义药物对K562细胞生长有明显抑制作用,呈剂量依赖关系,并且下调VEGF蛋白的表达,反义药物对K562细胞的凋亡无影响。结论:VEGF反义药物抑制K562细胞生长的机理是抑制细胞增殖,而不是促进细胞凋亡,内源性VEGF蛋白具有促进K562细胞增殖的功能。