人成熟卵母细胞玻璃化冷冻技术的临床应用

目的探讨玻璃化冷冻技术应用于人成熟卵母细胞冷冻保存的临床效果。方法使用开放式载体cryotop进行人成熟卵母细胞的玻璃化冻存,对10例患者的冷冻卵子复苏后进行卵母细胞浆内单精子（ICSI）注射后行胚胎移植,观察复苏卵母细胞受精、卵裂、胚胎发育及临床妊娠情况。结果 10例患者共86枚玻璃化冻存的成熟卵母细胞复苏后77枚存活,69枚正常受精,获得65枚胚胎,共移植17枚胚胎,3例患者获临床妊娠,其中2例双胎妊娠。结论玻璃化冷冻技术是有效地保存人成熟卵母细胞的方法,有一定的临床应用价值。     

玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞和颗粒细胞的影响

目的探讨玻璃化冷冻法保存小鼠卵巢组织对卵泡内卵母细胞和颗粒细胞的影响。方法分别应用两种玻璃化冷冻方案(ED20和EE40)冷冻小鼠卵巢组织,常规组织学检测新鲜和复苏卵巢组织内卵泡形态,同时应用TUNEL方法观察冻融前后卵泡内卵母细胞和颗粒细胞凋亡情况。结果ED20组和EE40组卵泡存活率分别为78.99±5.99%和71.50±5.81%,明显低于新鲜卵巢组织。冻融组织卵泡凋亡率较冷冻前显著升高。ED20组、EE40组和新鲜对照组颗粒细胞凋亡的卵泡比例分别为8.30±2.14%、11.98±2.34%和4.95±1.62%,差异有显著性;而冷冻前后卵母细胞凋亡的卵泡比例无明显差异。结论玻璃化冻融过程对小鼠卵泡中颗粒细胞的损伤较大,而对卵母细胞的影响较小。     

应用玻璃化冷冻技术保存人未成熟卵母细胞的研究

目的利用玻璃化冷冻保存技术合理利用常规促排卵周期获得的未成熟卵母细胞。方法1．对注射hCG后38h、43h、60h获得GV期卵母细胞进行玻璃化冷冻保存,冻融后的未成熟卵母细胞行体外成熟培养（IVM）,用ICSI技术对获得的成熟卵母细胞完成授精,并体外胚胎培养至囊胚期。比较各组间的冻融存活率、体外成熟率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。2．对GV卵分别行先玻璃化冻融后IVM和先IVM后玻璃化冻融,比较它们的冻融存活率、体外成熟率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果1．38h与43h卵龄GV卵在各项指标比较上没有差异,60h卵与前2组有相似的冻融存活率,但在体外成熟率、受精率和卵裂率上较前2组出现明显下降趋势。3组均无囊胚形成。2．先玻璃化冻融后IVM和先IVM后玻璃化冻融在未成熟卵母细胞的利用率上没有差异。结论1．冷冻卵龄较短的GV期卵母细胞能获得更好的冷冻保存效果。2．玻璃化冻融和IVM先后不影响未成熟卵母细胞的利用。     

玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响

目的 探讨玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响.方法以小鼠MⅡ期卵母细胞为模型,将未经冷冻直接进行培养的卵母细胞设为对照组,将经玻璃化冻融后再进行培养的卵母细胞设为试验组,观察是否出现单原核或卵裂及囊胚形成情况.结果未经玻璃化冻融处理的卵母细胞有2.96%发生孤雌发育,而经玻璃化冻融处理的卵母细胞孤雌发育率达13.50%,两者存在明显差异.(P<0.05),但均未见囊胚形成.结论玻璃化冷冻可诱发卵母细胞发生孤雌发育,但这些孤雌发育的胚胎难以发育到囊胚阶段.     

两种玻璃化冻融方案对人成熟期卵母细胞的冷冻效果比较

目的 探讨两种玻璃化冻融方案对人成熟期(MⅡ期)卵母细胞纺锤体、染色体的损伤程度.方法 收集体外受精胚胎移植(IVF-ET)中受精失败MⅡ卵母细胞,分别用A法(实验组A,胎牛血清配方+梯度平衡方案)以及B法(实验组B,重组白蛋白血清方案)冻融,对照组为未冷冻卵母细胞.解冻后存活卵母细胞及对照组卵母细胞固定后进行免疫荧光染色,之后用激光扫描共聚焦显微镜观察纺锤体、染色体形态.结果 实验组A、B的存活率分别为95.8%(23/24)、96.7%(29/30),差异无统计学意义(P>0.05).实验组A的纺锤体和染色体形态正常率为13%(3/23)和13%(3/23)与对照组[18.2%(6/33)、18.2%(6/33)]差异无统计学意义(P>0.05).实验组B的纺锤体和染色体正常率为0%(0/29)和0%(0/29)与对照组差异有统计学意义(P<0.05).A组纺锤体缺失率(Ⅳ型)为65.3%(15/23),与对照组39.4%(13/33)差异无统计学意义(P>0.05).B组纺锤体缺失率(Ⅳ型)为79.3%(23/29),与对照组39.4%(13/33)差异有统计学意义(P<0.01).结论 玻璃化冻融方案A对人MⅡ期卵母细胞的纺锤体、染色体损伤程度较小.     

未成熟卵母细胞冷存的研究进展

未成熟卵母细胞冷存为部分不孕患者保存生育能力提供了一条途径,具有广阔的前景。本文就与其研究状况,及与其冷存效果密切相关的生物学特点,玻璃化冷冻方法,及未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)技术等方面作一综述。     

玻璃化冷冻技术在卵母细胞冻存上的应用

玻璃化冷冻保存技术由于具有操作简便、冻融损伤小并且不需要仪器精密控温的特点,已经成为最具应用前景的冷冻保存技术。玻璃化冷冻受到冷冻保护剂成分、浓度、作用时间、作用温度以及降温速率的影响。卵母细胞由于其特殊的细胞学特性,冷冻保存相对困难。玻璃化冻存技术应用于卵母细胞的冷冻保存能获得较好的存活率、受精率以及卵裂率。但是,经过玻璃化冻融的卵母细胞受精后囊胚形成率还不理想,高浓度的冷冻保护剂是否具有细胞毒性,是否会影响胚胎发育等问题尚待解答。因此,还需要更深入的研究来改善卵母细胞的玻璃化冷冻保存技术。     

小鼠卵巢组织玻璃化冷冻的初步研究

目的建立一种有效的卵巢组织玻璃化冷冻方法。方法采用乙二醇和蔗糖两步法、小鼠卵巢组织经5m in、10m in、15m in 3种不同的预平衡时间处理,在玻璃化溶液中暴露相同的时间后直接投入液氮进行玻璃化冷冻。复苏后与新鲜的卵巢组织均进行HE染色、提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳。结果玻璃化冷冻复苏后,预平衡时间为10m in的实验组小鼠卵巢组织中的卵泡保持了较好的形态结构。提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,各实验组与新鲜对照组的结果相似。结论采用乙二醇和蔗糖两步法、预平衡为10m in、直接投入液氮的玻璃化冷冻方法可能是一种有效的卵巢组织片冷冻保存方法。该玻璃化冷冻方法没有造成细胞DNA的损伤。     

不同玻璃化冷冻方案对小鼠卵巢组织的影响

目的比较不同组合的冷冻保护剂对小鼠卵巢组织的影响,为人类卵巢组织玻璃化冷冻的保护剂选择提供实验依据。方法将20只小鼠的卵巢进行玻璃化冷冻,组织标本随机分为4组,新鲜的和冻融后的卵巢皮质分别进行光学显微镜观察、TUNEL实验和免疫组织化学分析。结果光镜观察发现各实验组的各级卵泡形态正常率均明显低于对照组,B组的始基卵泡形态正常率和初级卵泡形态正常率均高于A组和C组,差异有统计学意义（P〈0．05）。A组和C组冻融后卵泡凋亡率、卵母细胞凋亡率和颗粒细胞凋亡率均高于B组,有统计学差异（P〈0．05）。另外,B组卵泡Bax蛋白阳性表达率低于A组和C组,而B组Bcl-2蛋白阳性表达率高于A组和C组,差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论实验结果提示：与其它组合相比,EG与PROH的组合更适合小鼠卵巢组织的玻璃化冷冻。     

玻璃化溶液EG5.5对小鼠未成熟卵发育能力的影响

目的研究玻璃化溶液EG5.5对未成熟卵母细胞成熟、受精和发育能力的影响.方法小鼠成熟卵母细胞经玻璃化溶液EG5.5暴露处理但不予以冷冻保存,然后行体外成熟、体外受精和胚胎培养;新鲜的未成熟卵直接行体外成熟和受精作为对照组,比较两组卵母细胞的成熟率、受精、卵裂率和囊胚形成率.结果EG5.5暴露组卵母细胞的成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率与对照组均无显著差异.结论EG5.5不影响未成熟卵的成熟、受精和进一步发育能力.     

Effects of sucrose concentration on the developmental potential of human frozen-thawed oocytes at different stages of maturity

BACKGROUND: Success of human oocyte cryopreservation depends on multiple cryobiological factors that could influence the developmental potential of the oocytes. The objective of this study was to examine the effects of different sucrose concentrations on the developmental potential of human frozen-thawed oocytes at different maturity stages. METHODS: A total of 355 oocytes collected from small follicles were randomly divided into three groups and two groups (B and C) were cryopreserved using slow-freezing method. Group A included 131 oocytes at different maturity stages without freezing. Another 119 oocytes in Group B were cryopreserved with 0.1 M sucrose and 105 oocytes in Group C with 0.2 M sucrose concentration. RESULTS: The post-thaw survival rate of the oocytes and the cleavage rate in Group C were significantly higher than that of Group B (P<0.05). For immature metaphase I (MI) stage oocytes, a significant difference was found in the maturation rate between Group C and Group B (P<0.05). The maturation rate for the GV oocytes in Groups A and C was significantly higher than Group B (P<0.01). CONCLUSIONS: The results suggested that sucrose concentration of 0.2 M in the cryoprotectant solution is more suitable for human oocyte cryopreservation.     

体外成熟卵母细胞受精方式及发育能力的影响因素

目的 探讨体外成熟卵母细胞的受精方式及影响其胚胎发育的因素.方法 收集本院2008年7月至12月因男性因素需进行卵母细胞胞浆内单精子注射术(ICSI)助孕的135对夫妇未成熟的卵母细胞(DO)354枚,置入P1培养体系中观察培养20～24、26～30、36～40 h后的成熟情况.去除了退化的成熟卵母细胞,随机分为常规体外受精(IVF)和ICSI组,比较2组的正常受精率、卵裂率、第3天优质胚胎率及各组优质胚胎和非优质胚胎的患者年龄、不孕年限、促排时间及卵母细胞体外成熟时间.结果 卵母细胞体外成熟率为82.5%(292/354),IVF组正常受精率56.5%(70/124)低于ICSI组69.9%(107/153)(P<0.05).两组卵裂率和优质胚胎率差异无统计学意义(P>0.05).2组组内优质胚胎的患者年龄、体外成熟时间均小于非优质胚胎(P<0.05);不孕年限及促排时间差异无统计学意义(P>0.05).结论 ICSI能够提高体外成熟卵母细胞的受精率.体外成熟卵母细胞具有常规受精的能力,第3天胚胎质量与ICSI相似.患者年龄和卵母细胞体外成熟时间是体外成熟卵母细胞发育能力的主要影响因素.     

人类卵母细胞减数分裂进程及形态学研究

目的对人类未成熟卵母细胞进行体外培养,观察卵母细胞直径和卵周隙随卵母细胞成熟所发生的形态学改变,并按照其染色体变化确定人类卵母细胞减数分裂进程。方法穿刺收集多囊卵巢患者未成熟卵母细胞进行体外培养成熟,分别于体外培养4、8、12、16、20、24和28h进行卵母细胞直径及最大卵周隙测量,然后行染色体形态学观察并进行分析。结果未成熟卵母细胞体外培养10h约有50％发生生发泡破裂（GVBD）恢复减数分裂;减数分裂Ⅰ（MⅠ）前中期由培养8h的31．37％上升到16h的45％,然后下降;MⅠ中期（Meta-MⅠ）在培养20h进入高峰,占到40．63％,MⅠ后、末期（Ana／tel-MⅠ）维持时问相对较短,24h后多数已进入减数分裂Ⅱ（MⅡ）成熟期,28h未成熟卵母细胞体外培养的成熟率为68．85％。另外发现随着卵母细胞的体外成熟,其直径不会发生明显改变,但卵周隙（PVS）却在逐步增加。结论按照常规的体外培养方法可大致确定人类未成熟卵母细胞的体外成熟进程,且认为卵周隙的扩大可作为卵母细胞成熟分期的另一标志。     

睾酮对小鼠卵泡体外发育的影响

目的探讨高浓度睾酮对体外培养的小鼠卵泡生长发育的影响。方法以出生后12日龄的ICR雌鼠体外培养卵泡为研究模型,将卵泡随机分为以下4个组,每组30个:正常对照组(control组)、10-4mol/L睾酮处理组、10-5mol/L睾酮处理组和10-6mol/L睾酮处理组。将卵泡随机分为以下3个组,每组30个:正常对照组(control组)、睾酮处理组(T组,T=10-5mol/L)和雄激素受体拮抗剂氟他胺预处理后再加睾酮处理组(F+T组,F=10-5mol/L,T=10-5mol/L)。在60mm无菌细胞培养皿上进行微滴培养,每天在倒置显微镜下观察卵泡轮廓,颗粒细胞增生情况,卵母细胞形态以及有无卵母细胞逸出等,并记录卵泡存活和退化的情况。结果 10-4mol/L睾酮能抑制卵泡的生长,而10-5mol/L睾酮能够促进颗粒细胞的增殖和卵泡的生长;同时,在卵泡生长前期,睾酮能刺激卵泡的发育,在后期则呈抑制作用,即卵泡发育停滞、退化或死亡。结论在初级和次级卵泡阶段,10-5mol/L睾酮能促进卵泡的发育,而在窦状卵泡阶段则抑制卵泡的发育。